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Paclitaxel 전처리를 위한 마이셀 공정에서의 계면활성제 영향
전 금 영 ․ †김 진 현 공주대학교 화학공학부
(접수 : 2008. 6. 17., 게재승인 : 2008. 11. 3.)
Effect of surfactant on the micelle process for the pre-purification of paclitaxel
Keum-Young Jeon and Jin-Hyun Kim†
Department of Chemical Engineering, Kongju National University, Kongju 314-701, Korea (Received : 2008. 6. 17., Accepted : 2008. 11. 3.)
The micelle process was developed for pre-purifying paclitaxel from plant cell cultures of Taxus chinensis, giving a high purity and yield. The approach in this work was to transfer paclitaxel in the crude extract to an aqueous surfactant solution as a micelle, allowing organic solvents to be used for removal of lipids and non-polar impurities. In this work, the effects of various surfactants such as CPC, CTMAC, LTMAC, SDS, AOT, Tween, PEG, and Triton were examined on the yield, purity, and phase separation time in micelle process. Among these surfactants, CTMAC (5%, w/v) gave the best result in terms of paclitaxel yield (~99%), purity (~21%), and phase separation time (30 min). The use of micelles in the pre-purification process allows for rapid and efficient separation of paclitaxel from interfering compounds and dramatically increases the yield and purity of crude paclitaxel for subsequent purification steps.
Key Words : Paclitaxel, pre-purification, surfactant, micelle process
서 론
1)
Paclitaxel은 diterpenoid 계열의 항암물질로 난소암, 유방암, 카포시 종양 (kaposi's sarcoma), 비소세포성 폐암 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 치료에 대해 FDA허가를 취득하여 현재 가장 많이 사용 되고 있는 항암제이다(1). 류마티스성 관절염, 알츠하이머 치료 등의 적응증이 계속 확대되고 있으며, 또한 여러 다른 치료 방법들과의 복합처방에 관한 임상시험이 진행 중에 있어 향후 paclitaxel 수요는 계속 늘어날 전망이다(2). Paclitaxel의 주요 생산 방법에는 주목나무 (yew tree)에서 직접 추출 (extraction) 하는 방법, 주목나무의 잎에서 전구체를 얻어 side chain을 화학적으로 결합하는 반합성 (semisynthesis) 방법, 주목나무에서 유도된 식물세포를 배양하여 얻는 방법 등이 있다(3-5). 식물 세포 배양 방법은 기후, 환경 등의 외부 인자에 의한 영향을 받지 않고 생물반응기 내에서 안정적으로 생산이 가능하기 때문에 일정 한 품질의 paclitaxel을 대량 생산할 수 있다는 장점이 있다.
†Corresponding Author : Department of Chemical Engineering, Kongju National University, Kongju 314-701, Korea
Tel : +82-41-850-8642, Fax : +82-41-858-2575 E-mail : [email protected]
식물세포배양으로부터 paclitaxel을 생산하기 위해서는 여러 단계의 분리 및 정제 공정을 거치게 된다. 일반적으로 세포배양 액으로부터 회수한 식물세포 (biomass)를 유기용매로 먼저 추출 하고, 전처리 공정을 거쳐 최종 정제를 통하여 제품을 생산하는 공정으로 이루어져 있다(6-8). 이 과정에서 특히 전처리 공정은 최종 정제 비용에 많은 영향을 미친다. 기존의 연구들(9-11)은 정제를 위한 전처리 공정으로 고가의 크로마토그래피를 이용하고 있거나 전처리 없이 추출을 거친 crude 제품을 HPLC (high performance liquid chromatography)에 의해서 바로 최종 정제하여 경제적 측면에서 많은 문제가 있으며 또한 scale-up에 많은 어려움 이 따른다. 대체로 biomass로부터 유기용매를 이용하여 paclitaxel 을 추출하면 순도는 0.5% 이하이며, 간단한 전처리 공정 후에도 1-4% 정도의 순도로 매우 낮다. 이러한 시료를 바로 HPLC에 의하 여 최종 정제할 경우 많은 양의 유기용매 사용, column packing material (resin)의 수명 단축, 처리량 감소 등 상당히 비경제적 이며 대량 생산을 위한 공정으로는 적합하지 않다. 전처리 공정을 통하여 시료의 순도를 가능하면 높여 주어야 최종 정제, 특히 HPLC를 이용한 정제에서의 비용을 줄일 수 있다. 본 연구에서는 전처리 공정으로 계면활성제 (surfactant)를 이용한 마이셀 (micelle) 공정을 개발하였으며, 특히 마이셀 공정에서의 계면활성제 영향 에 대해 조사하였다. 이러한 연구는 기존의 정제공정 개선효과 한국생물공학회지 제23권 제6호
Korean J. Biotechnol. Bioeng.
