딸기( Fragaria ananassa var. ‘Seolhyang’) 잎 분획별 추출물의 화장품 소재 특성
이다솜․김경희․육홍선 충남대학교 식품영양학과
Cosmetic Effects of the Fractional Extracts from Strawberry (Fragaria ananassa var. ‘Seolhyang’) Leaf
Da-Som Lee, Kyoung-Hee Kim, and Hong-Sun Yook Department of Food & Nutrition, Chungnam National University
ABSTRACT To examine the effects of the fractions from strawberry (Fragaria ananassa var. ‘Seolhyang’) leaf extract on skin care, this study measured the anti-microbial activities, tyrosinase inhibition activity, collagenase inhibition activity, elastase inhibition activity, and hyaluronidase inhibition activity. The tyrosinase inhibition activity and collage- nase inhibition activity on the ethyl acetate fraction showed the highest IC50 values at 9.22±1.19 mg/mL and 2.56±0.25 mg/mL, respectively. The elastase inhibition activity of the extracts was 93.70±4.49% (ethylacetate fraction), 92.22±
2.22% (n-butanol fraction), 77.19±5.32% (n-hexane fraction), 69.38±1.78% (water fraction), and 44.12±3.92% (80%
ethanol extract), respectively, at 1.25 mg/mL concentration. For the hyaluronidase inhibition activity, the ethylacetate fraction exhibited low hyaluronidase inhibition activity, but the others did not reveal any notable hyaluronidase inhibition activity. With regard to the antimicrobial activity, the 80% ethanol extract was effective on five bacteria, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, and Salmonella enterica, and the water fraction was effective against B. cereus, B. subtilis, E. coli, Ent. cloacae, S. enterica, and Pseudomonas aeruginosa.
Key words: strawberry (Fragaria ananassa var. ‘Seolhyang’) leaf, cosmetic effects, antimicrobial
Received 4 January 2018; Accepted 1 February 2018
Corresponding author: Hong-Sun Yook, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-42-821-6840
서 론
최근 생활수준의 향상에 따라 삶의 질을 높이고자 하는 욕구가 증가하는 추세이며, 어떻게 더 젊고 건강하게 살지에 대한 관심이 증가하였다. 이에 국내외 화장품의 시장규모는 지속해서 증가하는 추세이며, 특히 기능성 화장품에 대한 관심이 고조됨으로써 기능성 화장품 생산의 비중이 꾸준히 증가하고 있다. 그러나 피부는 대기오염, 온도, 과도한 자외 선 등 외부자극에 노출되어 있어 산화적 스트레스를 발생시 키고(1), 이러한 노출은 피부 조직을 손상해 외인성 노화 과 정을 촉진하는 것으로 보고되어 있다(2). 특히 피부가 자외 선에 노출되면 자유 라디칼인 활성산소종이 생성되며, col- lagen과 elastin이 변성되어 피부의 탄력성을 잃게 되고 주 름을 발생시킨다(3). 이런 피해를 감소시키기 위해 피부 보 호 방안으로 미백, 주름 개선, 보습 기능이 있는 기능성 화장 품에 대한 요구가 증가하고 있으며, 이에 따라 천연물을 이 용한 미백, 주름 개선 및 보습 화장품 소재로서의 가능성에
대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 천연물을 이용한 미백, 주름 개선 및 보습 화장품 소재로서의 가능성에 대한 연구로 는 대청엽의 성분 분리 및 화장품 소재로서의 생리활성 연 구, 가시연꽃 종자 추출물의 화장품 원료로서의 특성, 참나 물 추출물에 미백화장품 소재 개발에 대한 연구, 제주 자생 식물로부터 항산화 및 화장품 기능성 소재 탐색 등 다양한 연구들이 보고되어 있다(3-6).
