Synthesis and Screening of Cyclooxygenase Activity of Hydantoin and 2-Thiohydantoin Derivatives

약학회 지 제 48 권 제 2 호 141〜 146 (2004) Yakhak Hoeji Vol. 48, No. 2

稱 學 舍 확

Hydantoin 및 2-Thiohydantoin 유도체의 합성과 사이클로옥시게나제 활성 검색

신 혜 순

# •

최희 전

•

권순경 덕성여자대학교 약학대학

(Received February 25，2004; Revised April 1，2004)

Synthesis and Screening of Cyclooxygenase Activity of Hydantoin and 2-Thiohydantoin Derivatives

H ea S oon S h in #, H ee Jeo n C h o i and S oon K young K w on

College of Pharmacy, Duksung Women's Univenrsity，Seoul 132-714，Korea

Abstract — Selective COX-2 inhibitors were expected to retain anti-inflammatory activity by inhibition of prostaglandin production with reduction of gastric and renal side effect associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs. This study reported the syntheses of novel 2-thiohydantoin and hydantoin derivatives which have the structure of 5-membered het- erocyclic ring substituted with two aryl groups, phenyl group at 5-position and /^-sulfamylphenyl or /)-methoxyphenyl group at 1-position. These synthetic compounds showed significant COX-2 activities in vitro screening. Among them, 5-phenyl- 2-thiohydantoin and hydantoin substituted with benzyl group at 3-position, compounds 5 and 8, could be considered as lead compounds with IC50= 13.13—18.78 |ig/m/ for the development of COX-2 inhibitors.

Keywords □ 2-thiohydantoin and hydantoin derivatives, cyclooxygenase-2 inhibitor

사이클로옥시게나제

(cyclooxygenase, C O X

)는

phospholipase, lipoxygenase

등과 같이 염증의 매개체인

eicosanoids

의 생합성 과정에관여한다

. COX

는두종류의

isoform,

즉

COX-1

과

COX- 2

가존재함이 밝혀졌는데

COX-1

은 세포막구성형으로서

house keeping activity

의조절에 필요한

prostanoid

를 생성한다

.

예를 들면

,

혈소판에 의한

thromboxane A

2

(TXA

2)의 생성이나，소화 기점막에서의

prostanoid

의 생성 및신장에서의 신혈류조절작 용을 위한

prostanoid

의 생성 등이다. 1 4

COX-1

과 달리

COX-2

는 염증성 자극에 의해 단시간에 유도되는발현현상을나타내며 각종

cytokine, m itogen,

그람음성균의 세포벽 구성성분인

lipopolysaccahride(LPS)

및

tyrosine kinase

등의 자극에 빈응하 여즉각적으로유도되어진다

.

일부신생조직이나특히 생리적 환 경에의해 염증부위에서 활성이증가되어

PG

를 생성하며

non­

steroidal anti-inflammatory drug(N SA ID)

으■로억제되므로 해열

,

진통

,

항염제 등으로 응용된다

.4， 5)

비스테로이드성 항염증약

(N S A ID S COX-2

를 억제함과동시 에정상조직의 항상성 유지에 중요한역할을담당하는

COX-1

까

#본 논문에 관한 문의는 저자에게로

(

전화

) 02-901-8498 (

팩스

) 02-901-8386 (E-mail) [email protected]

지도 억제함으로써 위장관 출혈 등의부작용을 유발시켜 사용이 매우 제한적이다

.M) 1990

년이후

COX-2

선택성이 밝혀진

D uP 697

으로 시작된

diarylheterocycle

계나

NS-398

과 같은

arylsul-

fonam ide

계의 화합물이 항염

,

진통작용은 보유하면서 부작용을

경감시킴이 밝혀져 선택적인

COX-2

저해제의 개발연구가 계속 되고 있는 추세이다

.

현재 개발 중이거나이미 활발히 연구되어

임상에 사용되고 있는 선택적

COX-2

저해제로서

Celebrex

와

Vioxx

등이 있으며 이들은 모두 구조적으로 공통된 성질을 지니

고 있다

.9-13)

이와 같은 연구동향에 맞추어 저자들은

5

원환의

heterocycle

을

'

중심으로 평면상누 개의

arom atic ring

을가지고 있으며 하나의

aromatic rin g

게는

4

번위치에

sulfonam ide

등 산 화된 형태의

S

를 함유하고 있는

tricyclic s y s te m i

：기본으로하 는

diarylheterocycle

계열에 착안하여 새로운익물을개발하였다

.

따라서 본 연구에서는 염증의 매개물질인

eicosanoids

의 생합

성에 관계된

COX-2

의활성을 억제하며 염증반품을 감소시키는

작용기전에 착신

:

하였다

.

새로운

COX-2

저해제 후보물질의 항염 활성을 검색하는 연구로서는

m urine m acropharge RAW 264.7

세포주와효소면역분석법

(enzym e linked im m uno assay, E L IS A )

를 이용하며 실험실적 세 포 실 험 vitro)으로 평가하기로 하였다

.