Vol. 23, No. 6, 557-560(2008)
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뿐만 아니라 많은 이차대사산물의 정제공정에 응용 가능하여 그 파급효과 매우 클 것으로 판단된다.
재료 및 방법
식물세포 배양
본 실험에 사용된 식물세포 배양액은 Taxus chinensis의 잎으로 부터 얻은 세포주 (cell line)을 이용하여 배양하였다(12). 배양액 으로부터 식물세포 회수를 위하여 데칸더 원심분리기 (Westfalia, CA 150 Clarifying Decanter)를 이용하였으며, 식물 세포조각 (debris) 회수를 위하여 고속 원심분리기 (α-Lavel, BTRX 205 GD-35 CDEFP)를 사용하였다. 회수한 식물세포와 세포조각을 합하여 biomass라 하였다. 본 연구에 사용된 biomass는 (주)삼양 제넥스로부터 제공받았다.
Paclitaxel 분석
HPLC (Waters)를 사용하여 paclitaxel의 함량을 분석하였으며 모든 분석 시료는 3개씩 취하여 분석 후 평균값으로 함량을 결정하였다. 분석에 사용한 column은 Capcell Pak C
18UG 120 (250 mm×4.6 mm, Shiseido, Japan), column 온도는 40℃, 이 동상은 acetonitrile/water (65/35~35/65, v/v gradient), 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 20 µL 이며, UV (227 nm) detector 를 사용하였다(6). Paclitaxel 표준물질은 Sigma-Aldrich 제품 (순도：95%)을 사용하였다.
시료제조 및 마이셀 공정
식물세포배양액으로부터 회수한 biomass와 methanol의 비율 을 1/1 (w/v)로 하여 실온에서 30 min 동안 추출/여과하고, biomass에 새로운 methanol을 첨가하여 동일한 방법으로 4회 반복 하여 추출을 수행하였다. 추출 여액을 모아 농축기 (CCA-1100, EYELA, Japan)에서 농축 (원액의 30%)하고 농축액에 methylene chloride를 첨가 (농축액의 25%)하고 실온에서 30 min 동안 액/액 추출을 3회 반복 수행하여 극성불순물을 제거한 후에 마이셀 공정에 이용하였다(6). 액/액 추출로부터 얻은 추출물 (paclitaxel 순도：6%)을 유기용매인 MtBE (methyl-t-butyl-ether)에 녹인 후 계면활성제 용액과 hexane을 넣고 실온에서 교반하였다. 일정 시간 교반 후 정체시켜 마이셀 형성과 상 분리를 유도하고 상 분리가 일어나면 마이셀이 형성되어 있는 하층 (bottom phase)인 계면활성제 용액 층을 회수하였으며 동일한 조건으로 4회 반복 실험을 수행하였다. 4회 반복실험을 통하여 회수한 계면활성제 용액에 다시 MtBE를 넣어 계면활성제 용액으로부터 마이셀을 분해시켜 줌으로써 paclitaxel은 상층인 MtBE 층으로 회수되며 동일한 방법으로 4회 반복 실험을 수행하여 계면활성제 층으로부 터 paclitaxel을 회수하여 농축하였다. 진공오븐 (UP-2000, EYELA, Japan)에서 24시간 건조시킨 후 HPLC로 분석하였다. Paclitaxel 전처리를 위한 마이셀 공정의 원리 및 개략도를 Fig. 1에 나타 내었다. 본 실험에서 양이온 계면활성제로 N-cetylpridinium chloride (99%, Acros, USA), hexadecyltrimethylammonium chloride (99%, Acros, USA), dodecyltrimethyammonium chloride (98%, Acros, USA)를 사용하였고, 음이온 계면활성제로 sodium dodecyl sulfate (99%, Acros, USA), sodium dioctyl sulfosuccinate (98%, Acros,
USA)를 사용하였으며, 비이온 계면활성제로는 Tween 80 (Samchun Pure Chemical Co., Korea), polyethylene glycol 6000 (99%, Samchun Pure Chemical Co., Korea), Triton X-100 (Sigma-Aldrich, USA)을 각각 사용하였다.
Figure 1. The principle of micelle process for the pre-purification of paclitaxel.