딸기(Fragaria ananassa Duch.)는 장미과에 속하는 다 년생 식물로 향기와 색상이 우수하며, 신맛과 단맛이 조화가 잘되어 있고, 독특한 향기를 가진 과채류로서 오래전부터 봄에 애용되어 왔다(7). 딸기에는 anthocyanins, mono- mere flavan-3-ols, hydroxybenzoic acid 유도체, hy- droxycinnamic acid 유도체, anthocyanins, tannins, fla- vonols, procyanidins 등과 같은 다양한 피토케미컬(phy- tochemicals)을 가지고 있으며, 이러한 물질에 의해 항산화, 암 발현 억제, 세포증식 억제 등의 생물활성을 가진다고 알 려져 있다(8). 또한, 딸기의 폴리페놀과 비타민은 산화 및 UVA 유발성 피부 손상, 유리 라디칼 감소, 지질 과산화, DNA 손상 및 미토콘드리아 기능의 개선에 대해 강력한 보 호 효과를 발휘할 수 있음이 보고되고 있다(9). 딸기뿐만 아 니라 딸기 잎에도 딸기의 주요 페놀화합물 중 하나인 엘라직
산(ellagic acid)이 추출용매에 따라 52.8~284.3 mg/mL가 함유된 것으로 알려져 있다(10). 엘라직산은 체내의 과산화 지질 형성을 억제하여 활성 유리기에 의한 조직손상을 예방 하고 체내의 주요한 해독 효소들의 활성을 촉진함으로써 발 암 억제 효과가 있으며(11), 피부암(12), 소장암(13) 및 간 암(14) 등의 발생을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 엘 라직산은 멜라닌 세포와 반응하여 세포를 손상하지 않으면 서 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보고되고 있다(15). 그러 나 딸기는 주로 과실만 소비하고 있고 잎은 거의 농가에서 버려지고 있어, 이러한 딸기 잎을 산업적으로 이용한 경우 버려지는 딸기 잎의 효율적인 처리 및 농가소득에도 기여할 것으로 판단된다. 잎 추출물의 화장품 소재로서의 활용 가능 성에 대한 연구로는 잣나무 잎 추출물의 화장품 소재로서의 기능성에 관한 연구(16), 천연화장품의 재료로서 복숭아 잎 추출물의 기능성 평가(17), 산유자 잎 에탄올 추출물의 미 백, 주름 억제, 항염증 및 항산화 효능(18) 등 다양한 연구들 이 활발히 진행되고 있다.
따라서 본 연구에서는 버려지는 자원인 딸기 잎의 이용 가능성 증대를 위해 자연 건조한 딸기 잎을 미백, 주름 개선, 보습 효과가 있는 기능성 화장품 소재로 개발하고자 관련 효소 억제 활성과 항균 활성을 측정하고 비교 분석하여 화장 품 산업에서 기능성 소재로서의 이용 가능성을 확인함으로 써 관련 산업의 응용에 기초자료로 제공하고자 한다.
재료 및 방법
실험에 사용된 딸기 잎(Fragaria ananassa var.‘Seol- hyang’)은 2016년 5월에 충청남도 논산 김종원 농장에서 수확하여 수세한 후 일주일간 음건하였고, 마쇄하여 분말로 만들어 각종 실험 및 분석에 사용하였다.
시료 제조
건조된 딸기 잎은 시료 200 g당 15배량(w/v)의 80% 에탄 올로 24시간 3회 추출한 다음, 추출액을 여과지(Whatman No. 2, Maidstone, UK)로 감압･여과하였다. 여액을 40°C 수욕상에서 rotary vacuum evaporator(EYELA A-1000 S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 용매를 제거하 고 감압･농축한 후 동결 건조(SFDSM12-60 Hz, Samwon Freezing Engineering Co., Seoul, Korea)하여 4°C 이하 로 냉장 보관하면서 실험에 사용하였다. 80% 에탄올 추출물 은 separating funnel에 의한 용매별 분획으로 n-hexane, ethyl acetate 및 n-butanol로 연속 추출한 후 각 분획물을 rotary vacuum evaporator로 감압･농축한 다음 동결 건조 해 수율을 계산하였다.
Tyrosinase 저해 활성 측정
Tyrosinase 저해 활성은 Flucky의 방법(19)에 따라 측정 하였다. 시료 0.2 mL에 0.1 M potassium phosphate buf-
fer(pH 6.8) 0.5 mL, 기질로서 10 mM L-DOPA(dihydroxy- phenylalanine)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 0.2 mL, 효소액(mushroom tyrosinase, 100 unit/mL)(Si- gma Chemical Co.)을 혼합하여 37°C에서 15분간 반응시 킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase 저해 활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 나타내었다.
Tyrosinase 저해 활성(%)＝
(
1－ A－BC)
×100A: 효소액을 첨가한 시료 처리구의 흡광도 B: 효소액을 첨가하지 않은 시료 처리구의 흡광도 C: 효소액 첨가 후 시료 대신 시료 희석액을 첨가한 흡광도
Collagenase 저해 활성 측정
Collagenase 저해 활성 측정은 Wunsch과 Heindrich의 방법(20)에 따라 측정하였다. 4 mM CaCl2(Junsei Chemi- cal Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 첨가한 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4–phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro- Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3 mg/mL)(Sigma Chemical Co.) 을 녹인 기질액 0.25 mL와 시료 0.1 mL를 혼합한 다음 col- lagenase(0.2 mg/mL)(Sigma Chemical Co.) 0.15 mL를 첨가하여 37°C에서 20분간 방치하고 6% citric acid(Junsei Chemical Co., Ltd.) 0.5 mL를 넣어 반응을 정지시킨 후 ethyl acetate(Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Pyeong- taek, Korea) 1.5 mL를 첨가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Collagenase 저해 활성은 시료 용액의 첨가구 와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 나타내었다.