약물들의 실험모델의 특성 및 처리조건에 따라 서로 다른 선택 성의 결과를나타낼수 있겠으나

P G E

2 생성량을 정량하여

C O X

142

신혜순

•

최희전

•

권순경

의활성도를측정하는 Engelhardt 등의 실험방법에 따라

14， 15)

우 선，COX가 발현되는 세포주에 LPS를 처리한후 PGE2 생합성 변화를 비교하는 induction model로 저해효과를 검색하였으며，

다음arachidonic acid(AA)로전처리한 activity model로서 PGE2 생합성 변화를 정량하여 효소저해 활성도를측정하였다

.

즉

,

선 택적 구조로 약물디자인을 시도한 diarylheterocycle 계열의 5- phenyl-2-thiohydantoin 및 hydantoin 유도체들에 대한 C0X-2 저해효과를 검색하여 익물구조와약리활성과의 관계를분석하고 자하였다

.

실험방법

시약 및재료

합성 화합물들의

N M R spectrum

은

TM S

를 표준물질로하여

300 M H z G em ini Varian N M R spectrometer

로즉정하였다

. IR

spectrum은 Perkin-Elmer FT-IR spectrometer GX로 즉정하였 으며

GC-MS

는

Agilent 6890 GC

및

5973 M S

를 사용하였다

.

약리활성 즉정실험에 사용된 Dulbeco's modified Eagle's

m edium powder, fetal bovine serum (FBS), penicillin-strepto- m ycin

및

trypsin-EDTA

등은

G IB C O BRL(Gaithresburg, M D . USA

)에서 구입하여 사용하였다

. M urine macropharge RAW

264.7

세포주는 한국 세포주은행에서 분양받았으며

PG E

2 및

PG E2-acetylcholinesterase tracer

는

Cayman Co(Ann Arbor, M I

)에서 구입하였다

. Aspirin(acetylsalicylic acid), lipopolysac- charide(LPS,

E. coli

0111: B4), arachidonic acid, dimethyl- sulfoxide(DM SO)

등의 시약을

Sigma chemical Co(St. Louis.

M O . U SA

)에서 구입하여 사용하였으며 기타모든 시약들은 일

급또는특급 시약을시용하였다

.

화합물의 합성

M e th y l a- anilinophenylacetate

의합성

- M ethy l a-bromo- phenylacetate

1 . 2

m/(7.9 m m ol)

을

A^^V-Dimethylformamide 30

m/에 녹인 후, triethylamine 1.1 m/(7.9 mmol), aniline 0.7 ml

(7.9 m m ol)

순서로 넣어

80oC

를 유지하면서

1

시간 동안반응시 켰다

.

반응을종결한후

, ethyl acetate

2 0

m

/와물 2 0

m

/로 추출 하고유기층을무수

sodium sulfate

로건조시킨 후

,

감압농축하 였다

. M ethan

이로 재결정하여 미황색결정의

m ethyl a-anilin- ophenylacetate

를합성하였다

.

Methyl a-anilinophenylacetate- yield : 1.4 g(73.7%), Formula C15H 15N 0 2 (M.W 241.2), ^- N M R (DMSO-rf6) 6 7.51(d, / =

7.8 Hz, 2H , aromatic), 7.37-7.31(m, 3H , aromatic), 7.05(t, /= 8 .4 H z, 2H , aromatic), 6.67(d, 7= 7.8 Hz, 2H , aromatic), 6.57(t, 1H, aromatic), 6.35(d, /= 8 .1 Hz, 1H, N H ), 5.24 (d, /= 8 .1 H z, 1H, CH ), 3.63(s, 3H , CH 3).

13

C-NMR (CDC13)

5 172.37 (C = 0 ), 145.89

，

137.55, 128.87

，

128.48, 128.31, 127.19, 118.11, 113.38(arom aticX2), 60.69(CH), 52.81(CH3).

FT-IR (NaCl) cm

' 1

3401(NH), 2951(CH), 1737(C =0), 1174 (CO). GC-MS: m/z 241.2(M+), 182.2(100.0), 77.2(92.6)

，

183.2 (71.6)

，

104.2(65.9), 241.2(52.9).

l-(p-M ethoxyphenyl)-5-phenylhydantoin

화합물

(1-6

)의 일반적인 합성 - Ethanol 10 m/에 methyl a 命 methoxyanilino)

phenylacetate 1.0 g(3.69 m m ol

)을 가하여 투명하게 녹인 후

KNCO 0.45 g(5.55m m ol>i

：물

5 m

/에녹인 액을일시에 가하고

8시간동안환류하였다

.

