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접수 : 2001년 11월 18일, 수정 : 2002년 2월 23일, 승인 : 2002년 2월 25일
책임저자 : 김정아, 가톨릭의대 성빈센트병원 내과 Tel : 03 1)249- 8456 Fax : 03 1)252- 8456
E- ma il : ja k@vince nt.cuk.ac.kr
서 론
장기이식이 의학의 여러 분야에서 궁극적인 치료 방법으 로 자리잡으면서 이에 대한 수요가 폭발적으로 증가되고 있지만 수요에 비하여 공여장기가 절대적으로 부족 할 뿐 만 아니라 급, 만성 거부반응 및 장기간의 면역억제제 투
치사량 이하의 전신방사선 조사를 이용한 Don or Chim er ism 유도가 동종장기 생착에 미치는 면역학적 관용효과
가톨릭대학교 의과대학 내과1, 조혈모세포연구실2, 성형외과3, 치료방사선과4
김정아1 , 2・홍성열2・최윤석3・김성환4・김춘추1
The Immune Tolerance Effect of Donor Chimerism Induced by Sublethal dose of Radiation on Allogeneic Organ Transplantation
J e ong- A Kim, M.D.1 , 2, S ungyoul Hong2, Yun Se ok Choi, M.D.3, S ung Hwa n Kim , M. D.4, a nd Chun Choo Kim , M. D.1
D ep artm ents of I n t ernal M ed icin e1, H em atop oiet ic S t em Cell T ransp lantat ion L aboratory2, P las t ic S urg ery3 and R ad iat ion Oncolog y4, T he Catholic Un iv ers ity of K or ea, S eoul, K or ea
B ac k g roun d : Tra ns pla ntatio n of so lid orga ns has bee n inc reas ing explos ive ly. Howeve r, nume rous proble ms re ma in uns olved , inc luding the require me nt for c hronic immunos uppress ive the ra py a nd t he s ho rtage of donor orga ns . Rece nt ly one way to ove rcome this is bo ne marrow tra ns pla ntatio n afte r tota l body irradia- tion. Es pec ia lly though the dose of rad iation us ed for co nditioning is dec reased , a lloge ne ic bone ma rrow c e lls a re e ngrafted a nd it ca n ind uce do no r s pec ific to le ra nce fo r allografting . The aim of this st udy is to deve lo p a nonletha l co nd itioning approac h to ac hieve do no r c hi- me ris m and to confirm dono r s pec ific tole ra nce in C57BL/ 6 mic e .
M e t h o d s : We pe rfo rme d expe rime nts o n C5 7BL/ 6 m ic e d ivide d into thre e g ro ups a c- c o rd ing to pre pa ra to ry ra d iat io n d o s a g e . C57BL/ 6 mic e re ce ived s ubletha l dose of rad i- at io n a nd tra ns pla nted with bone ma rrow c e lls fro m BALB/ c . The pe rc e ntage of dono r de rive d
ce lls was a na lyzed by flow cytomet ry (FACS) a nd the do no r s pec ific to le ra nce fo r a llografts wa s as s es se d by BALB/ c s kin g ra fts a nd so did it by mixed lymphocyte reaction (MLR) a nd cytotoxic ity (CML) us ing s plee n c e lls from c hime ras (BALB/ c→C57BL/ 6).
Re s ult s : Ind uct io n of a llloge ne ic do nor c hime ris m oc c urre d in 50%, 100%, 100% of a nima ls irradiate d wit h 6Gy, 7Gy, a nd 9Gy TBI, re s pective ly. One hund red pe rce nt of c hime ras with evide nce of do no r c hime ris m acc e pted s kin a llografts . Moreove r, mixe d c hime ras exhibited do nor s pec ific tole ra nc e in vitro as ass es s ed by MLR a nd CML.
