아사이베리 착즙액과 추출물의 항산화 활성 및 지방세포분화 억제 효과

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아사이베리 착즙액과 추출물의 항산화 활성 및 지방세포분화 억제 효과

구율리․홍주헌 대구가톨릭대학교 식품공학전공

Antioxidant Activity and Anti-Adipogenic Effects of Acai Berry (Euterpe oleracea Mart.) Juice and Extracts

Yul Ri Gu and Joo-Heon Hong

Department of Food Science and Technology, Daegu Catholic University

ABSTRACT This study evaluated the antioxidant and anti-obesity activities of acai berry juice and extracts. The total polyphenol, total flavonoid, and total sugar contents of AHE (hot-water extract of acai berry) were 35.04 g/100 g, 26.13 g/100 g, and 36.82 g/100 g, respectively. The total anthocyanin content of AEE (70% ethanol extract of acai berry) was 141.73 mg/L. The DPPH, ABTS radical scavenging activity, and FRAP activity of AHE at 1,000 μg/mL were 59.40%, 83.10%, and 2.03 mM, respectively. The α-amylase, α-glucosidase, and lipase inhibitory activity of AHE at 1,000 μg/mL were 84.03%, 92.10%, and 31.85%, respectively. AHE had better regeneration effects against oxidative stress in L-132 cells than the other extracts. Furthermore, AHE suppressed adipocyte differentiation, lipid accumulation, and the free glycerol content, and triggered lipolysis on MDI treated 3T3-L1 preadipocytes. Thus, in addition to AHE and AEE, AJ also has antioxidant activity and inhibits adipocyte in 3T3-L1 cells, resulting in reduced lipid accumulation, reduced free glycerol release, and increased glucose uptake.

Key words: acai berry, antioxidant, anti-adipogenic, juice, extracts

Received 30 July 2020; Accepted 18 September 2020

Corresponding author: Joo-Heon Hong, Department of Food Sci- ence and Technology, Daegu Catholic University, Gyeongsan 38430, Korea, E-mail: [email protected]

Author information: Yul Ri Gu (Graduate student), Joo-Heon Hong (Professor)

서 론

생체 내에 발생하는 활성산소 등의 산화물은 반응성이 강 해서 단백질, 지질 및 핵산 등을 공격하고, 이로 인해 체내 세포와 조직에 손상을 초래하여 노화 및 암 등 질병의 원인 이 된다(Yen과 Duh, 1994). 체내에는 이러한 활성산소를 억제하기 위해 superoxide dismutase(SOD), catalase (CAT), glutathione-peroxidase(GSH-Px) 등과 같은 다 양한 항산화 효소가 존재하며(Sies, 1999), 건강한 상태일 경우 이들 효소의 기능으로 적정 수준의 ROS 농도를 유지하 지만 환경오염, 스트레스 등의 요인으로 체내 활성산소가 증가하기도 한다(Rees와 Kennett, 2008). 불균일한 ROS 농도로 인해 체내에서 발생하는 산화적 스트레스를 방지하 는 화합물을 항산화 물질(antioxidant)이라고 하며, 이러한 화합물에는 플라보노이드류, 폴리페놀류 등이 있다(Halli- well과 Gutteridge, 1999).

비만은 지방의 축적과 에너지 저장을 위한 조절 과정에서 주로 발생하게 된다. 지방세포 내에 과도한 지방의 축적은

당뇨병, 고혈압, 심혈관 질환을 포함한 만성질환을 유발하게 되는 원인으로 알려져 있다(Kopelman, 2000; Visscher와 Seidell, 2001). 이러한 비만의 예방 및 치료를 위한 방법으 로는 음식의 과잉 섭취 감소, 지방 또는 단백질 대사, 지방과 단백질의 저장에 대한 조절, 영양소 흡수의 억제, thermo- genesis 증가 등이 있다(Bray와 Tartaglia, 2000; Spiegel- man과 Flier, 2001). 지방세포분화는 세포의 형태 및 유전 자 발현의 다양한 변화가 동반되는 복합적인 과정으로 mes- enchymal precursor에서 preadipocyte를 거쳐 지방세포 로 분화되고, 분화과정 동안 형태적, 생화학적 변화를 통해 체내 지방을 축적하는데, 지방조직 세포에 특징적으로 발현 되는 유전자들의 조절 부위에 작용하는 전사인자들이 지방 세포로 분화되는 과정에서 발현된다(Gesta 등, 2007). 상기 전사인자들의 발현 증가는 지방세포분화의 직접적인 요인 이 되므로 지방세포분화 관련 전사인자의 발현 저해는 지방 세포분화 억제의 주요 지표 중 하나이다(Wu 등, 1996). 잘 알려진 대표적인 비만 치료제인 orlistat의 경우 췌장 및 위 장에서 분비되는 지방 분해 효소인 lipase의 활성을 억제하 여 섭취한 지방 중 약 30%의 흡수를 차단하여 체중 감소에 도움을 주는 것으로 알려져 있으나 그 부작용이 문제 되고 있다(Heck 등, 2000). 이에 천연 유래 소재로부터 우수한 효능과 함께 안전성이 높으며 독성 및 부작용이 없는 항비만 관련 기능성 소재를 발굴하기 위한 많은 노력이 집중되고

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있다(Kim 등, 2007).