결과 및 고찰
본 연구에서 제안한 전처리 공정은 계면활성제를 이용한 마이셀 형성과 상 분리에 의하여 불순물을 제거하는 새로운 개념의 전처리 공정이다(Fig. 1). 마이셀은 친수성 그룹 (hydrophilic group)과 소수성 그룹 (hydrophobic group)으로 구성되어 있어 마이셀 내부 로는 물에 녹지 않는 paclitaxel을 소수성 그룹이 감싸게 되고 외부는 친수성 그룹이 되어 수용액에 용해될 수 있게 된다.
따라서 식물세포인 biomass로부터 유기용매 추출액을 건조하여 상 분리에 적합한 유기용매에 녹인 후 마이셀 형성에 적합한 계면활성제를 첨가하고 교반하여 정체시키면 물에 녹지 않는 paclitaxel이 마이셀 내부의 소수성 그룹에 감싸여 수용액 상로 이동하고 paclitaxel을 제외한 여러 가지 불순물들 (특히 lipid 성분들)은 유기용매 phase에 그대로 존재하게 되어 paclitaxel과 불순물을 효율적으로 분리하게 된다. 본 실험에서는 분리/정제 에 많이 쓰이는 대표적인 양이온, 음이온, 비이온 계면활성제에 대한 실험을 수행하였다. 양이온 계면활성제는 N-cetylpridinium chloride (CPC), hexadecyltrimethylammonium chloride (CTMAC), dodecyltrimethyammonium chloride (LTMAC)를 사용하였고, 음이온 계면활성제는 sodium dodecyl sulfate (SDS), sodium dioctyl sulfosuccinate (AOT)를 사용하였으며, 비이온 계면활성제 로는 Tween 80, polyethylene glycol 6000 (PEG-6000), Triton X-100 (TX-100)을 각각 사용하였다.
양이온 (CPC, CTMAC, LTMAC), 음이온 (SDS, AOT), 비이온 (Tween 80, PEG 6000, TX-100) 계면활성제 농도가 마이셀 공정에서 paclitaxel 수율, 순도, 상 분리 시간에 미치는 영향을 확인하였다. 양이온 (CPC, CTMAC, LTMAC) 계면활성제의 농도 에 따른 paclitaxel 수율과 순도는 Fig. 2에 나타내었다. 양이온 계면활성제의 농도가 증가할수록 paclitaxel의 수율과 순도가 증가하여 5% (w/v)일 때 최대치를 보였다. 특히 CTMAC 5% (w/v) 에서 가장 높은 수율 (~99%)을 얻을 수 있었다. 순도의 경우, 세 가지 종류의 계면활성제 모두 농도 5% (w/v) 이상에서 21%
정도로 비슷한 경향을 보였다. 또한 상 분리에 소요되는 시간은
CPC와 LTMAC의 경우에는 1 hr 정도 소요되는 반면 CTMAC의
경우 30 min 정도 소요되어 상대적으로 빠른 시간 내에 상 분리
559 Jeon, K. Y., Effect of surfactant on the micelle process for the pre-purification of paclitaxel
가 이루어짐을 알 수 있었다.
Figure 2. Effect of cationic surfactant concentration on the yield (A) and purity (B) of paclitaxel.
Figure 3. Effect of anionic surfactant concentration on the yield (A) and purity (B) of paclitaxel.
음이온 (SDS, AOT) 계면활성제의 농도에 따른 palcitaxel 수율, 순도를 Fig. 3에 나타내었다. AOT 용액은 1% (w/v) 이상의 농도 에서는 계면활성제가 물에 용해되지 않아 마이셀 공정에 활용 하기 어려움을 알 수 있었다. 반면 SDS의 경우 계면활성제 농도 증가에 따라 수율 및 순도가 증가하다 5% (w/v) 이상에서는 거의 변화가 없음을 알 수 있었다. 또한 상 분리에 소요되는 시간
은 1.5 hr 정도로 양이온 계면활성제에 비해 상 분리에 더 많은 시간이 소요되었다. 마이셀 공정에서 계면활성제의 농도가 증가 할수록 마이셀 내부에 paclitaxel을 감싸 수용액 상으로 잘 이 동시키는 반면 마이셀 형성과 상 분리 후 수용액 상으로부터 paclitaxel을 다시 회수할 때 어려움이 있어 최적의 농도가 존재 하는 것으로 판단된다(6).
비이온 계면활성제 (Tween-80, PEG-6000, TX-100)의 경우 Fig. 4에서 보는 바와 같이 수율 및 순도 측면에서 각각 30%, 10% 이상 증가하지 못할 뿐만 아니라 1% (w/v) 이상의 농도에서는 계면활성제가 물에 용해되지 않고 상 분리에도 많은 시간 (2~4 hr)이 소요되어 마이셀 공정에 활용하기 어려 움을 알 수 있었다.