Con c lu s ion s : This strate gy ind uc ed the do no r c hime ris m a nd exhibited the dono r s pec ific tole ra nce effect fo r s kin a llog rafting . (Ko re an J He m ato l 2002 ;37 :46 ～53)
K e y W o rd s : Ra diatio n, Chime ris m, Orga n tra ns pla ntatio n
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여로 인한 부작용 등 해결하여야 할 많은 문제를 안고 있
다.1, 2) 뿐만 아니라 기존의 면역억제제들이 이식된 장기에
대해 특이적 관용을 유도하지 못하는 것으로 알려지면서3) 이를 해결하고자 여러 방면의 연구들이 진행되어 왔으며, 그 중 한가지가 방사선조사 후 골수세포를 주입하여 donor chimerism을 유도하는 것이다.4 , 5) 특히 최근에는 전처치 의 강도를 약화시켜도 동종 개체간에 골수세포가 생착 될 수 있다는 결과가 보고되어5～ 7) 본 연구에서도 이러한 방법 을 이용하고자 C57BL/ 6를 대상으로 치사량 이하의 방사선 조사선량을 결정한 뒤, 방사선조사 후 주조직적합항원 (major histocompatibility complex)이 일치하지 않는 BALB/ c 골수세포를 주입하고 BALB/ c 피부를 이식하여 동종장기에 대한 면역학적 관용효과를 확인하였다. 이와 더불어 이식된 마우스에서 비장세포를 분리하여 C57BL/ 6, BALB/ c, C3H (third party) 림프구에 대한 mixed lym- ph ocyte reaction (MLR) 과 림프구 살해능 (cell mediated lymph olysis, CML) 을 측정하여5) 동종 장기에 대한 특이 적인 면역학적 관용효과를 확인하였다.
대상 및 방법
1 . 실험동물
생후 7～8주된 C57BL/ 6 (H-2b; 대한바이오링크, 충청 북도 음성)를 대상으로 전신방사선 조사 후 골수이식을 시 행하였다. 골수, 피부조직을 공여할 마우스는 생후 7～8주 된 BALB/ c (H-2d; 대한바이오링크) 를 사용하였고, 골수 이식을 시행한 후 Specific pathogen free (SPF) 상태에서 사육하였다.
2 . 방사선 조사
C57BL/ 6에서 치사량 이하 (sublethal dose) 의 방사선 조 사량을 결정하기 위하여 6Gy부터 10Gy까지 1Gy씩 조사량 을 증가 시키면서 1회에 전신방사선 조사를 시행하였으며, 6MV Photon Beam (Linear Accelerator CL2100C/ D, CA, U. S. A. ) 을 이용하여 0. 65Gy/ min 용량5)으로 조사하 였다. 각 방사선 조사량마다 5마리의 C57BL/ 6를 사용하였 다.
3 . 골수세포 채집 및 골수 주입
BALB/ c의 대퇴골, 경골, 상완골을 박리하여 분리한 후, 박리한 뼈에서 23guage 주사바늘을 이용하여 골수를
채집하였다. 원심침전하여 혈장성분을 제거한 뒤 RPMI (Gibco, Grand Island, NY, U. S. A. ) 배지를 가하여 2mL의 세포 부유액을 만들고 작은 골 파편들을 제거하기 위하여 nylon mesh를 통과시켰다. 전신방사선 조사 후에 실험 마우스 당 3×107개의 BALB/ c 골수 세포를 꼬리정맥 을 통하여 주입하였다.
4 . 피부이식
BALB/ c의 등쪽에서 1. 5×1. 5cm 크기로 피부를 박리한 후 full-thickness skin graft를 시행하였다. 이식된 피부는 매주 이식편의 상태를 관찰하였고, 이식편이 완전히 소실되 거나 생착된 조직이 없는 경우를 거부반응으로 정의하였다.