아사이베리(Acai berry, Euterpe oleracea Mart.)는 브 라질 북부 아마존 열대 우림지역 인근에서 자라는 야자수 열매로 진한 보라색을 띠고 있어 아마존의 보랏빛 진주라고 도 불린다. 블루베리보다 약간 큰 포도와 비슷한 모양을 가 지고 있으며 열매의 80%가 씨앗으로 이루어져 있다(Pa- checo-Palencia 등, 2007). 수 세기 동안 아마존 원주민들 이 질병 치료 및 에너지 보충을 위해 애용해왔던 식품인 아 사이베리는 폴리페놀, 불포화지방산, 섬유질, 비타민 및 무 기질이 풍부하게 함유되어 있어 인체에 단백질 수치를 상승 시켜 피부 노화를 방지하는 효과가 있다(Woolery-Lloyd와 Friedman, 2009). 특히 페놀 화합물과 플라보노이드 및 안 토시아닌 등의 생리활성물질들을 다량 함유하고 있어 식품, 대체 의약 및 화장품 산업의 천연 항산화제로서 기능성 식품 과 식품 첨가제로 많은 주목을 받고 있으며 항비만, 항염증, 항암 등 질환 예방에 탁월한 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(Hogan 등, 2010).

따라서 본 연구에서는 많은 연구가 이루어진 아사이베리 추출물과 비교하여 아사이베리 착즙액의 이화학적 품질 특 성과 L-132 세포를 이용한 항산화 활성 및 3T3-L1 세포를 이용한 항비만 활성을 조사함으로써 아사이베리 착즙액을 항산화 활성 및 체지방 감소에 도움이 되는 기능성 식품 소 재로의 활용 가능성을 확인하였다.

재료 및 방법

실험재료

본 연구에 사용한 냉동 아사이베리는 AIO 인터네셔널 (Hanam, Korea)에서 제공받았으며, -70°C에서 암소에 보 관하며 추출용 시료로 사용하였다.

착즙액 및 추출물 제조

본 연구에 사용한 아사이베리 착즙액(acai berry juice;

AJ)은 냉동 아사이베리를 분쇄기(FM-909W, Hanil Co., Sejong, Korea)로 분쇄한 후 여과포로 착즙하였다. 착즙액 은 원심분리기(VS-6000CFN, Vision Scientific Co., Ltd., Bucheon, Korea)를 이용하여 4°C, 3,000 rpm에서 10분간 진행한 다음 상등액은 Whatman No. 4(Whatman Interna- tional Ltd., Maidstone, UK)를 이용하여 여과하였다. 아사 이베리 열수 추출물(hot-water extracts from acai berry;

AHE) 및 아사이베리 에탄올 추출물(70% ethanol extracts from acai berry; AEE)은 냉동 아사이베리를 동결건조하여 분말로 제조한 후 분말 10 g에 20배의 증류수 및 70% 에탄올 을 각각 가한 다음 환류냉각추출기(CA-1112, EYELA Co., Tokyo, Japan)로 100°C 및 80°C에서 4시간 추출하고 Whatman No. 4(Whatman International Ltd.)를 이용하여 여과하였다. 여과된 AJ, AHE 및 AEE는 감압농축기(Model N-1N, EYELA Co.)로 농축한 후 동결건조기(Free Zone

2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70°C 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.

추출 수율

아사이베리 착즙액 및 추출물의 수율은 동결건조(Free Zone 2.5, Labconco Co.)한 후 건물 중량을 구하였고, 시료 조제에 사용한 원료 건물 중량에 대한 백분율로 나타내었다.

총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 당 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(Singleton과 Rossi, 1965)에 따라 시료 1 mL에 1 N Folin Ciocalteu reagent 1 mL를 첨가하고 충분히 혼합한 다음 20% Na2CO3 1 mL를 첨가하여 실온의 암소에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계 (Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 tannic acid(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(1999)의 방법을 응 용하여 측정하였다. 시료 1 mL에 5% NaNO2 0.15 mL를 혼합하여 실온에서 6분간 반응시킨 후 10% AlCl₃ 0.3 mL와 혼합하여 실온에서 5분간 반응시키고, 1 N NaOH 1 mL와 혼합한 다음 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플 라보노이드 함량은 rutin(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였다.

총 당 함량은 phenol-sulfuric acid 방법(Dubois 등, 1956)을 응용하여 측정하였다. 시료 1 mL와 5% phenol 1 mL 및 진한 H₂SO₄ 5 mL를 혼합하여 20분간 반응시킨 후, 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이 용하여 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 당 함량은 glucose(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 작성한 표준곡선 으로부터 계산하였다.

총 안토시아닌 함량

총 안토시아닌 함량은 Lee 등(2005)의 방법에 따라 시료 0.1 g에 pH 1.0 buffer(0.2 M potassium chloride＋0.2 M hydrochloric acid) 및 pH 4.5 buffer(0.2 M potassium phosphate＋0.1 M citric acid) 2 mL를 각각 혼합한 다음 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하 여 520 nm와 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 안토시 아닌 함량은 아래와 같이 cyanidin-3-glucoside를 기준으 로 계산하였다.

Total anthocyanin content

(mg/100 g) ＝ A×MW×DF×1,000 ε×1 A＝(A_λ520－A_λ700)_pH1.0－(A_λ520－A_λ700)_pH4.5

MW＝molecular weitht of cyanidin-3-glucoside＝

449.2 g/mol

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DF＝dilution factor

ε＝the molar absorptivity=26,000 L/cm･mol

DPPH 라디칼 소거 활성

1,1-Diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활 성은 DPPH의 환원력을 이용하여 측정하였다(Blois, 1958).

