방사선에 의한 고환 손상에 대한 별갑 추출물의 보호 효과

Original Article

Abstract

We evaluated the effect of Byeol-Gab Extract (BGE) on testicular injury in the mouse after radiation exposure. BGE (50 mg/kg) was administrated to male C57BL/6 mice by P.O for ten days before radiation exposure, and histological parameters were assessed at 6 h and 35 days post 5 Gy irradiation.

The BGE attenuated radiation-induced apoptosis in germ cells after 6 h after irradiation. BGE protected testicular morphological changes, such as changes in seminiferous epithelial height after radiation exposure. BGE treatment significantly increased testis weight compared with irradiation controls at 35 days. The present study suggests that BGE attenuates radiation-induced testicular injury via an anti-apoptotic effect and recovery of spermatogenesis.

서론

방사선 치료는 암 치료를 목적으로 가장 널리 사용되는 치료방법이다. 방사선 치료는 전리작용을

방사선에 의한 고환 손상에 대한 별갑 추출물의 보호 효과

서윤수 선임연구원, 이아영 책임연구원, 송준호 선임연구원, 문병철 책임연구원, 박건혁 선임연구원, 임혜선 기술연구원, 김중선 선임연구원

한국한의학연구원 한약자원연구센터

Protective effect of Byeol-Gab (Pelodiscis Carapax) extract in radiation-induced testicular injury

Yun-soo Seo, A Yeong Lee, Jun-Ho Song, Byeong Cheol Moon, Gun Hyuk Park, Hye-Sun Lim, Joong-Sun Kim

Herbal Medicine Resources Research Center, Korean Institute of Oriental Medicine

Correspondence: 김중선(Joong Sun Kim)

111 Geonjae-ro, Naju-si, Jeollanam-do, Rep. of Korea Tel: +61-338-7111, E-mail: [email protected]

Received 2019-10-17, revised 2020-01-29, accepted 2020-01-29, available online 2020-01-30 doi:10.22674/KHMI-8-1-2

Keywords: Byeol-Gab (Biejia, Pelodiscis Carapax), Testis, Radiation, Apoptosis, Mice

통해 세포 내의 핵산의 손상을 유발하며 이로 인한 세포의 사멸을 유도한다. 그러나 방사선은 암세포뿐 아니라 세포분열이 활발한 정상세포에도 손상을 입히기 때문에 다양한 부작용을 동반하게 된다. 여러 장기(臟器) 중 고환은 방사선에 가장 민감한 장기 가운데 하나로 고환의 정조세포는 활발한 세포분열 작용으로 인해 0.1 Gy 의 매우 낮은 선량의 방사선 노출에도 손상을 입는 것으로 알려져 있으며, 0.35 Gy 의 저선량 방사선에 의해 유의적인 정자생성 억제를 유도하여 환자의 성기능에 장애를 야기시키며 불임을 초래하는 것으로 보고되어 있다

.

인체 기관의 55~80%를 차지하는 물은 산소가 있는 환경에서 방사선 조사에 의해 슈퍼옥사이드 이온, 과산화수소, 하이드록시 라디칼과 같은 활성산소를 생성한다

. 이때 발생하는 산화적 스트레스는 남성 불임의 중요 인자 중 하나로, 정자형성 중 유사분열과 감수분열 과정에 특히 치명적으로 작용하는 것으로 알려져 있다

. 정상적인 환경에서는 항산화 효소, 유리 라디칼 제거제 및 낮은 산소 장력을 통해 산화적 스트레스로부터 생식세포의 분열과정을 보호하지만 다양한 외인성, 내인성 인자의 영향으 로 이러한 방어체계가 교란되어 남성 불임이 발생한다

. 이렇듯 방사선에 의해 유발되는 생식장애를 치료하기 위한 방법으로 방사선의 전리작용에 의해 발생하는 유리 라디칼을 제거하는 것이 주요한 표적으로 알려져 있다

.