5 . 유세포 분석기를 이용한 d o no r c h ime ris m 분석
BALB/ c 골수세포를 이식한 C57BL/ 6에서 단핵구를 분 리하기위해 꼬리 정맥에서 마리당 0. 5mL의 말초혈액을 Heparin (Sigma, St. Louis, MD, U. S. A. ) 처리된 용기 에 채취하여 PercollT M (Pharmacia Biotech, Upsalla, Sweden) 에 중첩하여 23℃, 1, 450rpm에서 30분간 원심 분 리하였다. 분리한 단핵구를 MHC Class I 항원에 반응하는 항 H-2Kb PE- conjugated 단클론항체 (PharMingen, San Diego, CA, U. S. A. ) 및 항 H- 2Kd FITC- conjugated 단 클론항체 (PharMingen)를 4℃에서 30분간 반응시켜 유세 포분석기 (FACSSort ; Becton Dickinson, Moutain View,
CA, U. S. A. )로 BALB/ c 및 C57BL/ 6 유래 세포에 대한 분석을 시행하였다. 음성대조로는 각 단클론항체의 iso- type 항체 (Phar Mingen) 를 동일한 조건으로 반응시킨 부유 액을 사용하였다. 같은 방법으로 골수, 간, 비장, 흉선의 세포 부유액을 채취하여 각 조직에서 이식된 BALB/ c 유래 의 세포가 어느 정도 존재하는지 분석하였다.
6 . 면역조직화학염색 ( Im mu no h is t o c h e mic a l S t a in )
BALB/ c 골수세포를 이식한 C57BL/ 6에서 이식 8주 후 에 흉선을 적출하였고, 대조군으로는 C57BL/ 6의 흉선을 사용하였다. 먼저 적출된 흉선은 frozen tissue matrix로 고정하여, 5 micron 두께의 절편으로 만든 뒤 슬라이드에 부착시킨 다음 acetone으로 고정시켰다. 조직내의 peroxi- dase activity를 제거하기 위하여 0. 03% H2O2용액에 10분 간 담근 후 세척하였고, 조직세포 표면의 비특이적 항체 수 용체를 제거하기 위해 blocking 용액에서 10분간 반응시킨 후 항 H-2Kd biotin conjugated 단클론항체 (PharMingen)
로 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다시 PBS 용액으로 세척 후 1:100으로 희석된 streptavidin conjugated Hor- seradish per oxidase (DAKO Corp, Copenhagen, Den- mark) 로 실온에서 30분간 반응시키고, 3- amino- 9- ethyl- carbazole (AEC) 와 효소기질을 첨가하여 발색반응 시킨 뒤 20초간 Mayer ' s hematoxylin으로 대조염색을 시행하였 다.
7 . Mix e d Ly mp ho c yt e Re a ct io n ( MLR)
효과세포는 방사선 조사 후 BALB/ c 골수세포를 이식한 C57BL/ 6의 비장세포를 이용하였고, 표적세포는 C57BL/
6, BALB/ c 및 C3H (H- 2K; 대한바이오링크) 비장세포를 20Gy 방사선 조사 후 사용하였다.8) 96 well plate에 well 당 표적세포와 효과세포를 각각 1×105개씩 (final volume 0. 2mL/ well) 동량으로 혼합하여 3일 동안 배양하였고, 5- br omo- 2 ' - deoxyur idine (Br dU ; Roch e Diagnostics GmbH, Mannh eim, Germany) 을 첨가하여 1일 간 다시 배양하였다. 배양 후 각 well의 세포들을 수집하여 anti- BrdU- peroxidase (Roche Diagnostics GmbH)를 첨가하 고 tetramethylbenzidine (TMB ; Roche Diagnostics GmbH) 으로 발색반응을 시킨 뒤 micr oplate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 동일한 실험을 2번 반 복하여 시행하였다.