DPPH reagent는 DPPH 12 mg을 absolute ethanol 100 mL에 용해한 후 증류수 100 mL를 첨가하여 흡광도를 517 nm에서 약 1.5로 조정해 제조하였다. 시료 0.5 mL에 DPPH reagent 5 mL를 혼합하여 실온에서 15분간 반응시킨 후 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)로 흡광도 를 측정하고 아래와 같이 계산하였다.

DPPH radical scavenging activity (%)＝

(

^1－ ^Sampleabsorbance 517 nm

)

^×100

Controlabsorbance 517 nm

ABTS 라디칼 소거 활성

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디칼 소거 활성(Re 등, 1999)은 7.4 mM ABTS(Sigma-Aldrich Co.)와 2.45 mM potassium per- sulfate를 최종 농도로 혼합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS⁺를 형성시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70±0.02가 되게 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 희석하였다. 희석된 용액 180 µL에 시료 20 µL를 혼합하여 10분간 반응시킨 다음 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 732 nm에서 흡광도 를 측정하였다. ABTS 라디칼 소거 활성은 추출물의 첨가 전과 후의 차이를 아래와 같이 계산하였다.

ABTS radical scavenging activity (%)＝

(

^1－ ^Sampleabsorbance 732 nm

)

^×100

Controlabsorbance 732 nm

Ferric reducing antioxidant power (FRAP) 활성 FRAP는 Benzie와 Strain의 방법(1996)에 따라 다음과 같이 측정하였다. FRAP reagent는 25 mL acetate buffer (300 mM, pH 3.6)를 37°C에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ;

Sigma-Aldrich Co.) 2.5 mL와 20 mM ferric chloride (FeCl3) 2.5 mL를 첨가하여 제조하였다. 시료 30 µL에 제조 된 FRAP reagent 900 µL와 증류수 90 µL를 넣은 후 37°C 에서 10분간 반응시킨 다음 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co., Eugendorf, Austria)를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP는 FeSO₄･7H₂O(Sigma-Al- drich Co.)을 정량하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하였 다.

α-Amylase 저해 활성

α-Amylase 저해 활성은 porcine pancreatin 유래의 α-

amylase(Sigma-Aldrich Co.)를 이용하여 starch를 기질 로 하여 측정하였다(Ali 등, 2006). 시료 40 µL에 1 unit/mL α-amylase 효소액 100 µL, 1% starch 100 µL를 넣어 20°C에서 3분간 반응시켰다. 그 후 96 mM DNS(3,5-dini- trosalicylic acid, sodium potassium tartrate in 2 M NaOH) 발색시약 100 µL를 첨가하였다. 반응액을 90°C에서 15분 동안 가열하여 충분히 냉각시킨 후, 900 µL 증류수를 가하여 교반한 다음 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co.) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, α-amylase 저해 활성은 아래와 같이 계산하였다.

α-Amylase inhibition activity (%)＝

(

^1－ Sample－Sample blank

)

^×100

Control

Sample: absorbance at 540 nm determined with the sample

Sample blank: absorbance at 540 nm determined with the sample blank

Control: absorbance at 540 nm determined with the negative control

α-Glucosidase 저해 활성

α-Glucosidase 저해 활성은 Watanabe 등(1997)의 방법 에 따라 측정하였다. 시료 500 µL와 α-glucosidase 0.2 U/mL 50 µL, 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 50 µL와 혼합한 후 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 3 mM pNPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside) 50 µL를 첨 가하여 37°C에서 20분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 0.1 M NaOH 500 µL를 첨가하여 반응을 정지시킨 후 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 405 nm에서 흡 광도를 측정하였으며, α-glucosidase 저해 활성은 아래와 같이 계산하였다.

α-Glucosidase inhibition activity (%)＝

(

)

^×100

Control

Lipase 저해 활성

Lipase 저해 활성은 Kim 등(2009)의 방법에 따라 측정하 였다. Porcine pancreatic lipase 0.3 mg과 10 mM MOPS, 1 mM EDTA(pH 6.8) 30 µL를 넣고 100 mM Tris-HCl과 5 mM CaCl2(pH 7.0) 850 µL를 첨가하여 enzyme buffer를

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준비하였다. Enzyme buffer에 시료 100 µL를 첨가하여 37

°C에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 10 mM p-nitrophenyl butyrate 20 µL를 첨가하여 혼합시킨 후 다시 37°C에서 15분간 반응시켰다. p-Nitrophenyl butyrate가 p-nitro- phenol로 가수분해된 정도를 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 400 nm에서 흡광도를 측정하였으 며 lipase 저해 활성은 아래와 같이 계산하였다.

Lipase inhibition activity (%)＝

(

)

^×100

Control

세포배양과 분화

인간 폐상피세포주인 L-132 세포는 한국세포주은행 (Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA)과 1%

penicillin-streptomysin(Gibco BRL Co.)이 함유된 DMEM (Welgene Inc., Daegu, Korea) 배지를 이용하여 37°C, 5%

CO₂의 조건에서 배양하였다.