Collagenase
저해 활성(%)＝
(
1－ 시료 첨가구의 흡광도)
×100시료 무첨가구의 흡광도
Elastase 저해 활성 측정
Elastase 저해 활성은 Kim 등의 방법(21)에 따라 측정하 였다. 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 700 μL에 기질 3.2 mM N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide(Sigma Chemical Co.) 250 μL와 시료 용액 40 μL를 첨가한 뒤 5 μg/mL por- cine pancreatic elastase(PPE)(Sigma Chemical Co.) 10 μL를 가하여 37°C에서 20분 동안 반응시킨 후 410 nm에서 p-nitroaniline 생성량의 흡광도를 측정하였다. Elastase 저 해 활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율 을 백분율(%)로 나타내었다.
Elastase 저해 활성(%)＝
(
1－ A－BC)
×100A: 효소액을 첨가한 시료 처리구의 흡광도 B: 효소액을 첨가하지 않은 시료 처리구의 흡광도 C: 효소액 첨가 후 시료 대신 시료 희석액을 첨가한 흡광도
Table 1. List of strains used for antimicrobial experiments Strain Media1) Temp.
(°C) Gram
positive bacteria
Bacillus cereus Bacillus subtilis Staphylococcus aureus
NA/NB NA/NB NA/NB
30 30 30 Gram
negative bacteria
Escherichia coli Enterobacter cloacae Salmonella enterica Pseudomonas aeruginosa
NA/NB NA/NB NA/NB NA/NB
30 30 37 37
1)NA: nutrient agar, NB: nutrition broth.
Hyaluronidase 저해 활성 측정
Hyaluronidase 저해 활성 측정은 Lee 등의 방법(22)에 따라 측정되었다. 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 hyaluronidase(7,900 U/mL)(Wako Pure Chemical Indus- tries, Ltd., Osaka, Japan) 0.05 mL에 시료 용액 0.02 mL 를 가한 후, 효소의 활성화를 위해 12.5 mM CaCl2(Junsei Chemical Co., Ltd.) 0.2 mL를 가하여 혼합한 뒤 37°C에서 20분간 반응시켰다. Ca+로 인하여 활성화된 hyaluronidase 용액에 0.1 M acetate buffer(pH 3.5)에 녹인 hyaluronic acid(12 mg/5 mL)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.25 mL를 첨가하여 다시 수욕상에서 40분간 반응시켰다.
그 후 0.4 N potassium tetraborate(Alfa Aesar Co., Ward Hill, MA, USA) 0.1 mL와 0.4 N NaOH 용액 0.1 mL를 반응 혼합물에 첨가하여 3분 동안 가열한 후 완전히 냉각시 켰다. 냉각시킨 반응물에 발색제로 DMAB 시약 3.28 mL를 가하여 37°C 수욕상에서 20분간 반응시킨 다음 585 nm에 서 흡광도를 측정하여 저해 활성을 산출하였다.
Hyaluronidase
저해 활성(%) ＝
(
1－ 시료 첨가구의 흡광도)
×100시료 무첨가구의 흡광도
Disc diffusion assay에 의한 항균 활성 측정
항균 활성은 각 균주를 이용하여 disc diffusion assay로 측정하였다. 항균 활성 측정에 사용된 균주는 Gram 양성균 인 Bacillus cereus(B. cereus) KCTC 1012, Bacillus sub- tilis(B. subtilis) KCTC 1022, Staphylococcus aureus(S. aureus) KCTC 3881과 Gram 음성균인 Enterobacter clo- acae(Ent. cloacae) KTCT 1685, Escherichia coli(E. coli) KTCT 2441, Salmonella enterica(S. enterica) KTCT 1925, Pseudomonas aeruginosa(P. aeruginosa) KTCT 1636의 총 7종을 생물자원센터(Korean Collection for Type Cul- ture, Daejeon, Korea) 및 한국미생물보존센터(Korean Cul- ture Center of Microorganisms, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다.