8 . 림프구 세포 살해능 측정
효과세포는 방사선 조사 후 BALB/ c 골수세포를 이식한 C57BL/ 6의 비장세포를 이용하였고, 표적세포는 C57BL/
6, BALB/ c 및 C3H 비장세포를 분리하여 concanavalin A (Sigma)를 혼합하여 3일간 배양한 후 사용하였다. 96 well plate에 효과세포와 표적세포를 10 :1, 5 : 1, 2. 5 :1, 1: 1 (well 당 실제 세포수 비 ; 1×105: 1×104, 5×104: 1×104, 2. 5×104: 1×104, 1×104: 1×104) 의 비율로 혼합하여 (final volume 0. 2mL/ well) 4시간 동안 배양하였다.8) 이때 대조 군으로 spontaneous release군은 표적세포 (1×104/ well) 와 medium을 혼합하여 배양하였고, total release 군은 표적 세포 (1×104/ well) 와 1% Triton X- 100 (Sigma) 이 포함된 medium을 혼합하여 배양하였다. 배양 후 micr otiter plate 를 400×g에서 5분간 원심한 뒤 0. 1mL의 상등액을 채취하 여 표적세포에서 유리되는 lactate dehydrogenase의 활성 도를 490nm에서 흡광도 측정으로 구하였다. % cytotoxi- city는 다음 공식을 사용하였다.
%cytotoxicity =
experimental release－spontaneous release total r elease－spontaneous release ×100
9 . 통계분석
각 실험 마우스 군의 생존율과 상관관계를 분석하기 위 하여 Statistical Package for the Social Science (SPSS) version 9. 0의 통계프로그램을 이용하였다. 전체 생존율과 이식된 피부조직의 생존율은 Kaplan- Meier법을 사용하였 으며 통계학적 유의성은 log-rank test로 분석하였고, P값 이 0. 05 미만일 때 유의한 것으로 판정하였다.
결 과
1 . 방사선 조사량에 따른 말초혈액 내에서의 d o no r c h ime ris m 유도 효과
C57BL/ 6에서 10Gy의 방사선 조사량은 방사선 조사 후 자가조혈기능이 회복될 수 없는 치사량으로 대상 마우스 전체가 사망하였으나 (5일, 7일, 7일, 7일, 8일) , 그 이하 의 용량에서는 추가로 골수세포를 주입하지 않아도 자가조 혈기능이 회복되어 장기간 생존하는 것을 확인 할 수 있었 다 (Fig. 1) . 9Gy 이하의 조사량 중 골수세포 주입으로 donor chimerism을 유도 할 수 있는 적절한 조사량을 결정 하기 위하여 6Gy 조사 군을 1군, 7Gy 조사 군을 2군, 9Gy 조사 군을 3군으로 분류하여 실험하였다. 실험은 1군, 2 군, 3군에서 각각 8마리, 7마리, 6마리의 C57BL/ 6를 대상
Fig . 1. Lifeta ble s urviva l of nontra ns pla nted mice treate d va rious radiation dosa ges : 6Gy of TBI (●); 7Gy of TBI (▲);
8Gy of TBI (◆); 9Gy of TBI (■) : 10Gy of TBI (▼). Mini- mum follow- up was 15 we e ks .
으로 시행하였다. 골수이식 4주 후에 1군에서는 전체 8마 리 중 4마리 (50%)에서 2, 3 군에서는 대상 마우스 전체에 서 말초 혈액 내 BALB/ c 유래의 세포가 관찰되어 (Table 1) , 방사선 단독으로 전처치를 시행할 경우 적어도 7Gy 이
상의 방사선을 조사하여야 안정적인 donor chimerism을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 또한 말초혈액에서의 BALB/ c 유래의 세포는 2, 3군에서 각각 평균 98. 2%, 96. 6%로 측정되었고 (Table 1) , 유도된 donor chimerism 정도는 이식 3개월 후까지 별다른 변화 없이 안정적으로 유 지되는 것으로 관찰되었다 (Fig. 2) . 공여 마우스 유래의 세포가 수혜 마우스의 생체 내에 3% 이상 존재하는 경우를 donor chimerism이 유도된 상태로 정의하였다.7)
2 . 이식된 피부 조직의 생착
전신방사선 조사 후 BALB/ c 골수세포를 주입하고 2주 후에 유세포분석기 분석으로 C57BL/ 6 말초혈액에서 do- nor chimerism을 확인한 뒤 BALB/ c 피부를 이식하였다.