지방 전구세포주인 3T3-L1 세포는 한국세포주은행에서 분양받았으며, 10% bovine calf serum(BCS; Welgene Inc.)과 1% penicillin-streptomysin이 함유된 DMEM 배지 를 이용하여 37°C, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 세포의 분화는 2.5×10⁴ cells/well의 농도로 24-well plate에 세포 를 분주한 후, 100% confluent한 상태가 되도록 배양하였 다. 2일 후 10% FBS와 1% penicillin-streptomysin 및 분 화유도물질 MDI(0.5 mM IBMX, 1 µM DEX, 10 µg/mL insulin; Sigma-Aldrich Co.)가 첨가된 DMEM 배지를 처리 하고, 그 후 10% FBS와 10 µg/mL insulin(Sigma-Aldrich Co.)만을 포함한 DMEM 배지로 교체하여 지방세포분화를 유도하였다. 시료의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리하였다.

세포독성

L-132 및 3T3-L1 세포의 세포독성은 MTT assay(Ishi- yama 등, 1996)로 측정하였다. 배양된 세포를 각각 1×10⁴ cells/well의 농도로 조정해 96-well plate에 100 μL씩 첨 가하여 37°C, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하고 이후 새 로운 배지에 시료를 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배 양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 5 mg/mL의 meth- ylthiazol-2-YL-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT;

Sigma-Aldrich Co.) 용액을 각 well에 10 μL씩 첨가하고

다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 완전히 제거하고 dimethyl sulfoxide(DMSO; Jun- sei Chemical Co., Tokyo, Japan) 100 µL를 각 well에 첨 가하여 10분간 반응시켜 formazan 결정을 완전히 용해한 다음 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 흡 광도 540 nm에서 측정하였다.

산화적 손상에 대한 세포재생 효과

L-132 세포를 이용한 세포재생 효과는 Hwang(2003)의 방법을 응용하여 측정하였다. 배양된 L-132 세포를 1×10⁴ cells/well의 농도로 96-well plate에 100 µL씩 첨가하여 24시간 배양하고, 새로운 배지로 교환한 다음 10 mM H₂O₂ (Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Seoul, Korea)를 처리 하고 12시간 동안 배양 후에 시료를 농도별로 처리하여 12 시간 동안 다시 배양하였다. 배양 완료 후 PBS 완충용액에 녹인 5 mg/mL MTT(Sigma-Aldrich Co.) 용액을 각 well 에 10 µL씩 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 완전히 제거하고 DMSO 100 µL를 각 well에 첨가하여 10분간 반응시켜 formazan 결정을 완전히 용해한 다음 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 흡광도 540 nm에서 측정하였다.

Oil Red O 염색

지방세포분화 시 나타나는 중성지방 축적 저해를 확인하 기 위해 3T3-L1 세포의 분화유도 시 추출물을 농도별로 처 리하였다. 배지를 제거한 후 PBS(Welgene Inc.)로 세척하 고 10% formalin(Duksan Pure Chemicals Co., Ltd.)을 처 리하여 상온에서 5분간 고정시켰다. PBS와 60% isopropanol(Duksan Pure Chemicals Co., Ltd.)로 세척한 후 세 포들을 완전히 건조하고, Oil Red O solution(Sigma-Al- drich Co.)을 상온에서 1시간 동안 암소에 방치하여 세포 안에 축적된 지방구들을 염색하였다. 현미경을 사용하여 염 색된 세포를 관찰한 후, 100% isopropanol을 이용하여 세 포 내 염색된 Oil Red O를 용출시켜 510 nm에서 흡광도를 측정하여 지방 축적을 확인하였다.

Free glycerol 함량

지방세포의 분화과정에서 glycerol 방출량에 미치는 영 향은 glycerol phosphate oxidase-TRINDER 효소 반응법 (Trinder, 1969)을 적용한 free glycerol reagent를 이용하 여 배양액 내 glycerol 함량을 측정하였다. 지방세포의 분화 과정에서 free glycerol을 측정하기 위해 분화 후기(8일째) 에 배양액을 모아 사용하였다. Free glycerol reagent 50 µL와 배양액 50 µL를 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 다음 ELISA reader(UVM-340, ASYS Co.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, glycerol 함량은 free glycerol을 표준시약으로 작성한 표준곡선을 사용하여 측 정하였다.

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Table 1. The yield, total phenolic, total flavonoid, total sugar, and total anthocyanin contents of acai berry juice and extracts Sample¹⁾ Yield

(Dry basis, %) Total polyphenol

(TA²⁾, g/100 g) Total flavonoid

(Rutin, g/100 g) Total sugar

(Glucose, g/100 g) Total anthocyanin (C3G³⁾, mg/L) AJ

AHE AEE

13.07±0.52^c4) 27.29±0.47^b 31.50±1.73^a

9.31±0.28^c 35.04±1.30^a 31.80±0.30^b

9.30±1.36^c 26.13±0.45^a 22.13±0.52^b

12.58±1.50^b 36.82±1.26^a 14.00±0.97^b

26.54±0.34^c 59.38±1.60^b 141.73±1.07^a

1)AJ, acai berry juice; AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry.

2)TA, tannic acid.

3)C3G, cyanidin-3-glucoside.