각 추출물의 항균 활성은 각 균주를 대상으로 Table 1과 같은 조건으로 생육 배양하였다. 즉 분양받은 휴면상태의 균 주들을 nutrient broth(Becton, Dickinson & Co., Sparks,
MD, USA)에서 3회 계대 배양하여 600 nm에서 측정한 흡 광도 값이 0.4~0.6(1×105 CFU/mL) 범위 안에 들어가게 한 후, 항균 활성 측정을 위한 균주로 사용하였다. 각 균주는 항균 시험용 평판배지인 nutrient agar(Becton, Dickinson
& Co.)에 100 μL씩 분주한 뒤 멸균 면봉으로 도말하였고, 각 시료는 disc당 1, 5 mg이 되도록 paper disc(8 mm)에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 24시간 동안 30~37°C에서 배양하여 disc 주변에 생성된 생육 저해환(clear zone, mm) 을 측정하여 항균 활성을 비교하였다.
통계처리
모든 실험은 3회 이상 반복 측정하여 평균과 표준편차로 나타내었으며, 그 결과는 SPSS 22.0(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) soft- ware를 이용하여 일원배치 분산분석(ANOVA)을 하였다.
유의적 차이가 있는 항목에 대해서는 Duncan’s multiple range test로 P<0.05 수준에서 유의차 검정을 하였다.
결과 및 고찰
Tyrosinase 저해 활성
딸기 잎의 생리활성 및 유효 활성을 분석하기 위해 자연 건조하여 마쇄시킨 딸기 잎 추출물 및 용매별로 얻어진 분획 물의 추출 수율을 계산한 결과, 80% 에탄올로 추출한 딸기 잎의 추출 수율은 22.37%였으며, 80% 에탄올 추출물에 대 하여 용매별로 분획한 분획물의 추출 수율은 water 분획물 이 49.93%로 가장 높은 수율을 나타내었고 n-butanol 분획 물이 24.97%, ethyl acetate 분획물이 12.88%, n-hexane 분획물이 3.32%의 순으로 측정되었다(data not shown).
멜라닌 합성 과정에서 멜라닌 생성 촉진 역할을 하는 효소 인 tyrosinase는 L-tyrosine을 산화 반응시켜 L-DOPA (L-3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)로 만들고 L-DOPA quinone으로 산화시켜 DOPA chrome을 거쳐 멜라닌 색소 를 중합하게 되는데, 이때 tyrosinase의 효소 활성을 저해되 거나 중간체들의 산화 반응이 저해되면 멜라닌 색소의 중합 이 감소하게 된다(23). 딸기 잎 추출물의 분획별 tyrosinase 저해 활성은 50% 라디칼 소거능을 나타내는 IC50값으로 Table 2에 나타내었다. 딸기 잎 추출물의 분획별 tyrosinase 저해 활성의 IC50값은 ethyl acetate 분획물이 9.22±1.19 mg/mL로 가장 높은 활성을 나타냈으며, water 분획물이 9.75±0.41 mg/mL, n-butanol 분획물이 10.27±0.21 mg/
mL, 80% ethanol 추출물이 16.01±1.80 mg/mL, n-hex- ane 분획물이 22.37±4.70 mg/mL의 순이었다. 양성 대조 군으로 사용한 kojic acid에서는 0.31±0.01 mg/mL의 IC50 값을 갖는 것으로 확인되었다.
Park과 Onjo(24) 및 Kim 등(25)의 연구에서는 각각 구아 바 잎과 비타민나무 잎 분획물의 tyrosinase 저해 활성을
Table 2. Tyrosinase inhibition activity of various solvent frac- tions from 80% ethanol extract of strawberry (Fragaria ana- nassa var. ‘Seolhyang’) leaf
Solvent Tyrosinase inhibition activity (IC501), mg/mL) 80% ethanol extract
n-Hexane fraction Ethyl acetate fraction n-Butanol fraction Water fraction
16.01±1.80b2)3) 22.37±4.70a 9.22±1.19c 10.27±0.21c 9.75±0.41c Kojic acid 0.31±0.01d
1)Amount required for 50% reduction of tyrosinase inhibition activity.
2)Values are mean±SD (n=3).
3)Values with different letters within a column differ significantly (P<0.05).
Table 3. Collagenase inhibition activity of various solvent frac- tions from 80% ethanol extract of strawberry (Fragaria ana- nassa var. ‘Seolhyang’) leaf
Solvent Collagenase inhibition activity (IC501), mg/mL) 80% ethanol extract
n-Hexane fraction Ethyl acetate fraction n-Butanol fraction Water fraction
3.08±0.22d2)3) 10.41±0.74a 2.56±0.25d 3.14±0.27d 4.79±0.36c Ascorbic acid 8.64±0.45b
1)Amount required for 50% reduction of collagenase inhibition activity.