대조군으로 사용한 C57BL/ 6에 BALB/ c 피부를 이식한 경 우는 이식된 피부 조직이 1주 이내에 모두 괴사되었으나 (Fig. 3A) , 전신방사선조사와 골수세포 이식으로 말초혈 액에서 donor chimerism이 확인된 군에서는 이식된 피부 조직이 모두 생착되었다 (P<0. 05, Fig. 4) . 뿐만 아니라 피부이식 4주 후에는 생착된 이식편에서 수혜 마우스의 색 깔과는 다르게 흰색의 털이 자라 이식된 피부조직의 생착 을 확실하게 확인할 수 있다 (Fig. 3B) . C57BL/ 6에 C3H 피부를 이식한 경우는 대조군에서와 마찬가지로 이식된 피 부조직이 1주 이내에 모두 괴사되었다.
3 . 유세포분석 및 면역조직화학염색을 이용한 d o no r c h ime ris m 분석
골수이식 8주 후에 말초혈액과 골수 및 간, 비장, 흉선 T a b le 1 . Inf lu e nc e o f ra d ia t io n d o s e o n t h e in-
d uc t io n of d o no r c h im e r is m
Group Numbers of engraftment % of chimerism
1 4/8 －
2 7/7 98.2
3 6/6 96.6
Fig . 2 . Leve l of donor chime ris m in BALB/c¡→ C57BL/6 chime ra s ove r time with following strategies : 6Gy of TBI (●, n=8); 7Gy of TBI (▲, n=7); 9Gy of TBI at the time of ma rrow tra ns pla ntation (■, n=6). C57BL/6 mice re ce ived s ubletha l dose of radiation a nd we re tra ns pla nted with 3x107 bone ma rrow ce lls from BALB/c mice . The pe rce nta ge of PBL be a ring H- 2d was a na lyzed by FACS . The leve l of donor chime ris m ma inta ined consta ntly from 1 month to 3 months afte r bone ma rrow tra ns pla ntation.
Fig . 3 . The obse rvation res ults of s kin a llografts afte r tra ns pla ntation. The BALB/c s kin grafts we re rejected a nd have a lrea dy s hown necrotic cha nges in control (A). Howeve r, the s kin a llografts we re a cce pted a nd 4 we e ks afte r tra ns pla ntation white ha irs grew in the mouse with detection of donor chime ris m by FACS (B).
을 적출하여 세포 부유액을 만들어 항 H-2Kb, 항 H- 2Kd 단클론항체와 반응시킨 후 유세포분석기로 donor chi- merism 정도를 분석하였다. 말초혈액에서 donor chi- merism이 확인된 경우는 골수를 비롯한 각 장기에서도 공 여 마우스 유래의 세포가 관찰되었으며 (Fig. 5) , 특히 흉 선에서는 86. 14%의 공여 마우스 유래의 세포가 관찰되었 다. 유세포분석기 분석 뿐만 아니라 항 H-2Kd 단클론항체 를 이용한 면역조직화학염색에서도 흉선의 피질 부분에 공 여 마우스 유래의 세포들이 존재하는 것이 확인되었다
(Fig. 6) .
4 . MLR 및 림프구 살해능 측정
BALB/ c→C57BL/ 6 chimera에서 비장세포를 분리하여 C57BL/ 6, BALB/ c, C3H 림프구에 대한 MLR과 림프구 살해능력을 측정하였다. Chimera에서 분리된 비장세포가 MLR 검사에서 C3H 림프구에 반응하여 증식하는 것에 비 하여 BALB/ c 및 C57BL/ 6 림프구에 대해서는 별다른 증식 반응을 보이지 않았으며 (Table 2) , BALB/ c 및 C57BL/ 6
Fig . 5 . Two- color FACS a na lys is for the proportion of lymphoid linea ges from mixe d donor chime ras pre pa red 7Gy of TBI on the day of tra ns pla ntation. Re cipie nt (H- 2b) a nd donor (H- 2d) ce lls of lymphoid linea ges we re a na lyze d in a re pre se ntative BALB/c→C57BL/6 chime ra in the lymphoid gating us ing pe riphe ra l blood mononuclea r ce lls (A), bone ma rrow ce lls (B), he patic mononucle a r ce lls (C), s plee n ce lls (D) a nd thymocyte s (E) (8 wee ks following re constitution).