4)Means±SD (n=3) with different letters (a-c) in the same column are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Glucose uptake assay

3T3-L1 preadipocyte가 80% confluence 되었을 때 2.0×10⁴ cells/well의 농도로 96-well plate에 100 µL씩 첨가하여 배양하였다. Confluence 된 다음 2일 뒤 분화유도 배지로 교체하여 adipocyte로 분화를 유도하였고, 유도된 다음 2일 뒤 10% FBS와 10 µg/mL insulin을 포함한 배지로 2일간 배양한 다음 adipocyte로 분화할 때까지 2일마다 10% FBS가 포함된 배지로 교체해주었다. 분화가 완료되면 glucose free 배지로 교체하여 16시간 배양한 다음 2% BSA 가 포함된 100 µL KRPH buffer로 40분간 배양하여 star- vation 하였다. 시료 또는 1 µM insulin을 처리하여 30분간 배양한 다음, 10 mM 2-deoxyglucose를 처리한 후 20분간 배양하여 분석용 시료를 준비하였다. 포도당 흡수는 glucose uptake assay kit(Abcam, Cambrige, UK)을 이용하 여 측정하였다(Fakhoury 등, 2018).

통계처리

모든 실험결과는 IBM SPSS Statistics(ver. 19.0, IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용한 분산분석(ANOVA)을 실시하였고 각 측정 평균값의 유의성(P<0.05)은 Duncan’s multiple range test를 실시하여 검정하였다.

결과 및 고찰

이화학적 품질 특성

아사이베리 착즙액과 추출물의 이화학적 품질 특성은 Ta- ble 1과 같다. 추출 수율은 아사이베리 착즙액(AJ), 아사이 베리 열수 추출물(AHE) 및 아사이베리 에탄올 추출물(AEE) 에서 각각 13.07±0.52%, 27.29±0.47% 및 31.50±1.73%

로 AEE에서 가장 높은 추출 수율을 나타내었다. 총 폴리페 놀 및 총 플라보노이드 함량은 각각 9.31~35.04 g/100 g 및 9.30~26.13 g/100 g으로 AHE에서 가장 높은 함량을 나타내었다. Huang 등(2012)의 연구에서 베리류에는 stil- bene 계열의 resveratrol을 비롯하여 tannins, ellagitan- nins, quercetin, gallic acid, anthocyanins, cyanidins와 같은 페놀성 화합물이 풍부하여 페놀 화합물에 의한 항산화 활성이 우수하다고 보고하였다.

총 당 함량은 12.58~36.82 g/100 g으로 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량과 같이 AHE(35.04±1.30 g/100 g,

26.13±0.45 g/100 g)에서 가장 높은 함량을 나타내었다.

Jang 등(2006)의 연구에 따르면 아사이베리의 당 함량 중 sucrose의 함량이 높다고 보고하여 본 연구의 총 당 함량 결과는 sucrose에 의한 것으로 사료된다.

총 안토시아닌 함량은 26.54~141.73 mg/L로 나타났으 며 AEE(141.73±1.07 mg/L)에서 가장 높은 함량을 나타내 었다. 안토시아닌은 적색과 자색 등의 색을 나타내는 과일이 나 베리류에 있는 수용성 천연 색소로 노화방지, 항암, 시력 개선 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Solomon 등, 2006). Chung(2016)의 연구에서 마키베리, 아로니아 및 블 랙커런트의 총 안토시아닌 함량이 각각 12.82, 9.52 및 8.95 mg/L로 나타나 본 연구와 비교했을 때 아사이베리의 총 안 토시아닌 함량이 다른 베리류에 비해 높았음을 확인하였다.

항산화 활성 및 효소 저해 활성

아사이베리 착즙액과 추출물의 항산화 활성은 Table 2와 같다. 항산화 활성은 시료 농도 100~1,000 µg/mL로 실험 하였고, 농도가 증가함에 따라 항산화 활성 또한 증가하는 경향을 나타내었다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성은 각 각 4.84~84.34% 및 8.82~72.59%로 1,000 µg/mL 농도에 서 AHE(84.34±0.64%, 72.59±1.38%)가 가장 높은 라디 칼 소거 활성을 나타내었고, FRAP 활성은 0.04~2.03 mM 로 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성과 같이 AHE(2.03±

0.08 mM)가 가장 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 항산 화 활성 실험 모두 시료 농도 1,000 µg/mL에서 AHE의 항산 화 활성이 가장 우수하게 나타났으며, 이는 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량과 유사한 경향을 나타내었다. Lim 등 (2015)의 연구에서 아사이베리 70% 에탄올 추출물의 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성은 500 µg/mL 농도에서 각각 59.40% 및 83.10%로 나타나 본 연구의 DPPH 라디칼 소거 활성과 유사하게 나타났으나 ABTS 라디칼 소거 활성은 더 우수함을 확인하였다. 또한 Carlsen 등(2010)의 연구에서 119가지 베리류의 FRAP 측정 평균이 0.99 mM로 보고된 결과와 비교했을 때, 아사이베리의 FRAP 활성은 다른 베리 류에 비해 우수한 것으로 나타났다.