Figure 4. Effect of nonionic surfactant concentration on the yield (A) and purity (B) of paclitaxel.
계면활성제 혼합에 따른 영향을 확인하기 위하여 양이온과
비이온 계면활성제, 음이온과 비이온 계면활성제를 각각 혼합
하여 실험을 수행하였다. 최적 혼합비율을 결정하기 위해 양이온
계면활성제 CPC (5%, w/v)와 비이온 계면활성제인 Tween 80
(1%, w/v)을 선정하여 두 용액을 각각 1/1.5, 1/1, 1.5/1 (v/v)로
혼합하여 실험을 수행하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이 혼합
비율이 1/1 (v/v)일 경우 가장 높은 수율 (98.1%)과 순도 (19.9%)
를 얻을 수 있었다. 양이온, 음이온 계면활성제에서 수율, 순도
가 좋았던 CTMAC (5%, w/v), CPC (5%, w/v) 및 SDS (5%, w/v)
를 비이온 계면활성제 Tween 80 (1%, w/v)과 각각 1/1 (v/v)
비율로 혼합하여 실험을 수행하였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이
수율 및 순도 측면에서 혼합계면활성제 CPC/Tween 80는
98.1%, 19.9%, CTMAC/Tween 80는 99.0%, 18.4%, SDS/Tween
80는 96.9%, 18.0%를 각각 나타내었다. 또한 양이온, 음이온
계면활성제 단독으로 마이셀을 형성하여 상 분리되는데 소요
되는 시간 (0.5~1.5 hr)에 비해 혼합계면활성제에 의해 마이셀
형성 및 상 분리되는데 소요되는 시간 (0.5 hr)이 짧아 혼합
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계면활성제에 의한 마이셀 공정에서 상 분리 시간이 단축됨을 알 수 있었다. 이러한 현상은 혼합계면활성제에 의한 마이셀 형성 시 마이셀 표면에 존재하는 서로 다른 종류 혹은 같은 종류의 계면활성제 분자들의 친수성 그룹들 사이에는 정전기 적 인력 또는 반발력이 생기게 되며, 또한 내부에 존재하는 소수성 그룹들 사이에는 소수성 인력이 작용하는데 이들 세기 에 따라 혼합계면활성제의 마이셀화가 촉진되거나 저하되는 것 으로 판단된다(13-15).
Figure 5. Effect of CPC (7.5%, w/v)/Tween 80 (1%, w/v) ratio on the yield and purity of paclitaxel.
Figure 6. Effect of mixed surfactant on the yield and purity of paclitaxel.
요 약
본 연구에서는 식물세포배양으로부터 항암제 paclitaxel 정제 를 위한 전처리 공정으로 계면활성제 (surfactant)를 이용한 마이셀 (micelle) 공정을 개발하였으며, 특히 마이셀 공정에서의 계면 활성제 영향에 대해 조사하였다. 마이셀은 친수성 그룹과 소수 성 그룹으로 구성되어 있어 마이셀 내부로는 물에 녹지 않는 paclitaxel을 소수성 그룹이 감싸게 되고 외부는 친수성 그룹이 되어 수용액에 용해될 수 있게 된다. 따라서 식물세포인 biomass 로부터 유기용매 추출액을 건조하여 상 분리에 적합한 유기용매 에 녹인 후 마이셀 형성에 적합한 계면활성제를 첨가하고 교반 하여 정체시키면 물에 녹지 않는 paclitaxel이 마이셀 내부의 소수 성 그룹에 감싸여 수용액 상로 이동하고 paclitaxel을 제외한 여러 가지 불순물들 (특히 lipid 성분들)은 유기용매 상에 그대로 존재하게 되어 paclitaxel과 불순물들을 효율적으로 분리하게 된다.
본 실험에서는 분리 및 정제에 많이 쓰이는 대표적인 양이온 (CPC, CTMAC, LTMAC), 음이온 (SDS, AOT), 비이온 (Tween, PEG, Triton) 계면활성제의 영향에 대한 실험을 수행하였다.
양이온 계면활성제인 CTMAC (5%, w/v)을 이용한 마이셀 공정 에서 가장 높은 수율 (~99%)과 순도 (~21%)를 얻었으며 또한 마이셀 형성 후 상 분리에 30 min 정도 소요되어 가장 단시간에
상 분리가 이루어짐을 알 수 있었다. 전처리 공정에서의 마이셀 형성 및 상 분리 방법은 불순물로부터 효과적으로 높은 순도의 paclitaxel을 고수율로 회수할 수 있어 최종 정제를 위한 전처리 공정으로 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
감 사