방사선에 의한 고환 손상 보호 약물 연구는 여러 방면으로 시도되고 있으며, 다양한 후보 약물이 거론되고 있으나, 독성 및 부작용이 심하고 높은 가격으로 임상적으로 만족스러운 결과를 얻지 못하고 있다. 방사선에 의한 부작용을 보호하는 약물로 FDA 의 승인을 받은 약물은 Amifostine 과 G-CSF 만 이 있으나 Amifostine 은 침샘에서만 승인되었고, G-CSF 는 골수에서의 보호작용으로 승인을 받았을 뿐 고환에 방사선 보호 약물로 승인받은 약물은 현재 없는 실정이다

. 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 천연소재를 이용한 방사선 방호 효과에 대한 연구가 진행되고 있으며, 새로운 방사선 보호 약물의 개발을 통해 암 치료에 복합제로의 사용 이외에도 다양한 방사선 노출사고 상황에 적용이 가능 할 것으로 판단된다

.

별갑(鱉甲)은 자라과(Trionychidae)에 속한 동물인 자라[ Pelodiscus sinensis (Wiegmann, 1835)]의 등판을 취하여 殘肉을 제거하고 曬乾하거나 砂炒하여 사용한다. 별갑의 한의학적 통합 정보를 살펴보 기 위해 오아시스(OASIS) 전통의학정보포털 내 K-herb network (https://oasis.kiom.re.kr/kme- di/main.jsp)를 이용하여 분석해 본 결과, 性味가 微寒, 鹹하고 軟堅散結, 滋陰潛陽하는 효능이 있어 陰虛發熱, 骨蒸勞熱, 虛風內動, 癥瘕, 經閉, 久瘧瘧母에 사용되어 왔다

. 방사선은 한의학적으로 熱毒의 일종으로 인식되며, 방사선 노출에 의해 발생하는 다양한 부작용들은 火熱毒邪에 의해 津液이 耗損되어 나타나는 것으로 해석된다

. 본 연구에서는 陰虛로 인한 熱證을 치료하는 별갑을 활용하 여 방사선 조사에 의해 유도된 mouse 의 고환손상에 대한 별갑의 보호효과를 확인하기 위해 수행되었 으며, 정자형성의 보호와 회복 효과에 대해 얻어진 결과를 보고한다.

본론

1. 재료 및 방법

1) 공시동물

실험에 사용한 동물은 C57BL/6 마우스로 중앙실험동물에서 공급하는 7~8 주령의 21~25g 내외의

수컷을 일주일간 순화시킨 후 사용하였다. 동물사양은 원자력의학원의 동물 사양실 clean room 에서

Auto controller 에 의해, 온도 22±1℃, 습도 50±10%, 조명시간 12:12 Light/dark cycle 의 조건에서

이루어 졌으며, 멸균된 사료와 3 중 filter 로 정수한 물을 함께 공급하였다. 본 실험은 한국한의학연구 원 동물실험 윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(승인번호:19-038).

2) 방사선 조사

실험동물을 12 마리씩 2 개의 군으로 나누어 방사선 조사를 진행하였다. 방사선 조사를 용이하게 하 기 위해 알팍산과 Xylazine 을 합제로 복강주사하여 전신마취를 유도한 후 방사선을 조사하였다. 방사 선 조사군은

Co 감마선을 이용하여 3.51/Gy min 의 선량율로 5 Gy(85.4 sec)를 전신 조사하였으며 대조군은 같은 과정을 수행하였으나 감마선원을 제공하지 않았다. 방사선에 의한 세포사멸과 고환의 조직학적 변화를 확인하기 위해 조사 후 6 시간, 35 일째에 각 군에서 무작위로 6 마리씩을 선별하여 이산화탄소로 희생시킨 후 실험을 진행하였다.

3) 별갑 추출물의 제조 및 투여

실험에 사용된 별갑은 광명당제약(울산)에서 구입하였으며, 최고야 박사(한국한의학연구원)의 형태 감별을 거쳐 실험에 사용되었다(Fig. 1). 표본은 한국한의학연구원에 보관 중이다(specimen no. 2–14 –0119). 별갑 971.57g 을 잘게 절단하여 증류수 5L 를 넣고 100℃에서 3 시간 환류추출 후, 이 과정을 3 회 반복하여 얻어진 추출물을 감압농축기를 사용하여 45℃에서 농축 후 동결건조기를 이용하여 추출 물 36.95g 을 제조하였다(수득율 3.80%, w/w). 방사선 조사군은 별갑 추출물을 체중당 50mg/kg 의 용량으로 식염수에 녹여 1 일 1 회 경구 투여하였으며, 대조군에는 식염수를 1 일 1 회 경구 투여하였 다. 투여는 방사선 조사 9 일 전부터 조사 당일까지 10 회 투여하였다.