아사이베리 착즙액과 추출물의 효소 저해 활성은 Fig. 1 과 같다. α-Amylase 및 α-glucosidase 저해 활성은 각각 53.87~84.03%, 54.80~92.10%로 나타났으며, 1,000 µg/

mL 농도에서 AHE(84.03±1.44%, 92.10±1.67%)가 가장

(6)

Table 2. DPPH radical scavenging activity, ABTS radical scavenging activity, and FRAP activity of acai berry juice and extracts Sample¹⁾ Concentration

(µg/mL)

Radical scavenging activity

FRAP (mM) DPPH (%) ABTS (%)

Positive control (ascorbic acid) 250 93.27±0.04â2) 100.09±0.65â 2.78±0.09â

AJ

100 250 500 1,000

4.84±0.69^j 10.39±1.98ⁱ 18.74±2.84^g 33.32±1.06^f

8.82±0.49ⁱ 13.02±0.85^h 17.19±0.37^g 23.30±0.42^f

0.04±0.00ⁱ 0.11±0.00ⁱ 0.24±0.05^h 0.38±0.07^g

AHE

100 250 500 1,000

17.75±1.09^gh 38.68±0.69^e 55.19±2.94^d 84.34±0.64^b

16.38±0.71^g 30.86±1.35^e 46.96±0.56^d 72.59±1.38^b

0.23±0.00^h 0.65±0.08^f 1.04±0.03^e 2.03±0.08^b

AEE

100 250 500 1,000

15.56±0.50^h 31.74±1.32^f 54.31±0.49^d 76.07±0.58^c

16.25±0.78^g 34.27±0.22^e 46.87±2.71^d 67.95±1.26^c

0.25±0.00^h 0.61±0.01^f 1.33±0.04^d 1.91±0.05^c

1)AJ, acai berry juice; AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry.

2)Means±SD (n=3) with different letters (a-j) in the same item are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

de e h

cd e g

a

de b

fg

c b

f

0 20 40 60 80 100 120

Acarbose (500 µg/mL)

AJ AHE AEE

α-Amylase inhibitory activity (%) . ^{100 µg/mL} ^{250 µg/mL} ^{500 µg/mL} 1,000 µg/mL

A

ef ef g

d f ef

a

bc c e

bc b

d

0 20 40 60 80 100 120

Acarbose (500 µg/mL)

AJ AHE AEE

α-Glucosidase inhibitory activity (%) . 100 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1,000 µg/mL

B

i i

high ef fg

a

de ef

de b cd

c

0 20 40 60 80 100

Orlistat (400 µg/mL)

AJ AHE AEE

Lipase inhibitory activity (%) . ^100µg/mL ^250µg/mL ^500µg/mL ^1,000µg/mL

C

Fig. 1. α-Amylase (A), α-glucosidase (B), and lipase inhibitory activity (C) of acai berry juice and extracts. AJ, acai berry juice;

AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry. Means±SD (n=3) with different letters (a-i) above bars are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

높은 효소 저해 활성을 나타내었다. Boath 등(2012)의 연구 에서 베리류의 폴리페놀은 α-amylase 및 α-glucosidase 활성을 억제하기 때문에 전분 소화를 조절할 가능성이 있다 고 보고하였으며, McDougall 등(2005)의 연구에서도 블랙 베리 추출물 또한 α-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성 이 있다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다.

Lipase 저해 활성은 16.70~31.85%로 나타났으며, 이는 α-amylase 및 α-glucosidase 저해 활성과 같이 1,000 µg/

mL 농도에서 AHE(31.85±2.50%)가 가장 높은 효소 저해 활성을 나타내었다. McDougall 등(2008)의 연구에서 베리 류의 체중 증가 및 체지방 축적 억제 효과를 확인하였고 베 리류의 폴리페놀은 췌장의 lipase 활성을 억제한다고 보고 하였다.

L-132 세포독성 및 산화적 손상에 대한 세포재생 효과 아사이베리 착즙액과 추출물의 세포독성을 확인하기 위

(7)

cd ef

efcd ef ef

a

de ef

deab bc ef

0 20 40 60 80 100 120

Control (DW)

AJ AHE AEE

Relative cell viability (% control) . ^{100 µg/mL} ^{250 µg/mL} ^{500 µg/mL} 1,000 µg/mL

A

b b b

de cd c

a

i

ef gh

de

fg h

fg

0 20 40 60 80 100 120

Control- (DW)

Control+

(DW)

AJ AHE AEE

Lipid accumulation (% of control) . ^{100 µg/mL} ^{250 µg/mL} ^{500 µg/mL} 1,000 µg/mL

B

Fig. 3. Relative cell viability (A) and lipid accumulation (B) in 3T3-L1 cell line of acai berry juice and extracts. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing MDI (0.5 mM IBMX, 1 μM DEX and 10 µg/mL insulin). Following 8 day differentiation, differentiated adipocytes were fixed and stained with Oil Red O in order to visualize lipid droplets. AJ, acai berry juice; AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry. Means±SD (n=3) with different letters (a-i) above bars are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

cd ef

efcd ef ef

a

de ef

deab bc ef

0 20 40 60 80 100 120

Control (DW)

AJ AHE AEE

A

hi

de fg

a

i gh hi

cd gh ef

bc de

fg ab

cd

0 20 40 60 80 100 120

Control (DW)

H₂O₂ (10 mM)

Ascorbic acid (100 µg/mL)

AJ AHE AEE

H2O2

(10 mM)

B

Fig. 2. Relative cell viability (A) and protective effects on cell viability against H2O2 (10 mM) induced oxidative damagein (B) in L-132 cell line of acai berry juice and extracts. AJ, acai berry juice; AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry. Means±SD (n=3) with different letters (a-i) above bars are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

해 농도별(100~1,000 µg/mL)로 측정한 결과, 세포독성이 없음을 확인하였다(Fig. 2A). Singlet oxygen(¹O₂)은 반응 성이 매우 큰 활성산소종으로 광증감 반응의 주 생성물이다.