2)Values are mean±SD (n=3).
3)Values with different letters within a column differ significantly (P<0.05).
측정한 결과 ethyl acetate 분획물에서 각각 65.2%(1 mg/
L)의 활성과 108.5 μg/mL의 IC50값을 보이며 가장 높은 활 성을 나타냈는데, 이는 본 논문의 딸기 잎 추출물의 분획별 tyrosinase 저해 활성 측정에서 ethyl acetate 분획물이 가 장 높은 활성을 보인 것과 유사하다. 그러나 ethyl acetate 분획물을 제외한 다른 분획물의 활성 순서와 값이 다르게 나타났는데 이는 시료에 따라 tyrosinase를 억제하는 성분 이 다르며, 추출 용매에 따라 활성 정도에 차이가 있는 것으 로 생각한다. 딸기 잎에는 gallic acid 유도체인 ellagitan- nins, flavonoids, proanthocyanidins, chlorogenic acids 등의 폴리페놀화합물이 함유된 것으로 보고되어 있다(26).
특히 ellagitannins 계통의 엘라직산이 멜라닌 생성 억제 효 과가 있다고 보고되어 있으며, 구리를 함유한 금속 단백질인 버섯 유래 tyrosinase를 엘라직산과 같이 배양하였을 때 구 리 농도가 감소함에 따라 효소 활성이 감소하는 경향을 보여 엘라직산이 tyrosinase 분자의 활성중심에 위치한 구리와 특이적으로 반응함으로써 효소 활성을 나타내는 것으로 보 고하였다(15).
Collagenase 저해 활성
Collagen은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 세포외 기 질 대부분을 차지하면서 피부를 지지하는 역할을 한다.
Collagen은 자연 노화에 따른 세포의 활성 감소 같은 내적 요인과 여러 유해환경에 의한 스트레스 증가, 자외선 조사에 의한 광노화와 같은 외적 요인에 의해 분해되어 피부 기질이 파괴되면서 주름이 생성된다(27). 이러한 collagen은 트립 신 등과 같은 단백질 분해효소에는 분해되지 않으나, colla- genase에 의해 분해된다고 알려져 있다(28). 딸기 잎 추출 물의 분획별 collagenase 저해 활성은 50% 라디칼 소거능 을 나타내는 IC50값으로 Table 3에 나타내었다. 딸기 잎 추 출물의 분획별 collagenase 저해 활성의 IC50값은 ethyl acetate 분획물이 2.56±0.25 mg/mL로 가장 높은 활성을 나타냈으며, 80% ethanol 추출물이 3.08±0.22 mg/mL, n- butanol 분획물이 3.14±0.27 mg/mL, water 분획물이 4.79
±0.36 mg/mL, n-hexane 분획물이 10.41±0.74 mg/mL 의 순이었다. 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid에서는 8.64±0.45 mg/mL의 IC50값을 보여 n-hexane을 제외한 추출물 및 분획물보다 낮은 활성을 보이는 것으로 나타났다.
본 연구에서 딸기 잎 추출물의 분획별 총 폴리페놀 함량은 ethyl acetate 분획물에서 516.85±8.43 mg GAE/g으로 가 장 높은 함량을 나타내었는데(data not shown), 일반적으로 페놀 추출물은 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 피부 단백질의 분해를 촉매하는 protease의 활성을 억제하는 것으로 보고 되고 있다(29). Leu 등(30)은 대만 토착 식물인 Malus doun- teri A. CHEV. var. formosana로부터 분리한 페놀화합물 중 phloretin, 3-hydroxyphloretin, quercetin 등의 페놀화 합물이 강력한 효소 억제 활성을 나타내었다고 보고하고 있 으며, 딸기 잎은 ellagitannin, kaempferol diglycoside, chlorogenic acid, quercetin diglycoside 등의 페놀화합물 을 함유하고 있다(26). Kim(31)은 올리브 잎 분획물의 col- lagenase 저해 활성을 측정한 결과 ethyl acetate 분획물에 서 가장 높은 활성을 나타냈다고 보고하였으며 250 μg/mL 와 500 μg/mL의 농도에서는 양성 대조군으로 사용한 as- corbic acid보다 더 높은 활성을 보였다고 보고하였는데 이 는 본 연구와 유사한 결과이며, 딸기 잎 분획물이 collage- nase 효소 활성을 저해함으로써 collagen 분해를 막아 주름 개선에 용이할 것으로 판단된다.