Fig. 1. Morphological characters of Byeol-Gab (Biejia, Pelodiscis Carapax) and main target and efficacy in Korean traditional medicine correlation network using Oriental Medicine Advanced Searching Integrated System (OASIS).

4) 별갑의 이화학적패턴분석과 항산화성분 스크리닝

별갑 물추출물 108.18 mg 을 5 mL 의 증류수에 녹여 검액으로 사용하였다. 이화학패턴 분석 및 항산 화능 측정은 HPLC-Reactor 장비를 이용하였다. 이 장비의 구성은 Waters Alliance e2695 separatuin module, 2998 PDA detector 2 대, post column reaction module, In-line degasser AF, Reagent

(A) (B)

manager (이상 Waters, USA), Adjust split ratio (ASI, USA)로 구성되어 있다. 분석에 사용한 컬럼은 Luna C18(2) (4.6 × 250 mm, 5 μm, Phenomenex, USA)였고, 분석용매는 0.5% formic acid 가 포함된 증류수(A)와 acetonitrile (B)이었다. 용매는 100% A 에서 50% A 로 30 분간 용매 기울기에 따라 변화 를 주었으며, 유속은 0.8 mL/min, 주입량은 10 μL 이었다. 7.4 mM 2,2′-Azinobis-(3-ethylbenz thia- zoline-6-sulphonate 와 2.6 mM potassium persulfate 를 혼합하여 12 시간 냉암소에서 반응하여 ABTS

을 생성한 후에 사용하였다. ABTS

용액은 0.8 mL/min 의 유속으로 37℃에서 반응하였다.

UV 파장은 254 nm 에서 성분 분리를, 734 nm 에서 항산화반응을 모니터링하였다. 734 nm 에서 neg- ative 로 검출되는 peak 이 항산화 효능이 있는 성분이었다.

5) Apoptosis 측정

Apoptosis 의 평가를 위한 군은 방사선 조사 6 시간 후에 희생하여 관찰하였으며, 고환을 적출하고 10% 포르말린에 고정하여 일반적인 방법에 따라 파라핀 포매 후에 절편을 만들어 Apoptosis 의 변화 를 측정하였다. Apoptosis 측정을 위하여 insitu apoptosis detection kit (Apoptag kit, Chemicon International, Temecula, CA, USA)를 사용하였다. Insitu DNA end labeing transferase 를 첨가하여 fragmented DNA 에 digoxigenin-nucleotide 를 부착시키고 anti-digoxigenin-peroxidase anti- body 를 면역염색법으로 결합시킨 후 diaminobenzidine (Sigma chemical Co., St. Louis, USA)를 사 용하여 peroxidase enzyme 부위를 발색시켰다. 조직 샘플에 있는 정세관은 광학현미경을 이용하여 관찰하였다.

6) 마우스 고환 중량

고환 및 정자의 변화를 평가하기 위해 방사선 조사 35 일 후에 마우스를 희생하였으며, 희생 전에 마우스 의 부검 시 고환 및 부고환을 적출하여 중량을 측정한 후 우측 고환과 우측 부고환을 10% buffered 포르말 린 용액에 고정하여 조직학적 분석에 사용하였다.

7) 조직병리학적 평가 – 정세관 상피 두께 및 정세관 직경 측정

방사선 조사 후 35 일에 희생시킨 마우스의 우측 고환과 부고환을 조직처리 과정을 거쳐 파라핀 포매를 하였다. Microtome 으로 4 μm 두께로 박절한 다음 H&E 염색을 하고, 광학현미경을 이용하여 조직학적 변화를 관찰하였다.