1O2를 포함한 ROS는 세포막 구성 성분인 인지질을 산화시 켜 지질 과산화 반응을 개시한다. 이러한 자동산화반응에 의해 세포막이 손상되고 세포는 파괴된다. 따라서 L-132 세 포를 이용한 산화적 손상에 대한 시료 내 항산화제의 세포재 생 효과를 측정할 수 있다(Yoo 등, 2015; Xuan 등, 2016).

그 결과 모든 시료에서 10 mM H2O2 첨가구(58.99±0.17

%)와 비교하여 시료 농도가 증가함에 따라 활성이 유의적으 로 증가함을 확인하였다. 1,000 µg/mL 농도에서 AJ, AHE 및 AEE가 각각 70.52±1.74%, 93.93±0.74% 및 83.17±

2.05%로 AHE가 가장 우수한 세포재생 효과를 나타냈으며 AEE, AJ 순으로 나타났다(Fig. 2B). 이는 항산화 활성 분석 결과와 유사하게 나타났는데, 이러한 결과는 아사이베리 착 즙액과 추출물 모두 라디칼 소거 활성뿐만 아니라 세포재생

효과 또한 우수할 것으로 사료된다.

3T3-L1 세포독성 및 Oil Red O 염색

아사이베리 착즙액과 추출물의 세포독성을 확인하기 위 해 농도별(100~1,000 µg/mL)로 측정한 결과, 세포독성이 없음을 확인하였다(Fig. 3A). 아사이베리 착즙액과 추출물 이 3T3-L1 세포가 지방 전구세포에서 지방세포로의 분화 과정에 작용하여 지방구의 생성을 억제하는지 확인하기 위 해 Oil Red O 염색 시약을 이용하여 3T3-L1 세포 내에 생성된 지방구 염색을 수행한 후 시료 간의 차이를 비교한 결과, 분화유도 세포(control+, 100%)를 기준으로 분화유 도 하지 않은 세포(control-)에서 51.37±0.01%, 시료처리 세포에서는 58.08~93.44%로 나타났다. 시료의 농도가 증 가함에 따라 염색된 지방구가 감소하는 경향을 나타냈으며, 1,000 µg/mL 농도에서 AHE는 58.08±0.81%로 가장 낮은 중성지방 함량을 나타내 control-와 유사한 결과를 나타내

(8)

de de b

fg ef bc

a

gh

ef fg

bc

fg h

cd

0 20 40 60 80 100 120

Control- (DW)

Control+

(DW)

AJ AHE AEE

Free glycerol (% of control) .

100 µg/mL 250 µg/mL 500 µg/mL 1,000 µg/mL

MDI(+)

A

ef f g i i

j

e ef ef ef f

hi a

f

c b c e d

h 0

20 40 60 80 100 120

Control-Contrrol+ AJ AHE AEE AJ AHE AEE

Glucose uptake (% of control+) . ^{250 µg/mL} ^{500 µg/mL} 1,000 µg/mL

Insulin - - - - - + + +

B

Control- Control+

Fig. 5. The free glycerol release in culture medium (A) and glucose uptake (B) in 3T3-L1 cell line of acai berry juice and extracts.

AJ, acai berry juice; AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry. Means±SD (n=3) with different letters (a-j) above bars are significantly different by Duncan’s multiple range test (P<0.05).

Control-

(preadipocyte) Control+

(adipocyte)

AJ AHE AEE

500 µg/mL

Fig. 4. Oil Red O staining of neutral lipids in acai berry juice and extracts treated 3T3-L1. Cell were differentiated with medium containing adipogenic cocktail for 6 days. After 6 days while acai berry juice and extracts treated 3T3-L1 at intervals of 2 days.

Oil Red O staining was performed at 8 day. AJ, acai berry juice; AHE, hot-water extracts from acai berry; AEE, 70% ethanol extracts from acai berry.

었다. AJ 및 AEE는 각각 66.77±2.19%, 66.84±0.91%의 중성지방 함량을 나타내었다(Fig. 3B).

Fig. 4는 염색된 지방구를 현미경으로 관찰하여 나타낸 것으로 분화유도 세포(control+)와 비교하여 시료처리 세 포에서 지방구의 염색율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

3T3-L1 세포에서 lipid accumulation 함량은 지방세포의 지방 축적을 비교 평가하는 가장 일반적인 방법으로 항비만 활성과 관련하여 보고된 소재들을 대상으로 한 연구에서 소 재를 처리하지 않은 군과 비교 시 항비만 활성을 갖는 소재 들은 adipogenesis 과정에서 lipid accumulation의 감소에 효과가 나타나는 것으로 제시되고 있다(Lee 등, 2010). 따 라서 본 연구의 AHE가 3T3-L1 지방세포의 adipogenesis 과정에 작용하여 지방세포 내 lipid accumulation을 억제하 는 것을 확인할 수 있었다.