Elastase 저해 활성 측정
Elastase는 단백질인 엘라스틴과 콜라겐을 분해할 수 있 는 비특이적 가수분해 효소이다. 피부의 진피조직 속에는 collagen과 피부의 탄력성에 관련된 elastin이 그물망 구조 를 형성하고 있는데, elastin이 elastase에 의해 분해되어 피부의 그물망 구조 결합이 끊어지므로 elastase가 주름 생 성의 주원인 효소로 알려져 있다(32). 딸기 잎 추출물의 분 획별 elastase 저해 활성은 1.25 mg/mL의 농도로 Fig. 1에 나타내었다. 딸기 잎 추출물의 분획별 elastase 저해 활성은 ethyl acetate 분획물이 93.70±4.49%로 가장 높은 활성을
0 20 40 60 80 100 120
80E H EA Bt W VitC
Concentration (1.25 mg/mL)
Elastase inhibition activity (%) .
d
a c a a
b
Fig. 1. Elastase inhibition activity of various solvent fractions from 80% ethanol extract of strawberry (Fragaria ananassa var.
‘Seolhyang’) leaf. 80E: 80% ethanol extract, H: n-hexane frac- tion, EA: ethyl acetate fraction, Bt: n-butanol fraction, W: water fraction, VitC: ascorbic acid. Bar values are mean of 3 replicates and those with different alphabet letters (a-d) are significantly different at P<0.05.
d b
a
c b
0 10 20 30 40 50 60
80E H EA Bt W
Concentration (30 mg/mL) Hyaluronidase inhibition . activity (%) .
A
0 10 20 30 40 50 60
3.75 mg/mL 15 mg/mL 30 mg/mL
Concentration Hyaluronidase inhibition . activity (%) .
Ethyl acate fraction
B
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
2.5 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL
Concentration Hyaluronidase inhibition . activity (%) .
Ascorbic acid
C
Fig. 2. Hyaluronidase inhibition activity of various solvent frac- tions from 80% ethanol extract of strawberry (Fragaria ananassa var. ‘Seolhyang’) leaf (A), ethyl acetate fraction (B) and ascorbic acid (C). 80E: 80% ethanol extract, H: n-hexane fraction, EA: ethyl acetate fraction, Bt: n-butanol fraction, W: water fraction. Bar val- ues are mean of 3 replicates and those with different alphabet let- ters (a-d) are significantly different at P<0.05.
나타냈으며, n-butanol 분획물이 92.22±2.22%, n-hexane 분획물이 77.19±5.32%, water 분획물이 69.38±1.78%, 80
% ethanol 추출물이 44.12±3.92%의 활성을 나타내었다.
양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid에서는 89.15±0.97%
의 값을 보여 ethyl acetate 분획물 및 n-butanol 분획물이 ascorbic acid보다 더 높은 활성을 나타내었다. 딸기 잎 주 요 성분 중 하나인 엘라직산에 대해 spectroscopic 방법에 의한 elastase 저해 활성 측정 결과, 엘라직산이 1.44 mg/
mL IC50값을 나타내 강한 elastase 저해 활성을 나타내었다
고 하였으며, 엘라직산은 phenolic lactone으로 gallic acid 의 이량체 유도체로 차, 적포도주, 석류, 딸기, 블랙베리, 라 즈베리, 호두 등에 유리 형태 또는 ellagitannin glycoside 형태로 함유되어 있다(33). Kim(31)은 올리브 잎 분획물의 elastase 저해 활성을 측정한 결과 ethyl acetate 분획물에 서 93.84%의 활성을 보여 가장 높은 활성을 나타냈다고 보 고하였으며 250 μg/mL와 500 μg/mL의 농도에서는 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid보다 더 높은 활성을 보였 다고 보고하였는데 이는 본 논문과 유사한 결과이며, 딸기 잎 분획물을 기능성 화장품에 적용할 경우 elastase 활성을 억제하여 피부 주름 생성 억제에 용이할 것으로 생각된다.
Hyaluronidase 저해 활성 측정
Hyaluronidase는 피부의 탄력 및 보습에 있어 영향을 끼 치는 hyaluronic acid를 분해하는 효소이며(34), hyaluron- ic acid는 세포외 기질의 주요 구성 성분 중의 하나로 주로 뇌, 근육, 연결조직, 탯줄, 연골 등에서 흔히 존재하고 신체 에 있는 hyaluronic acid의 50% 이상은 피부에서 발견된다 (35). 딸기 잎 추출물의 분획별 hyaluronidase 저해 활성에 서 일반적으로 높은 활성을 보이는 시료는 없었지만 Fig.