The pe rce nta ges of donor ce lls a re s hown in the right lowe r corne r of each res pective plot.
Fig . 4 . Lifeta ble s urviva l of full thicknes s s kin grafts . Control C57BL/6 mice (△), chime ra s (BALB/c¡→ C57BL/6) with the evide nce of donor chime ris m by FACS a na lys is (◆).
P < 0.05
Fig . 6 . Immunohistoche mica l sta in of a nti- H- 2Kd within the thymus of control (C57BL/6, A) ve rs us chime ra at 8 wee ks post tra ns pla ntation (B). Anti- H- 2Kd a ntige ns s howe d diffe r- e ntia l expre ss ion within the thymic cortica l a rea of chime ra ve rs us control (×400).
세포에 대한 림프구 살해능력도 증가되지 않아 (Fig. 7) chimera 내에서 전신방사선 조사와 골수세포 이식으로 BALB/ c 세포에 특이적으로 반응하는 T 림프구가 제거되 었고 이로 인하여 동종 피부조직이 거부반응 없이 생착되 었음을 확인할 수 있었다.
고 찰
장기이식술은 의학의 여러 분야에서 궁극적인 치료방법 으로 빠르게 자리잡고 있으나, 이식된 장기의 기능을 유지 하기 위해서는 평생동안 면역억제제를 복용하여야만 하기 때문에 이에 따른 부작용들이 문제점으로 지적되고 있다.
비특이적으로 T 림프구의 기능을 억제하여 이식된 장기 기 능을 유지하려는 기존의 면역억제제 사용에서 탈피하여, 생체 내에서 동종 이식장기에 대한 특이적인 관용효과를 유도하고자 여러 방면에서 끊임없는 연구들이 진행되고 있 다. 그 중 한가지가 방사선 치료 후 골수 세포를 이식하여 donor chimerism 상태를 만들고 동일한 개체로부터 장기
를 적출하여 이식하는 방법으로 이러한 방법을 사용하면 동종이식 뿐만 아니라 이종이식 때에도 거부 반응을 극복 할 수 있다는 연구 결과가 보고되고 있다.5～ 7 , 9)
Ildstad 등10 )은 C57BL/ 10SnJ (B10)을 대상으로 한 실 험에서 치사량 (10Gy)의 방사선을 조사한 후 골수 세포를 이식하면 수혜 마우스의 세포가 완전히 소멸되고 공여 마 우스의 세포로 치환되는 complete donor chimerism 상태 가 되지만 이러한 방법으로는 이식편대숙주질환이 증가되 고 면역 기능도 현저하게 감소되는 등 방사선 조사로 인한 여러 가지 부작용이 발생하게 된다고 하였다. 그러나 전처 치 강도를 약화시켜도 동종개체 간에 이식된 골수가 생착 될 수 있다는 비골수파괴성 접근 (nonmyeloablative ap- pr oach) 에 대한 개념이 소개되면서, 공여 마우스와 수혜 마우스 간에 조직적합항원이 일치하지 않아도 치사량 이하 (6～9Gy) 의 방사선을 조사한 뒤 골수이식을 시행하면 이 식된 골수세포가 생착되면서 공여 마우스와 수혜 마우스 유래의 세포가 동시에 존재하는 mixed donor chimerism 상태가 유도된다고 하였다.1 1, 12) 이 상태에서는 complete chimerism과는 다르게 이식편대숙주질환이나 면역기능 저 하 등이 문제가 되지 않을 뿐만 아니라 공여 마우스 또는 수혜 마우스의 장기를 이식하여도 양쪽 장기에 대한 특이 적인 관용효과가 유도되어4 , 13) 이식 장기에 대한 거부반응 이 일어나지 않는다.