정세관 상피 두께 및 정세관 직경을 측정하여 조직병리학적인 변화를 정량화하였다. 그룹의 각 동물에서 30 개의 관을 측정하여 세정관의 지름과 상피 깊이는 고환 부분의 각 세정관으로부터 얻은 값에서 결정되었다.

8) 세포 배양 및 세포 생존률 측정

본 실험에 사용된 세포인 bone marrow-derived mouse stromal cells, OP9 세포는 American Type

Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 세포는 항생제 및 항균제

로서 100 U/mL 의 페니실린과 100 μg/mL 의 streptomycin 을 첨가하고 20% FBS 을 첨가한 α-MEM 배

지에서 5% CO

의 습한 대기, 37℃의 온도조건으로 배양하였다. 별갑 추출물의 산화적 스트레스에 대한

보호 효과를 확인하기 위해 과산화수소 처리 후 세포 생존률을 확인하였다. 간단히 기술하자면, OP9 세포

에 별갑 추출물(5, 10, 50, 100 μg/mL)과 과산화수소(500 mM)를 각각 처리하여 24 시간 배양한 후 각

well 에 MTS 용액을 1 mg/mL 농도가 되도록 처리하여 발색 정도를 microplate reader 를 이용하여 490

nm 에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성(cell toxicity)은 세포만 배양한 무 처리군의 생존도 100%를 기준 으로 상대적인 세포 생존율을 계산하였다.

9) 활성산소종(ROS) 측정

세포 내 ROS 는 DCF-DA 를 사용하여 측정하였다. OP9 세포에 별갑 추출물(5, 10, 50, 100 μg/mL)과 과산화수소(1 mM)를 각각 처리하여 24 시간 배양한 후 세포를 PBS 로 세척하여 100 μM DCF-DA 처리 후 37℃에서 30 분간 반응시켰다. DCF-DA 를 제거한 다음 세포를 다시 PBS 로 세척한 후 형광현미경을 이용하여 세포내 DCF 의 양을 관찰하였다. 형광 강도는 microplate reader 를 사용하여 excitation wave- length 485 nm, emission wavelength 520 nm 에서 측정하였다.

10) 통계처리 방법

보고된 data 는 평균값이고 다수의 비교를 위해 student-Newman-Keuls post hoc test 에 의한 one-way ANOVA 를 사용하여 분석하였다. 모든 경우에, p < 0.05 값은 크게 고려되었다.

2. 결과

1) 별갑 추출물의 이화학패턴 분석

별갑의 물추출물의 이화학 패턴분석을 실시한 결과, 254 nm 에서 추출물의 이화학적 프로파일을 나타내고 있다. 주성분은 8.2 분, 9.5 분, 10 분에서 검출되는 3 성분이었다. 그 외에 3.8 분, 6.5 분, 10.9 분, 13.5 분에서 성분이 검출되었다. 734 nm 은 ABTS

용액과 반응한 각 성분들의 항산화능을 나타낸 크로마토그램이다. 이 반응에서는 청록색의 ABTS

용액을 검출하게 설정하였으며, 반응 후, 항산화

Fig. 2. On-line HPLC pattern analysis and antioxidant activity screening; The first “positive” chromatogram represented at 254 nm, the second “negative” chromatogram showed as antioxidant activity screen- ing by ABTS^+• and * confirmed as antioxidant compounds.

효과를 나타내면 청록색이 탈색되어 흰색을 나타내기 때문에 크로마토그램에서 negative peak 을 나 타내게 된다. 3.8 분과 13.5 분에서 검출된 성분은 ABTS

반응에서 negative peak 을 나타내어 항산화 능이 있는 성분임을 확인하였다(Fig. 2).

2) 별갑 추출물의 항산화 효과

별갑 추출물의 항산화 활성을 확인하기 위해 DCFDA 염색법을 사용해서 세포 내의 활성산소종의 양을 확인하였다. 1 mM 과산화수소의 처리에 의해 급격하게 증가하였던 세포 내 활성산소의 양이 별갑 추출물 투여시 농도의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 500 mM 과산화수소의 처리에 의해 감소하였던 세포 생존률 역시 별갑 추출물 50 μg/mL 과 100 μg/mL 처리군에서 유의적으 로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 앞서 이화학분석을 통해 확인한 별갑 추출물 내의 항산화 성분이 in vitro 상에서도 유의적인 효과를 보임을 알 수 있었다.