반응액을 감압농축하고

ice

bath 상에서

c-HCl

로

pH 1

까지 조정하면 회색빛이 도는분홍색 결정이 석출 되었다

. Ethanol

로재결정하여흰색결정의

1-

여

-methoxyphenyl)- 5-phenylhydantoin(l

)을 합성하였다

. Scheme 1

에 나타난 바와 같이 위와 같은 방법으로

butyl isocyanate 0.42 m/(3.68 m m ol)

를 가하여

3-butyl-1 -(/)-methoxyphenyl)-5-phenylhydantoin(2>i

： 합성하였다

.

또한

pentyl isocyanate 0.47 m/(3.68 m m ol

)를가하 여

3-pentyl-l-(^-methoxyphenyl)-5-pheny

此 합성 하였다

.

또한

phenyl isocyanate 0.80 m/(7.38 m m ol

)를기히여

3- phenyl-l-(^-methoxyphenyl)-5-phenylhydantoin(4>i

：합성하였다

.

또한

benzyl isocyanate 0.46 m/(3.68 m m ol

)를가하여

3-benzyl-

l-(/>-methoxyphenyl)-5-phenylhydantoin(5>i：합성하였다

.

그리 고 ethanol 10 m/에 methyl a-(/)-sulfamylanilino)phenylacetate 0.5 g(1.56 mmol) 및 KNCO 0.25 g(3.12 mmol)을 가하여 5- phenyl-1-(卜sulfamylphenyl) hydantoin(6)을합성하였다

.

l-(/)-Methoxyphenyl)-5-phenylhydantoin(l)- yield : 0.81 g

(77.9%), Formula C

16

H

14

N

2

0

3

(M .W 28230), ^- N M R (DMSO-

d6) 8 7.50(d, /= 7 .2 Hz, 2H, aromatic), 7.37-7.25(m+d, 3H,

aromatic), 6.64(d+ d

，

/= 9 .3 and 9 H z, 4H , aromatic), 5.01(s, 1H, CH ), 3.60(s, 3H , CH3), 3.40(s, 1H, N H ).

1 3

C-NMR

(DMSO-^6) 5 173.00(0=0 X 2), 151.04, 140.96, 138.75,

128.26

，

127.51

，

127.35, 114.27, 114.10(arom aticX2), 60.42 (CH ), 55.09(CH3). FT-IR (KBr) c m

1

3402(NH), 1514(CO).

GC-MS: m/z 282.30(M +), 196.1(100.00), 211.1(88.27), 167.1 (21.76), 210.2(15.50), 197.1(15.11).

3-Benzyl-l-(^-methoxyphenyl)-5-phenylhydantoin(5)- yield :

0.37g(55.2% ), Formula C

2 3

H

20

N

2

O

3

(M .W 372.42), XH-NMR

(DMSO-d6) 8 7.43-7.29(m+d, 12H, aromatic), 6.87(d, J= 9

Hz, 2H , aromatic), 6.05(s, 1H, CH ), 4.70(s, 2H, CH2), 3.68(s, 3H , CH 3).

13

C-NMR (DMSO-rf6)

6

170.31 (C = ()X 2 ), 156.30, 154.17, 136.25, 133.63, 128.86, 128.64, 128.50

，

127.46

，

127.30, 123.40

，

113.94(arom aticX3), 63.82(CH), 55.07(CH3), 41.79(CH2). FT-IR (KBr) cm

' 1

1777(C =0), 1713(C =0), 1515(CO). GC-MS: m/z 372.42(M + ), 372.1(100.00)

，

196.1 (38.26), 211.1(28.23), 373.1(26.95), 91.1(25.55).

J. Pharm. Soc. Korea

Hydantoin

및

2-Thiohydantoin

유도체의 합성과 시이클로옥시게나제 훨성 검색

143

l-(p-M ethoxyphenyl)-5-phenyl-2-thiohydantoin

화합물

(7- 9

)의 일반적인 합성

- E th ano l 10m

/에

m ethyl a-(/)-methoxy-

anilino)phenylacetate 1.0 g(3.69 mmol)을 가하고 약간 가온하면 서 교반하여 투명하게 녹였다

. K N CS 0.72g(7.38m ol

)을 물

5 m L

에 녹인 액을 일시에 가하고

triethylam ine 1.03 m/(7.38 m m ol

)를넣어

16

시간동안환류하였다

.

반응액을 감압농축하고

ice bath

상에서

c-HCl

로

pH 1

까지 조정하면 분홍색의 결정이 석출되었다

. Ethanol

로 재결정하여 회색결정의

l-(>-methoxy-

phenyl)-5-phenyl-2-thiohydantoin(7)i： 합성하였다

.

이와같은방 법으로

benzyl isothiocyanate 0.98 m/(7.38 m m ol

)를 가하여

3-

benzyl-l-(/>-methoxyphenyl)-5-phenyl-2-thiohydantoin(8) 을 합 성하였다

.