동물 실험에서 chimerism을 유도하기 위한 방법은 골수 이식 전에 주로 전신방사선 조사를 시행하는 방법이 이용 되고 있으며, 본 연구에서도 7Gy와 9Gy 방사선 조사 후 골 수이식을 시행하여 대상 마우스의 100%에서 안정적인 donor chimerism이 유도되는 것을 확인하였다. 또한 7Gy 및 9Gy의 방사선 조사는 골수세포를 투여하지 않아도 자가 조혈기능이 회복될 수 있는 치사량 이하의 방사선 조사량 으로 C57BL/ 6를 대상으로 시행하는 실험에서 동종 골수세 포를 이식하여 donor chimerism을 유도하기 위한 가장 이 상적인 전처치 방법으로 생각한다. 전처치로 사용되는 전 신방사선 조사량을 줄이기 위하여 cyclophosphamide를 병 합 투여하거나 단클론항체 혹은 면역억제제를 병합 투여하
는 방법4～ 6) 등이 이용되고 있으나, 이러한 방법 단독으로
는 donor chimerism을 유도하거나 지속시킬 수 없으며 반 드시 방사선 조사가 병용되어야 하는 것으로 알려져 있다.
주조직적합항원이 일치하지 않는 동종장기를 이식할 경 우 이식장기에 대한 관용은 동종항원으로 인해 활성화된 T 림프구가 제거되면서 유도되는데, 흉선에서 활성화된 T 림 프구가 제거되는 central tolerance와 이와는 무관하게 T 림프구가 제거되는 peripheral tolerance로 나누어 설명한 다. 본 연구에서는 골수이식 전에 치사량 이하의 방사선 조 T a b le 2 . In v it ro re a c t iv it y of c h ime ra s : o ne - wa y
m ix e d ly m p ho c yt e re a c t io n a g a in s t h o s t , d o no r , a nd t h ird - pa rt y a llo a nt ig e n s*
Stimulator† Stimulation Index‡ BALB/c C57BL/6 C3H Self BALB/c C57BL/6 C3H
BALB/c 0.32 1.52 1.48 － 1.0 4.8 4.6
C57BL/6 1.57 0.43 1.53 － 3.7 1.0 3.6
C3H 1.58 1.72 0.38 － 4.2 4.5 1.0
Chimera 0.73 0.70 1.75 0.49 1.5 1.4 3.6
*Representative experiment of MLR reactivity of chimeras 2 months after reconstitution.
†Mean of duplicate cultures in 1:1 responder- to- stimulator ratio.
‡ Stimulation index derived by responder anti- stimulator/responder anti- self.
Fig . 7 . S pecific ce ll mediated lympholys is of s plee n ce lls from chime ras towa rd recipie nt (C57BL/6), donor (BALB/c), a nd third pa rtly (C3H). Sponta neous re lea se <25%.
사 만으로도 BALB/ c의 동종 골수세포가 생착됨을 확인하 였고, 이와 더불어 C57BL/ 6 체내에서 BALB/ c 세포에 반 응하는 T 림프구가 선택적으로 제거되어 BALB/ c 림프구 에 대한 증식반응 뿐만 아니라 림프구 살해능도 현저하게 감소되는 것을 확인하였다. 동종세포에 대한 이러한 관용 효과는 이식된 공여 마우스의 세포가 골수 뿐만 아니라 흉 선을 비롯한 각 장기로 이동하여 BALB/ c 세포에 반응하는 T림프구를 제거함으로써 유도되는 것으로 생각된다. 생체 내에서 전신방사선 조사를 비롯한 central tolerance를 유도 할 수 있는 전처치 방법을 사용하면 동종장기에 대한 확실 한 면역학적 관용 효과를 기대할 수 있는 반면에 아직까지 peripheral tolerance를 유도하는 전처치 방법 자체만으로 는 주조직적합항원이 일치하지 않는 동종장기가 거부반응 없이 생착되는 효과를 기대하기는 어렵다.14)
저자들은 본 실험을 통하여 방사선 조사 후 주조직적합 항원이 일치하지 않는 BALB/ c 골수를 C57BL/ 6에 이식하 여 chimeric mouse model을 만들고, 다시 BALB/ c 피부 를 이식하여 생체 내에서 동종 이식장기에 대한 관용효과 를 확인하였을 뿐만 아니라 MLR과 림프구 살해능 검사를 통하여 chimera 내에서 BALB/ c 세포에 반응하는 특정 T 림프구가 제거된 것을 확인할 수 있었다. 임상에서도 전처 치의 강도를 약화시키는 이와 같은 방법이 실용화 된다면 장기간 면역억제제 투여로 인한 부작용을 줄일 수 있을 뿐 만 아니라 주조직적합항원이 일치하지 않아도 장기이식을 용이하게 시행할 수 있게 되어 부족한 공여장기 문제를 해 결할 수 있을 것이다. 하지만 치사량 이하의 용량이라고 할 지라도 관용효과를 유도하기 위해 장기이식 전에 전신방사 선 조사를 시행하는 것은 아직 부담이 되는 전처치 방법이 며, 마우스를 대상으로 시행된 실험 결과들과는 달리 사람 에서는 아직까지 주조직적합항원이 완전히 일치하지 않는 개체간에 이식된 골수의 생착이 용이하지 않다는 문제가 있다.