2에 나타낸 바와 같이 ethyl acetate 분획물에서 낮게나마 활성을 나타내었다. Ethyl acetate 분획물의 hyaluronidase 저해 활성은 3.75 mg/mL, 15 mg/mL, 30 mg/mL의 농도에 서 각각 13.06±0.24%, 36.26±1.31%, 50.54±1.10%의 활 성을 보였고, 양성 대조군으로 사용한 ascorbic acid의 hy- aluronidase 저해 활성은 2.5 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL
Table 4. Antimicrobial activities of various solvent fractions from 80% ethanol extract of strawberry (Fragaria ananassa var.
‘Seolhyang’) leaf
Microorganism
Size of clear zone (mm)
Solvent Fraction conc. (mg/disc)
1.0 5.0
B. cereus
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－1)
－
－
－
－
10
－
－ 11 10
B. subtilis
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－
－
－
－
－
10.5
－
－ 11 9.5
S. aureus
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
E. coli
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－
－
－
－
－
9.25
－
－
－ 10.25
Ent. cloacae
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－
－
－
－
－
10
－
－
－ 10.5
S. enterica
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－
－
－
－
－
11
－
－
－ 9.5
P. aeruginosa
80% ethanol n-Hexane Ethyl acetate
n-Butanol Water
－
－
－
－
－
－
－
－
－ 9.25
1)Not detected.
의 농도에서 각 1.36±0.09%, 8.58±1.48%, 43.16±0.45%
의 활성을 나타내었다. Lee 등(22)은 제주산 식물을 용매 분획하여 hyaluronidase 저해 활성을 측정한 결과 뚜렷한 활성을 보이는 분획물은 없었지만, 자리공 뿌리의 ethyl acetate 분획물에서 미약하게나마 저해 활성이 나타남을 관 찰하였다고 보고하였는데, 이는 본 연구의 딸기 잎 추출물의 분획별 hyaluronidase 저해 활성에서 높은 활성을 보이는 분획물은 없지만, ethyl acetate 분획물에서 낮게나마 활성 을 보인 것과 유사한 결과이다. Hyaluronidase는 피부의 탄 력 및 보습에 대한 영향 외에 염증 경로를 촉진하는 효소의 하나로 혈관 시스템의 침투성에 관여하며 비만 세포 탈과립 을 직접 조절하므로 hyaluronidase 억제 물질이 항염증 효 과를 나타낼 수 있으며, hyaluronidase에 대한 억제 효과를 나타내는 물질로는 luteolin, kaempferol, quercetin 및 naringenin 등이 보고되어 있다(36). 따라서 딸기 잎 ethyl acetate 분획물의 hyaluronidase 저해 활성을 나타내는 것 은 quercetin 계열의 플라보노이드 화합물일 것으로 생각되 나 이에 대한 연구는 좀 더 진행되어야 할 것이다.
항균 활성
노출된 피부는 그렇지 않은 피부보다 노화 현상이 쉽게 발생하며, 얼굴 피부 같은 경우 여드름균 등 피부 상재균들 이 많은 피부질환을 발생시킨다(37). 피부 상재균 외 화장품 을 변질 및 오염시키는 세균들은 피부에 악영향을 미칠 수 있으며 이를 억제하기 위하여 다양한 종류의 항균제가 사용 되고 있는데, 화장품에 이용되는 방부제 및 항균제는 필수적 이지만 피부에 알레르기를 유발할 수 있으므로 비교적 인체 에 무해한 물질을 사용하는 것이 중요하다(38,39). 딸기 잎 추출물과 분획물을 1 mg/disc와 5 mg/disc의 농도로 하여 항균 활성을 나타낸 결과는 Table 4와 같다. 딸기 잎 추출물 과 분획물의 농도를 5 mg/disc로 하여 항균 활성을 측정한 결과, 그람 양성균인 B. cereus, B. subtilis와 그람 음성균 인 E. coli, Ent. cloacae, S. enterica, P. aeruginosa 균주 에서 생육 저해환이 관찰되었다. 