그리고

ethanol

1 0

m

/에

m ethyl a-(/?-sulfamylanilino)

phenylacetate 1.0 g(3.12 mmol) 과 KNCS 0.61 g(6.24 mmol) 및

triethylam ine 0.87 m/(6.24 m m ol)

를 가하여

S-phenyl-l-^-

sulfamylphenyl)-2-tWohydantoin(9)을합성하였다

.

l-(/>-Methoxyphenyl)-5-phenyl-2-thiohydantoin(7)- yield : 1.02 g (92.7%), Formula C

16

H

14

N

2

0 2S (M.W. 298.37), :H- N M R (DM SO-J6) 5 7.50(d, /= 6 .9 Hz, 2H , aromatic), 7.37- 7.28(m+d, 3H , aromatic), 6.64(d+d, 7 = 9 .3 and 9.3 Hz, 4H, aromatic), 5.01(s,

1

H , CH ), 3.60(s, 3H , CH3), 3.36(s, 1H, N H ).

13

C-NMR (D M SO

섟

6)

6

1 7 2 .9 6 (0 0

，

C = S ), 151.03

，

HNU

ᄋ c h 3 KSCN. TEA, diL C MUOH 32hrs. reflux

N-H

Methoxy carbonyl a-anilinophenylacetate

Toluene,

R,-NCO

C2H5OH.

r2x

reflux

R, = OC：H3, S02NH2

R2= H, C4Hq, C5Hn . c6h5 c h2c6h5

Scheme 1

- Synthesis of l,3-substituted-5-phenyl-2-thiohydantoin and hydantoin

(1-9).

140.98

，

138.82, 128.24, 127.48, 127.34, 114.27

，

114.09 (aromatic x 2), 60.46(CH), 55.10(CH3). FT-IR (K B r) cm

" 1

3403(NH), 1514(CO). GC-MS: m/z 298.37(M+), 196.1(100.00), 211.1(92.10), 167.1(21.49), 210.2(15.03), 197.1(14.57).

3-Benzyl-l-(^)-methoxyphenyl)-5-phenyl-2-thiohydantoin(8)- yield : 0.7g(48.6% ), Formula C

2 3

H

2 0

N

2

O 2S (M.W. 388.49), XH-NM R (DMSOnd6) 5 7.42-7.22(m+d, 12H, arom atic), 6.89 (d, 7 = 9 Hz, 2H , aromatic), 6.12(s, 1H, C H ), 5.08(d, 7 = 3 .3 H z, 2H , CH 2),

3 . 7 1 ( s ,

3H , C H 3).

13

C-NM R (D M S ᄋ

^

6) 5 171.70(C =0, C = S ), 158.10, 136.04

，

132.82, 129.69

，

129.00, 128.47, 128.38, 128.19

，

127.78, 127.63, 127.37, 113.86 (aromatic x 3), 68.00(CH), 55.13(CH3), 44.70(CH2). FT-IR (KBr) cm

' 1

1752(C = 0), 1513(CO). GC-MS: m /z 388.49(M +), 388.2(100.00), 212.2(41.03)

，

387.2(29.02), 389.2(27.82), 91.1 (26.68).

R A W 264.7

세포주의 배양 및약물처리

CO X

가발현되는 세포주인

m urine macropharge RAW 264.7

세포를

5% C 0 2, 37°C

배양기에서

D M EM (D ulbeco's m odified Eagle's medium), 100 units/m/ penicillin, 100|xg/m/ streptomycin

및

10% FBS(fetal bovine serum )

배지로

2~ 3

일간격으로 계대 배양하였으며

2~ 3

회 계대한 세포를실험에 이용하였다

.

바닥에 부착된 세포를분리할 때는

0.25% trypsin-EDTA

용액으로 배 양기의 부착면으로부터 분리시킨 다음 원심분리하고

3

회세척한 후

FBS

가 함유되어 있지 않은

D M E M

배지로

50 X 104 cell/m/

가 되도록 현탁시켰다

.

이 현탁액에 아스피린을 최종농도가

500|iM

이되도록 첨가하여 세포에 잔존하는

C O X

의 활성을 비

가역적으로 저해하였다

.

이현탁액을

96 w ell

세포배양판의 각

w ell

에

2 0 0

10/를 가하여

5% C 0 2> 37°C

에서

4

시간 동안 배양하 여 세포를

plate

의 각

w ell

바닥에 부착시켰다

.

부착된 세포를

PBS(phosphate buffered saline

)로

3

회 세척한후 각

w ell

표면 에 붙어있는 세포를실험에 시용하였다

.

효소면역분석법

( E L I S A *

이용한

P G E

2의측정

세포가부착되어 있는각

well

에

1 ng/m

/의

L P S *

함유한

10%

FBS-DM EM

을

200 피

씩 넣었다

.