요 약
배 경 : 의학의 여러 분야에서 장기이식의 수요가 폭발적 으로 증가하고 있지만 공여장기의 부족 및 장기간 면역억 제제 복용에 따른 부작용이 큰 문제가 되고 있어 최근에는 이를 극복하기 위한 한가지 방법으로 방사선 조사 후 골수 세포를 이식하여 동종이식 장기에 대한 특이적인 관용효과 를 유도하고자 하는 시도가 활발하게 진행되고 있다. 특히 전처치로 이용되는 방사선 조사량을 감소시켜도 이식된 골 수가 생착되면서 donor chimerism 상태가 유도되고, 공여 마우스의 세포 및 조직에 대하여 특이적인 관용이 유도되
어 동종장기를 이식하여도 거부반응이 나타나지 않는다.
본 연구에서는 주조직적합항원이 일치하지 않는 BALB/ c (H- 2d) 와 C57BL/ 6 (H- 2b) 를 이용하여 donor chimerism 을 유도하고, 이의 면역학적 관용효과를 확인하였다.
방 법 : C57BL/ 6를 치사량 이하의 방사선 조사량에 따라 1군 (6Gy) , 2군 (7Gy) , 3군 (9Gy)로 나눈 뒤 방사선 조사 후 BALB/ c 골수세포를 이식하여 각 군에서 donor chi- merism 정도를 유세포분석기를 이용하여 분석하고, 동종 피부조직을 이식하여 이식편의 생착 여부를 관찰하였다.
이와 더불어 동종 장기에 대한 특이적 관용 효과를 확인하 고자 chimera (BALB/ c C57BL/ 6)에서 비장세포를 분리 하여 C57BL/ 6, BALB/ c, C3H 세포에 대한 MLR과 림프 구 살해능을 측정하였다.
결 과 : 1군에서 대상 마우스의 50%에서, 2, 3군에서는 대상 마우스의 100%에서 donor chimerism이 유도되어 적 어도 7Gy 이상의 방사선이 조사되어야 말초혈액 내에서 안 정적인 donor chimerism을 유도할 수 있는 것으로 나타났 다. 방사선 조사와 골수세포 주입으로 donor chimerism이 형성된 마우스는 이식된 피부조직이 100% 생착되어 동종 이식 장기에 대한 면역학적 관용효과를 확인 할 수 있었다.
MLR과 림프구 살해능 검사에서도 BALB/ c 세포에 대한 특이적인 면역학적 관용 효과를 확인할 수 있었다.
결 론 : 장기간 면역억제제를 투여하지 않아도 치사량 이 하의 방사선 조사 후 골수세포를 이식하면 생체 내에서 이 식된 골수세포가 생착되면서 donor chimerism이 형성되 고, 동종세포에 대한 특이적인 관용효과가 유도되어 피부 이식편이 거부 반응 없이 생착 될 수 있음을 알 수 있었다.
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