Fig. 3. Antioxidant effects of ByeolGab extracts (BGE) on H2O2-induced oxidative stress in OP9 cells.

Intracellular reactive oxygen species were evaluated using DCFDA assay. (A) Fluorescence microscopic image of treated cells and (B) fluorescence intensity measurement in OP9 cells treated with or without BGE. (C) The viability of OP9 cells was determined by MTS assay. *p<0.05, as compared with the value for the untreated cells were determined determined using unpaired t-test (n=3). #p<0.05, #p<0.01 and #p<0.005, as compared with the value for the H2O2-treated cells were determined via analysis of variance followed by Tukey's test for multiple comparisons (n=3).

3) 별갑 추출물의 세포사멸 억제 효과

별갑 추출물의 항산화 활성이 방사선에 의해 유도되는 정조세포의 세포사멸에 대해 미치는 영향을 확인하기 위해 방사선 조사 6 시간 후 조직 내 세포사멸 정도를 확인하였다. Apoptotic cell 은 대부분 정조세포에서 관찰되었으며 ISEL 염색에서 양성의 세포 및 apoptotic body 가 관찰되었다(Fig. 4).

Apoptotic body 는 방사선 조사 후 정상대조군에 비해 방사선 단독 조사군에서 증가하는 양상을 확인

할 수 있었으며, 별갑 병행 투여시 apoptotic body 가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는

별갑 추출물이 apoptosis 에 의한 세포사를 감소시켜 방사선장해에 대한 방호효과를 가지고 있음을 의미한다.

Fig. 4. Protective effects of ByeolGab extracts (BGE) on apoptosis in radiation-induced testicular injury mouse model. Apoptotic cells were evaluated using transferase dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay in testis treated with or without BGE at 6 hours after irradiation. Similar results were obtained in three independent experiments and results of one representative experiment are demonstrated. Sham, non-ir- radiated group; IR, irradiated group; IR+BGE, BGE (50mg/kg) pre-treated group.

4) 별갑 추출물의 고환 보호 효과

별갑 추출물의 방사선 방호작용에 따른 고환 보호 효과를 확인하기 위해, 방사선 조사 35 일후 실험동 물의 고환의 무게와 고환과 부고환의 조직학적 변화를 관찰하였다(Fig. 5). 방사선 노출 후 실험기간 동안에 유의적 체중의 변화는 모든 개체에서 관찰되지 않았으나(data not shown), 방사선 단독 조사군 과 별갑 전처리군 모두에서 고환의 크기가 감소하였다. 별갑 투여에 의한 고환의 조직학적 변화를 확인한 결과, 고환의 무게와 마찬가지로 조직 내 정세관의 직경에서는 큰 차이가 관찰되지 않았으며, 고환 상피의 직경은 별갑 추출물 투여 후 방사선 단독 조사군 대비 24.6% 증가한 것을 확인할 수 있었으나 유의성은 확인되지 않았다. 이 같은 결과는 별갑 추출물의 급여가 방사선에 의한 정조세포의 사멸을 억제함으로서 방사선에 의한 조직의 손상을 억제하고 이를 통해 고환내 정자의 생성을 유지한 결과로 생각된다.

3. 고찰

이번 연구에서는 쥐의 전신에 5 Gy 의 방사선을 조사 후 6 시간과 35 일에 고환에서의 세포사멸 및 고환의 조직병리학적인 관찰을 통해 별갑의 보호 효과를 확인하였다.