이때 대조군에는

LPS

가 없는 배지만을 넣었다

. LPS

가포함된 배지로교환한 후

D M S O

에녹 인검색시료를 적정량처리하고

, 37°(：, 5% C 0

2 조건 하에서

18

시간 배양하여 그 상층액을회수하여 유리된

P G E

2량을 효소면

역분석법을시용하여 정량하였다

.16)

항체가부착되어 있는

plate

의 각

w ell

에서 회수한 상증액과 함께

P G E

2

-acetylcholinees-

terase tracer

를넣어상온에서

18

시간배양한후 ，

w ell

에남아있 는 용액을 털어내고

0.05% Tween 20-PBS

로각

w ell

을

5

회세 척하고

Ellm an

시약 1 6 0

바

를 각

w ell

에 넣은 후

7

시간 배양하

144

신혜순

•

최희전

.

권순경

여

405nm

에서 흡광도를 측정하였다

. PG E

2 표준품으로검량선

을 작성하여 각시료를처리한 배양액 중의

PG E

2 생성량을 구

하였다

. P G E

2의 정량은흡광도변화와농도와의 관계를나타내

는 표준검량선을 이용하여 각 세포 배양액에 함유된

PG E

2의

함량을 계산하였다

.

실험군들은 나성만가한대조군은 1 0 0

%

활 성 유발군

, LPS

와

ASA

등 약물을 가하지 않은 군은

0%

활성 유발군으로 나누었다

. 100%

활성은

LPS

를처리한군과 처리하

지않은 군에서 생성된

PG E

2의 차이를 기준으로 하여 각시료

의%저해값을 구하였다

.

실험군과 대조군은

duplicate

로

3

회이 상 동일 실험을진행하였다

.

ELISA를 이용한 COX-2의 저해활성 측정

COX-2

유도발현은 배양된 최종세포수가

5X 1 0

6

cell/m

/로 조 정된

96 w ell

세포배양판의 각

w ell

에

10|ig/m

/의

LPS

를 처리 하고

3

%의

FB S

가함유된

D M E M

배지

200

峰 넣고

5% C 0 2, 37°C

에서 배양하여

COX-2

와

COX-1

활성을유도시켰다

. 16

시간 동안 배양한후 ，

PBS

로세포를세척하고각

well

에

FBS

가함유 되지 않은

D M E M

배지

200|j

/를 넣고검색시료를 적정량처리 하여

5~ 15

분간

37°C

에서 방치하였다

.

최종농도가

10

버 이 되 도록

AA

를 처리하고

15~20

분•간재배양하였으며

COX-1

활성 유도의 경우

,

어떤처리도 하지 않은 대식세포를시용하였다

.

반 웅종료후 일정량의 상층액을 회수하여 효소 면역분석법에 따 라

16} E L ISA plate reader

를이용하며 흡광도

504 nm

를측정하 는 방법으로 유리된

p g e

2

i~

정량하였다

. PG E

2의 정량은 흡광 도 변화와농도와의 관계를나타내는표준검량선을이용하여 각

세포 배양액에 함유된

PG E

2의 함링을 계산하였다

.

각화합물들

의

IC

50는

AA

를 처리하지 않은 대조군에서 생성된

PG E

2에대 한

, AA

를 처리한실험군에서 생성된

PG E

2량의 차이로부터 %저 해값을구한후 산출하였다

.

실험군과 대조군은

duplicate

로

3

회 이상동일 실험을진행하였다

.

실험결고F 및 고 찰

비 스테로이드성 소염진통제의 문제점을 해결하기 위하여

salicylate

유도체로부터 시작된

N SA ID

연구는 계속해서

pyrazolone

유도체와

diarylpyrazole

유도체 등으로 구조변환을 모색하며 신약개발을시도하였다

. Diarylheterocycle

구조에서 중 앙에 위치하는

heterocycle

은

pharmacopore

이기보다는 단지 이 중결합을 제공하는 역할을 하며 다양하게 변환을 시도할수 있

는 공간을 제공한다

.17’18)

이같은 연구추세에 맞추어 저자들은

heterocycle

로

hydantoin ring

을 선택하였고 그 주위에 2개의

aromatic ring

을 갖는 목적화합물을 고안하였으며

,

특히 1번

aromatic ring

의 위치에

electron donating group

인

methoxy group

을 도입하거나

electron withdraw ing group

이면서 약효에

C om p. R i R2 Inhibition (,%)

6 S02NH2 H 0 so 100

Fig. 1 一 % Inhibitory activity of l,3-substituted-5-phenylhydantoin derivatives (1-6) on COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cell at 10

[Lg/ml.

중요한 역할을할것으로여겨지는

sulfonamide group®-

도입한 새로운화합물을 개발하였다

.

선택적

COX-2

저해제 후보약물의 약리활성을검색하는 연구

로는

C 0 X

가발현되는

m urine macropharge RAW 264.7

세포주 에

LPS

를처리하여

C0X-2

를유도한 후

,

약물투여 후의

PG

생 성량 변화를 비교하는

induction model

을14〉이용하여 %저해값 을 산출하였다

.