3T3-L1 세포 내 free glycerol 함량 및 glucose uptake 지방세포 내 축적된 지방구에 존재하는 triglyceride (TG)가 분해되면 glycerol과 지방산으로 나누어지는데 인 체의 경우 glycerol은 세포 외 혈액으로 유리되어 간으로 이송하게 된다(Liu 등, 2001). 이처럼 3T3-L1 지방세포에

서는 free glycerol 함량이 지방구 내 TG 분해 정도를 간접 적으로 나타내는 척도가 된다. 본 연구에서 아사이베리 착즙 액과 추출물을 처리한 결과 시료 농도가 증가함에 따라 free glycerol 함량은 감소하였고 분화유도 세포(control+, 100

%) 기준으로 분화유도 하지 않은 세포(control-)는 38.99±

0.03%로 나타났으며, 1,000 µg/mL 농도에서 AJ, AHE 및 AEE는 각각 65.46±0.00%, 34.86±0.02% 및 52.07±0.05

%로 AHE에서 분화유도 하지 않은 세포(control-)보다 낮 은 free glycerol 함량을 나타내었다(Fig. 5A). 이러한 결과 는 adipogenesis 초기 단계부터 시료를 처리하여 adipogenesis 마지막 단계에서 배양액 중 free glycerol 함량을 비교한 것으로 지방구 생성 감소, 지방세포의 지방구 내 TG 함량 감소와 같이 배양액으로 유출되는 free glycerol 함량 이 감소한 것으로 보인다(Yoo와 Jun, 2012).

최근 제2형 당뇨병의 새로운 치료제로 등장한 것이 소량 의 인슐린으로 혈당을 정상화하는 데 도움을 주는 인슐린 민감성 물질이다. 이러한 인슐린 민감성 물질은 지방세포의 분화를 억제하여 당뇨병뿐 아니라 인슐린 저항성 증후군의 증세를 완화할 수 있을 것으로 사료된다. 결국 인슐린 저항 성을 완화한다는 것은 인슐린이 인슐린 수용체와 결합한 후

(9)

세포 내에서 일어나는 신호전달체계가 원활하게 일어날 수 있도록 도와주어 세포에서 포도당의 이용을 향상시키는 것 이다(DeFronzo 등, 1992). 아사이베리 착즙액과 추출물을 농도별 처리에 의한 3T3-L1 세포에서의 포도당 소비 촉진 효과를 알아보기 위해 glucose uptake assay를 진행하였 다. 분화유도 세포(control+, 100%) 기준으로 분화유도 하 지 않은 세포(control-)가 34.83±0.38%로 나타났고, 인슐린 무처리군 및 인슐린 처리군이 각각 2.91~53.12% 및 21.33

~85.86%로 나타났으며 AHE(53.12±1.70% 및 85.86±

0.58%)에서 가장 높은 포도당 흡수능을 나타내었다. 또한, 인슐린 무처리군 및 인슐린 처리군 모두 시료 농도가 증가함 에 따라 포도당 흡수능이 증가하였으며, 인슐린 무처리군보 다 인슐린 처리군에서 더 높은 포도당 흡수능을 보였다(Fig.

5B). 3T3-L1 세포는 인슐린을 처리하면 세포막에 인슐린 이 결합하고 이것은 일련의 인슐린 신호전달체계인 insulin receptor substrate-1(IRS1)-phostphatidyl inosotol-3- phoshate(PI3kinase)-Akt의 과정을 증폭시킨다. 이 결과 로 glucose transport 4(GLUT4)가 세포막으로 translo- cation 되는 것이 증가하게 되어 포도당의 흡수를 증가시키 므로 지방세포분화와 포도당 흡수능은 서로 연관이 있는 것 으로 사료된다(Huo 등, 2003).

요 약

본 연구는 아사이베리 착즙액과 추출물의 항산화 활성 및 지방세포분화 억제 효과를 확인하기 위해 이화학적 품질 특 성, 항산화 활성, L-132 및 3T3-L1 세포를 이용한 생리활 성을 조사하였다. 아사이베리 착즙액과 추출물의 총 폴리페 놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 총 안토시아닌 함량은 각각 9.31~35.04 g/100 g, 9.30~26.13 g/100 g, 12.58~36.82 g/100 g 및 26.54~141.73 mg/L로 나타났으며, 총 폴리페 놀, 총 플라보노이드 및 총 당 함량은 아사이베리 열수 추출 물에서 가장 높은 함량을 나타냈고 총 안토시아닌 함량은 아사이베리 에탄올 추출물에서 가장 높은 함량을 나타내었 다. 항산화 활성 및 효소 저해 활성은 모두 1,000 µg/mL 농도에서 아사이베리 열수 추출물이 가장 우수하게 나타났 으며, L-132 세포를 이용한 산화적 손상에 대한 세포재생 효과는 아사이베리 열수 추출물(1,000 µg/mL)에서 93.93

±0.74%로 가장 우수한 세포재생 효과를 확인하였다. 3T3- L1 세포를 이용한 중성지방 함량 및 free glycerol 함량 또 한 아사이베리 열수 추출물(1,000 µg/mL)에서 각각 58.08

±0.81%, 34.86±0.02%로 가장 낮은 지방구 염색 및 free glycerol 함량을 확인하였다. 3T3-L1 세포 내 포도당 흡수 능은 인슐린 무처리군보다 인슐린 처리군에서 더 높은 포도 당 흡수능을 나타냈고, 인슐린 처리군 중 아사이베리 열수 추출물(1,000 µg/mL)에서 85.86±0.58%로 가장 높은 포도 당 흡수능을 나타냈다. 따라서 아사이베리 착즙액 및 추출물 의 다양한 세포 내 기전을 통해 항산화 활성 및 지방세포분

화 억제 효과가 있음을 확인하였으며 아사이베리 착즙액 역 시 향후 항산화 및 항비만 기능성 식품 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

감사의 글

본 논문은 2018년도 대구가톨릭대학교 교내연구비 지원에 의한 것으로 감사드립니다.

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