활성을 보인 80% ethanol 추출물에서는 S. enterica(11 mm), B. subtilis(10.5 mm), B. cereus(10 mm), Ent. cloacae(10 mm), E. coli(9.25 mm) 순으로 활성을 보였고, n-butanol 분획물에서는 B. cereus(11 mm), B. subtilis(11 mm)에서 활성을 나타냈으 며, water 분획물에서는 Ent. cloacae(10.5 mm), E. coli (10.25 mm), B. cereus(10 mm), B. subtilis(9.5 mm), S. enterica(9.5 mm), P. aureginosa(9.25 mm) 순으로 생육 억제 활성을 나타내었다. 한편 딸기 잎 추출물과 분획물의 농도를 1 mg/disc로 하였을 때는 모든 균주에서 생육 저해 활성을 나타내지 않았다. Khalifa 등(40)은 딸기 물 추출물 에 대해 그람 양성균인 Escherichia coli O157, Vibrio cholerae O1 El Tor, V. cholerae O139, Vibrio parahae- molyticus, Acinetobacter baumannii, Salmonella Typhi- murium, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri,
Shigella sonnei와 그람 음성균인 Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, methicillin-re- sistant Staphylococcus aureus(MRSA)에 대해 항균 활성 을 측정한 결과 2.5~10%의 농도에서 항균 활성을 나타내었 다고 보고하였다. 또한, 추출물의 pH가 항균 활성에 미치는 영향을 알아본 결과, 중성화 후 딸기의 항균효과가 사라졌다 고 보고하였는데, 이는 항균작용이 베리산과 그 구성분인 페놀화합물 사이의 상승적인 상호작용을 포함하기 때문으 로 설명하였다. 베리류에 대한 항균 활성 평가 결과 블루베 리의 경우 낮은 페놀 및 proanthocyanidin 함량에도 불구하 고 높은 항균 활성을 나타내었는데(40), Puupponen-Pimiä
등(41)은 라즈베리가 딸기보다 높은 항균 활성을 나타낸 것 은 딸기보다 10배 더 높은 라즈베리의 ellagitannin 함량에 의한 것이라 보고하였으며, Mikulic-Petkovsek 등(42)은 블루베리가 라즈베리나 딸기보다 더 높은 수준의 flavonol glycosides 함량을 가지고 있어 더 높은 항균 활성을 나타낸 다고 보고하여 높은 페놀화합물 함량도 중요하지만 구성하 고 있는 페놀화합물의 종류가 더 항균 활성에 영향을 끼치는 것으로 생각된다. Lee와 Shin(43)은 31종의 식물을 필요 부위에 따라 물과 에탄올 추출물을 이용하여 부패와 변질에 관여하는 미생물에 대해 항균효과를 측정하였는데, 그 결과 그람 양성 및 그람 음성균에서 효과가 나타났으며 물 추출물 보다 에탄올 추출물에 대한 생육 저해 효과가 더 컸음을 보 고하였다. 이는 딸기 잎 추출물 및 분획물이 그람 양성 균주 와 그람 음성 균주 모두에서 항균 활성을 보였지만 80%
ethanol 추출물과 water 분획물에 국한되었고 그중 80%
ethanol 추출물에서 더 높은 항균 활성이 보인 것과 유사한 결과이며, 이에 딸기 잎을 이용하여 천연 항균 소재로 활용 하기 위해서는 에탄올 추출물이 더 적절할 것으로 판단된다.
요 약
딸기(Fragaria ananassa var.‘Seolhyang’) 잎을 이용하여 80% ethanol로 농축한 후 이를 n-hexane, ethyl acetate, n-butanol, water 용매로 분획한 다음 미백(tyrosinase 저 해 활성), 주름 억제(collagenase 저해 활성, elastase 저해 활성), 보습 효과(hyaluronidase 저해 활성), 항균 활성을 측정하여 화장품 산업에서 기능성 소재로서의 이용 가능성 을 확인하고자 하였다. 딸기 잎 추출물의 분획별 미백, 주름 억제, 보습 효과를 측정한 결과 항산화와 마찬가지로 ethyl acetate 분획물에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 특히 collagenase 저해 활성, elastase 저해 활성 실험에서는 ethyl acetate 분획물과 n-butanol 분획물에서 양성 대조군 인 ascorbic acid보다 더 높은 활성을 나타내어 주름 생성 억제에 탁월한 효능을 나타내는 것으로 나타났다. Hyalu- ronidase 저해 활성에서는 전반적으로 모든 분획물에서 낮 은 활성을 보였으나, 낮게나마 ethyl acetate 분획물에서 활성을 나타내었다. 딸기 잎 추출물의 분획별 항균 활성은 5 mg/disc 농도의 80% ethanol 추출물과 water 추출물에 서 나타났으며, 9.25~11 mm의 저해환 크기를 나타내었다.
미백, 주름 억제, 보습 효과 실험에서는 ethyl acetate 분획 물의 활성이 가장 높게 나타났으며, 항균 활성 실험에서는 80% ethanol과 water 분획물에서 활성을 나타내어 천연 항균 소재로서의 가능성을 보여주었다.
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