먼저

, l

，

5-diarylhydantoin

의

R

!이

methoxy group

이나

sulfamyl group

으로，

R

3가

alkyl group

으로 치환된

hydantoin

계열의 화합물들

(1-6)

의효소저해 결과는

Fig. 1

에나 타낸바와 같이화합물

1

은

79.4±47.5(

평균값

±

표준편차)，화합 물

2

는

86.8±13.4

로

,

화합물

3

은

70.6±42.6

로

,

화합물

4

는

73.8

±23.7

로

,

화합물

5

는

85.6±25.3

로

,

그리고 화합물 6은

76.3±

35.7

의

%

저해값으로서，화합물

2

와

5

는매우탁월한

C0X-2

저 해효과를 나타냈다

.

그리고

R

!이

m ethoxy group

이나

sulfamyl group

0

■

로

, R

3가

alkyl group0-?-

치환된 2

-thiohydantoin

계열의 화합물들

(7-9)

의효소저해 결과는

Fig. 2

에나타낸바와같이 화 합물

7

은

84.4±33.8,

화합물 8은

78.8±24.5

및화합물

9

는

66.3

±

1 2 . 1의%저해값으로이 계열의 화합물들은 대체적으로 강한

C0X-2

저해효과를 나타내었다

.

이와같은효소유도방법으로 측정된

PG

생성량중에는

LPS

에의하여 유도된

C0X-2

저해효과이외에도 다른 경로에 의하

여생성된

PG

량도포함될 수 있다는

O'Banion

둥의 보고에 따 라

19>

합성화합물들이

COX-2

에대해 직접적인 저해활성을갖는 가를 판단하기 위하여 다음 단계의 실험을진행하였다

.

대식세 포

(macropharge cell

)에

COX-2

를유도시킨 후

AA

를직접 전처 리함으로써 약!■투여후에 유리된

PG E

2 생합성변화링을

ELISA

2 C aH 9

3 O CHs CsHn

4 C«H5

J. Pharm. Soc. Korea

Hydantoin

및

2-Thiohydantoin

유도체의 합성과 시이클로옥시게나제 휠성 검색

145

Comp. Ri R2 Inhibition (%)

OCH3

8 CH2C6H5

9 SO2NH2 H

Fig. 2 — % Inhibitory activity of l,3-substituted-5-phenyl-2-thiohy- dantoin derivatives (7-9) on COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cell at 10 (xg/m/.

로 정량하는

activity m odel

15)을 설정하였다

.

이실험방법을 통 해

IC

50를 산출한 결과는 먼저

, l

，

5-diarylhydantoin

의

R

!이

methoxy group

이나

sulfamyl group

으로，

R

3가

alkyl group-

ᄋ■로 치환된

hydantoin

계열의 화합물들

(

1

-

6

)

의효소활성 저해도는

Fig. 3

에나타낸 바와같이 화합물

1

의

ICso

값은

22.65 (ig/m/

로，

화합물

2

는

19.34|ig/m

/로 계산되었고

,

화합물

3

과

4

는 %저해 값이

50%

이하로 나타났기 때문에

ICso

값은 구할 수 없었다

.

화합물

5

는

13.13 iig/m/

로

,

화합물 6은

28.43

나

g/m

/로서 예상했 던결과대로효소저해 활성도평가에서도화합물

5

가탁월한 선 택적

COX-2

저해효과를나타냈다

.

그리고 & 이

methoxy group

나

sulfamyl group

으로，

R

3가

alkyl group

으로 치환된 2

- thiohydantoin

계열의 화합물들

(7-9

)의효소활성 저해도는 화합 물

7

의

IC

50 값이

25.76

收

/mZ

로，화합물 8은

18.78

로

,

그 리고화합물

9

는

29.48

로서

C0X-2

활성저해 선택성이 잠

Inhibitory Activity 100

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 3 - % Inhibitory activity of l，3-substituted-5-phenyl-2-thiohy- dantoin and hydantoin derivatives (1-9) on COX-2 in LPS- stimulated murine macropharge cell with 10 (iM arachi­

donic acid.

재하는 결과가확인되었다

.

대부분의 화합물들의 결과에서 효소

유도실험과 유사한결과로

COX-2

활성저해 효과를보여 실험

의 신뢰도가 높은 것으로 나타났다

.

위 실험의 대조약물인

Celecoxib

의

IC

50은 동일농도에서 약

0.001 |iM

이었으므로가장

효과가우수했던 화합물

5

와비교해 보았을 때에도 약

100

배 정

도의 차이가 있었다

.

위와 같은 실험결과를 통하여

hydantoin ring

의 1번 위치에

phenyl group

보다는

/>-methoxyphenyl group0 ]

치환되어 있 을 때와

3

번 위치에 수소가 아닌

aralkyl group

으로 치환되어

있을 때 그 효과가 좀 더 우수함을 알 수 있었다

.

즉

1,5-

diarylhydantoin

의

R

!이

m ethoxy group

으

■

로

, R

3가

benzyl group

으로치환되어있는화합물

5

가가장우수한 효과를 나타내었다

.