방사선 조사에 의한 고환의 손상은 골반과 복부에 종양이 있는 환자의 방사선 치료과정에서 항상

노출될 위험이 있다. 이렇게 방사선에 노출된 고환은 불임의 원인이 되며, 특히 방사선에 의한 고환에

정조세포의 세포사멸이 가장 중요한 원인 가운데 하나이다. 방사선 조사에 의한 고환에서의 세포사멸

은 방사선 조사 후 4~12 시간에 가장 증가하며 점차 관찰되지 않는다

. 방사선에 의한 세포 사멸은

B-spermatogonia 에서 주로 일어나며 성숙한 정자에서는 관찰되지 않는다

. 이러한 특성으로 인해

조사 초기에는 정자수의 변화가 관찰되지 않으며, 고환의 크기 변화, 정세관의 감소, 정세관 상피의 변화 역시 나타나지 않지만, 정조세포가 정자로 성숙되는 30 일 무렵에 고환의 크기 감소와 함께 정자 수의 급격한 감소가 관찰된다

. 이 시점에 고환에서 상피의 두께 감소와 더불어 정세관의 크기 역시 크게 감소하며 이러한 지표는 고환 및 정자의 손상을 분명하게 반영하는 지표라 판단된다

. 본 실험 에서 5 Gy 의 방사선을 마우스에 조사한 후 고환의 무게가 감소하였으며, 이는 이전의 보고들과 일치한

Sections of testis (B) and epididymis (C) were stained with haematoxilin and eosin (H&E). (D) Graph showing the histological features of epithelial height of seminiferous tubules. Similar results were obtained in three independent experiments and results of one representative experiment are demonstrated. Data represent the mean ± SEM (n=6). *p < 0.05. Significant differences among the treated groups were determined by analysis of variance followed by Tukey's test for multiple comparisons (n = 6). Sham, non-irradiated group; IR, irradiated group; IR+BGE, BGE (50mg/kg) pre-treated group.

다. 더 나아가, 방사선은 세포 확산에 반대로 영향을 미쳐 정원세포들과 그 이후 생성되는 세대들을 죽이고 소멸시켜 고환 중량 감소로 이어진다. 방사선에 의한 손상 대부분은 주로 ROS 생성으로 생물학 적 체계에서 발생한다. 유리기 생성 억제 또는 그들의 강화된 청소 기능을 이용한 손상 방지는 방사선 방호에 중요하게 여겨진다.

기존에 방사선 보호 방법 가운데 가장 잘 알려진 방법은 항산화 약물이다. 방사선은 강력한 독성물질 로서 산화적 스트레스의 생성, 항산화 기전의 억제, 정조세포의 생존에 영향을 줌으로서 정상고환의 조직학적인 변화를 유발한다

. 방사선에 의한 세포 사멸에 있어서 방사선에 의한 활성 산소의 증가가 가장 중요한 원인으로 알려져 있으며 이러한 활성산소를 줄이는 것이 방사선에 의한 손상을 최소화하 는 방법으로 알려져 있다. 라디칼 소거능을 확인하는 방법은 기존의 많은 한약재에서 항산화 효과를 확인하는데 주로 사용되어 온 방법으로

, 청록색의 ABTS 양이온 라디칼용액이 항산화 성분과 반응 시 라디칼이 소거되며 탈색되는 Van den Berg 법을 변형하여 본 실험에 적용하였다

. 특히, on-lined HPLC-ABTS assay 법은 추출물의 성분프로파일을 확인하는 동시에 각 성분의 항산화능까 지 확인할 수 있는 효과적이며 빠른 스크리닝 방법이다

. 이 방법으로 별갑의 이화학 패턴 및 항산화 능을 확인한 결과, 약 3.8 분과 13.5 분대의 피크가 항산화능을 나타내었으며, 이 성분들로 인하여 별갑 이 항산화 효과를 나타내는 것으로 생각된다. 방사선 조사에 의해 나타나는 산화적 스트레스에 의한 조직의 손상은 주로 세포의 분열이 활발하게 진행되고 있는 stem cell 이나 cancer cell 에서 확인된다.

방사선에 의한 고환 손상 역시도 stem cell 의 일종인 type B spermatogonia 에서 주로 관찰되며, 이러한 특성을 반영하기 위해 가장 일반적인 stem cell 중 하나인 OP9 세포주를 이용하여 별갑 추출물 의 항산화 활성의 교차 검증을 진행하였다

. 그림 3 에서 보는바와 같이 추출물 투여 후 농도의존적인 보호효과를 내는 것을 확인 할 수 있었으며, 이러한 생체 내 산화적 스트레스 억제를 통해 별갑 추출물 이 방사선 보호효과를 나타내는 것으로 생각된다.