한편

hydantoin ring0 ]

형성되지 않은 화합물들은 약효검색 실 험에서 %저해값이

50

%에미치지 않는결과

(

자료생략)를 나타낸 것으로 미루어 보아

tricyclic system

이 약효에 매우 중요한 역 할을 함을 알수 있었다

.

한편

, l,5-diaryl-2-thiohydantoin

의 경 우에도

R

!이

m ethoxy group

으로,

R

3에

aralkyl group

치환시

pentyl

기나

phenyl

기보다는

benzyl group

으로 치환된 화합물 8

이강한 효과를보였으며

,

또한 위에 언급한대로

thiohydantoin

의

S

와

hydantoin

의 0의구조적 차이는효소저해효과에서 뚜렷

한차이를나타내지 않는것으로보아 중앙의

heterocycle

핵이

약리활성관계에는중요하지 않음을확인할수 있었다

. K algutkar

둥에 의하면

Aspirin

과

Indom etacin

은

C0X-2

보다

COX-1

에더 욱특이성이 있는데

Aspirin

은 살리실산에서

COX-1, COX-2

활 성자리의

serine

잔기로

acetyl group

을 이동시켜 이들 효소를 비가역적으로저해시키며

, Indom etacin

은초기에는

COX-1, COX-

2에가역적인비공유성 결합을 일으키나

,

곧이어 이들 효소의 구

조적 변화를 야기시켜 비가역적 결합을 하게 되는 것으로 알려 져 있다

.2u>

이러한화합물의 구조와 약리활성과의 관계는

COX-

1

과

COX-2

의 활성부위 아미노산 잔기와의 상호작용이 강한이

온결합이므로선택성에 필요한상호작용을조절할 수 있게 되는

것이다

.

이는

C0X-2

의활성부위에서 수소결합을할수 있는위

치가

COX-1

보다더많다는

K hanna

둥의 보고와

2w

관련지어 본 다면 수소결합이 가능한 선택적 구조특이성의 구조활성관계로 볼 수 있다

.

정상조직 위점막세포의

COX-1

에는 작용하지 않고염증부위의

COX-2

에만 특이적으

j,L

작용해야하는 선택적 측면에서 본다면

합성된화합물들중 가장우수한항염활성을 보이는약물은

1,5- diarylhydantoin

계열의 유도체중

1-methoxyl

기와

3-benzyl

기를 도입한화합물

5

와

1,5-diaryl-2-thiohydantoin

계열의 유도체 중

1-methoxyl

기와

3-benzyl

기를도입한 화합물8이효소유도실험 과활성저해도를평가하는실험 모두에서 탁월한

C0X-2

저해활 성을 나타내었고，탁월한

COX-2

선택성을보유하는 선도약물로 가능할것임이 확인되었다

.

* r f i

i i

r^E-i

*

50

(0/0 ) uoiillul

146

신혜순

•

최희전

•

권순경

감사의 말씀

본 연구는 한국과학재단 목적기초연구

(R04-2003-000-10138-

0

)

지원으로수행되었기에 이에 감사드립니다

.

참 고 문 헌

1) Vane, J. R. : Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs. Nature (New Biol.) 231, 232 (1971).

2) Dubois, R. N., Abramson, S. B., Crofford, L., Gupta, R. A., Simon, L. S., Van de Putte, L. B. A. and Lipsky, R E. : Cyclooxygenase in biology and disease. FASEB J. 12，1063 (1998).

3) Smith, W L., Garavito, R. M. and DeWitt, D. L. : Prostaglandin endoperoxide H synthases (cyclooxygenase)-1 and -2. /. Biol Chem. 271，33157 (1996).

4) Herschman, H. R. : Prostaglandin synthase 2. Biochim.

Biophys. Acta 1299，125 (1996).

5) Chang, H. and Jahang, Y. : Selective cyclooxygenase-2 inhibitors as anti-inflammatory agents. Kor. J. Med. Chem. 8，48 (1998).

6) Michell, J. A., Akarasereenont, R, Thiemermann, C., Flower, R. J. and Vane, J. R. : Selectivity of nonsteroidal anti­

inflammatory drugs as inhibitors of constitutive and inducible cyclooxygenase. Proc. N atl Acad. Sci. USA 90，11693 (1994).

7) Allison, M. C.’ Howatson, A. G., Torrance, C. J., Lee, E D. and Russell, R. G. : Gastrointestinal damage associated with the use of non-steroidal antiinflammatory drugs. N. Engl. J. Med.

327，749 (1992).

8) Clive, D. M. and Stoff, J. S. : Renal syndromes associated with nonsteroidal antiinflammatory drugs. N. Engl. J. Med. 310，563 (1984).

9) Gans, K. R., Galbraith, W., Roman, R. J., Harber, S. B., Kerr, J.

S., Schmidt, W. K.，Smith, C., Hewes, W. E. and Ackerman, N.