방사선 조사 직후 활성산소가 빠르게 생성되며, 이로 인해 세포의 사멸, 세포 분화 억제, DNA 손상 등이 유발된다

. 결과에서 보는 바와 같이 방사선 조사 6 시간 이후 빠르게 증가한 세포사멸은 별갑의 사전투여를 통해 억제되었으며, 이러한 산화적 스트레스의 억제를 통해 초기의 조직손상을 억제하고 정조세포를 보호함으로서 방사선에 의한 부작용을 억제하는 것으로 생각되나, 고환의 상피 직경을 측정해본 결과, 별갑 투여에 의해 보호되는 경향을 보였다.

여성호르몬으로 알려져 있는 에스트로겐류의 물질들은 기존의 연구에서 비타민 C 와 E 에 비해 2.5 배 이상 강력한 활성산소 제거효과를 나타내는 것으로 알려져 있다

. 또한, 에스트로겐은 염증성 인자의 유전자 발현을 억제하며, 세포사멸 인자의 발현을 억제하며

, 남성 생식계에 있어서 지지영 양을 담당하는 세르톨리 세포의 증식과 성장, 기능의 발달을 조절을 통해 정조세포의 사멸과 정자첨체 의 형성에 관여한다. 에스트로겐 수용체 α 와 β 에 의한 신호전달이 정자의 성숙과 유리에 관여하는 것으로 보고되어있다

. 기존 연구에서 estrogen 결핍 골 대사 장애 동물모델에서 별갑의 보호효과를 확인하며 별갑이 가지는 estrogenic effect 를 확인하였으며

, 또 다른 논문에서는 별갑 추출물의 항산화 활성을 확인하였다

. 이전의 성분분석 결과를 보면 별갑내에는 taurine, histidine 을 비록한 다종의 유리 아미노산이 포함되어 있으며, 이중 histidine 은 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 보고되

어 있다

. 하지만 본 연구를 진행하며 실행한 성분분석에서는 추출물내 histidine 이 검출되지 않았

으며, 또한 histidine 의 항산화 활성 역시 확인되지 않았다 (data not shown). 이 같은 결과를 볼

때 본 실험에서 확인한 별갑 추출물의 항산화 활성과 이에 기반한 방사선에 대한 보호효과는 histidine

이외의 성분에 의해 나타나는 것으로 보이며, 이에 대한 추가적인 연구가 필요한 실정이다.

비록 유효성분에 대한 동정과 별갑 추출물에 포함된 성분의 분석과 세부작용 기전에 대한 추가 연구 가 필요하지만, 별갑이 방사선에 의해 생성되는 활성산소의 소거를 통해 조직 손상에 대한 방어 효과를 보이는 것을 확인하였다. 추가로 기존의 연구에서 별갑이 포함된 한약 처방을 이용한 항암 효과가 확인된 바, 방사선 항암치료 과정에서 별갑의 병용투여를 통해 방사선에 의한 치료 효과를 높이고 부작용을 억제하는 병용제제로의 사용이 가능할 것으로 기대된다.

결론

熱毒의 일종인 방사선에 의해 유발되는 고환의 손상에 대해 陰虛로 인한 熱證을 치료하는 별갑의 보호 효과를 확인하고자 하였다.

1. 별갑 추출물이 항산화 활성이 나타나는 것을 확인하였다.

2. 방사선에 의해 발생하는 세포사멸에 대한 별갑 추출물의 보호 효과를 확인하였다.

3. 정조세포의 보호를 통해 고환 및 부고환의 조직병리학적 손상을 억제하는 경향성을 확인하였다.

추후, 성분의 동정을 통한 유효성분의 확인과 에스트로겐 수용체 등 세부 작용기전에 대한 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다.

감사의 글

본 연구는 한국한의학연구원 주요사업 「동의보감 충부약재 활용기반 구축」 과제(KSN1812410)의 지원으로 수행되었습니다.

참고문헌

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