R. : Antiinflammatory and safety profile of DuP 697，a novel orally effective prostaglandin synthesis inhibitor. J. Pharmacol.

Exp. Ther. 254, 180 (1990).

10) Futaki, N., Yoshikawa, K., Hamasaka, Y., Arai, I., Higuchi, S., Iizuka, H. and Otomo, S. : NS-398，A novel non-steroidal antiinflammatory drug with potent analgesic and antipyretic effects, which causes minimal stomach lesions. Gen.

Pharmacol. 24，105 (1993).

11) Penning, T. D.，Talley, J. J. and Bertenshaw, S. R. et al. : Synthesis and biological evaluation of the 1,5-diarylpyrazole class of cyclooxygenase-2 inhibitors: Identification of 4-[5-(4- methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-lH-pyrazol-l-yl]benzene- sulfonamide (SC-58635，Celecoxib). J. Med. Chem. 40，1347 (1997).

12) Talley, J. J., Brown, D. L.，Carter, J. S., Graneto, M. J., Koboldt,

C. M.，Masferrer, J. L.，Perkins, W E., Rogers, R. S., Shaffer, A. F., Zhang, Y. Y., Zeifel B. S. and Seibert, K. : 4-[5-Methyl-3- phenylisoxazol-4-yl]benzenesulfonamide, Valdecoxib: A potent and selective inhibitor of COX-2./ Med. Chem. 43, 775 (2000).

13) Prasit, R, Wang, Z.，Brideau, C., Chan, C. C., Charleson, S., Cromlish, W., Ethier, D.，Evans, J. E, Ford-Huchinson, A. W, Gauthier, J. Y., Gordon, R., Guay, J., Gresser, M .’ Kargman, S., Kennedy, B., Leblanc, Y., Leger, S., Mancini, J., O'Neil, G. R, Ouellet, M.，Percival, M. D.，Perrier, H., Reindeau, D., Rodger, I., Tagari, R, Therian, M.，Vickers, E, Wong, E.，Xu, L. J., Visco, D. and I심trick, D .: The discovery of Rofecoxib. [MK-996, Vioxx, 4-(4'-Methylsulfonylphenyl)-3-phenyl-2(5H)-furanone] • An orally active cyclooxygenase-2 inhibitor. Bioorg. Med.

Chem. Lett. 9, 1773 (1999).

14) Lee, S., Soyoola, E.’ Chanmugam, R, Hart, S., Sun, W, Zhong, H.，Liou, S., Simmons, D. and Hwang, D. : Selective ex- presstion of mitogen-inducible cyclooxygenase in macrophages stimulated with lipopolysaccaride. J. Biol Chem. 267，25934 (1992).

15) Noh, M., Ha, J., Lee, C., Lee, W, Lee, S. and Lee, J . : Inhibitory activities of natural products on lipopolysaccaride induced prostaglandin production in mouse macrophages. Yakhak Hoeji 42，558 (1998).

16) Dray, E, Mamasd, S. and Bizzini B .: Problems of PGE antisera specificity. Meth. Enzymol. 86，258 (1982).

17) Xie, W, Chipman, J. G.’ Robertson, D. L., Erikson, R. L. and Simmons, D. L. : Expression of a mitogen-response gene encoding prostaglandin synthetase is regulated by mRNA splicing. Proc. Natl Acad. Sci. U.SA. 89，3917 (1992).

18) Tsuji, K., Nakamura, K.，Konishi, N., Tojo, T., Ochi, T, Senoh, H. and Matsuo, M .: Synthesis and pharmacological properties of 1,5-diarylpyrazoles and related derivatives. Chem. Pharm.

Bull. 45, 987 (1997).

19) O'Banion, M. K.，Sadowski, H. B., Winn, V and Young, D. A. : A serum and glucocorticoid regulated 4 kilobase mRNA ecodes a cyclooxygenase related protein. J. Biol. Chem. 266，

23261 (1991).

20) Kalgutkar, A. S., Marnett, A. B., Crews, B. C., Remmel, R. P and Marnett, L. J. : Ester and amide derivatives of the nonsteroidal antiinflammatory drugs, Indomethacin, as selective cyclooxygenase-2 Inhibitors. J. Med. Chem. 43，2860 (2000).

21) Khanna, I. K.，Yu, Y, Huff, R. M., Weier, R. M.，Xu, X.，Koszyk, F. J., Collins, P W., Cogbum, J. N., Isakson, R C., Koboldt, C.

M., Masferrer, J. L.，Perkins, W. E.，Siebert, K.’ Veenhuizen, A. W., Yuan, J., Yang, D. C. and Zhang, Y. Y. : Selective cyclooxygenase-2 inhibitors: Heteroaryl modified 1,2-diaryl- imidazoles are potent, orally active antiinflammatory agents./

Med. Chem. 43, 3168 (2000).

J. Pharm. Soc. Korea