재조합 Bone Morphogenetic Protein-7 유전자를 이용한 골 유도

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목 적: 사람 Bone Morphogenetic Protein-7 (BMP7) 유전자를 안정적으로 발현하는 세포와 재조합 BMP7 아데노바이러 스(AdBMP7)를 개발하여 골형성 및 골재생과 관련된 근골격계 질환에 활용하는 것이다.

대상 및 방법: 골육종세포주 U2OS로부터 역전사 중합효소 연쇄 반응으로 사람 BMP7 유전자를 클로닝하고, HEK293세포 로 BMP7 유전자를 도입시킨 후, BMP7 단백질을 생산하는 세포를 선별하였다. 재조합 BMP7 아데노바이러스(AdBMP7)는 AdEasy vector system을 사용하여 제작하였다. 면역 결핍 생쥐의 피하조직 및 근육조직에 BMP7 발현 세포와 AdBMP7 바이러스를 주사한 후, 골형성 정도를 X-선 및 조직학적으로 확인하였다.

결 과: BMP7 발현 HEK293로부터 활성형 BMP7이 발현되며 면역 결핍 생쥐의 피하조직 및 근육조직에 세포를 이식하였 을 경우 골형성이 유도되었다. AdBMP7 바이러스 자체 및 AdBMP7을 형질 도입한 사람 섬유아세포를 면역 결핍 생쥐의 근육조직에 주사하였을 경우 골형성이 유도되었다.

결 론: 이상의 결과를 통하여 본 연구에서 제작한 BMP7 발현 HEK293세포와 재조합 BMP7 아데노바이러스는 동물 및 시 험관 시험에서 골형성 및 재생에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 생각한다.

색인 단어: BMP7, 아데노바이러스, 골형성, 유전자 치료

Purpose: The aim of this study was to develop recombinant human Bone Morphogenetic Protein-7 (BMP7)- stable cells and recombinant human BMP7 adenoviruses (AdBMP7) for osteoinduction and osteoregen- eration in musculoskeletal diseases.

Materials and Methods: The human BMP7 cDNA was amplified from a human osteosarcoma cell line, U2OS using a reverse transcription-polymerase chain reaction and cloned into a eukaryotic expression vector. The BMP7-stable HEK293 cells (HEK293/BMP7) were prepared by transfecting the recombinant BMP7 plasmid vector. The recombinant human BMP7 adenovirus (AdBMP7) was constructed using the AdEasy vector system. The BMP7 expression levels in HEK293/BMP7 and AdBMP7 were measured by activity staining for alkaline phosphatase in mouse C2C12 promyoblast cells. The BMP7-stable HEK293 cells, AdBMP7 itself, or AdBMP7-transduced human fibroblasts were injected into the subcutaneous tis- sues and the calf muscles of immunocompromised mice. The amount of ectopic bone formation was evaluated by radiographic and histological analyses.

Results: Ectopic bone formation was observed after injecting the BMP7-stable HEK293 cells with either the AdBMP7 itself or AdBMP7-transduced human fibroblasts into the subcutaneous tissues and calf mus- cles of immunocompromised mice.

Conclusion: These results showed that HEK293/BMP7 cells and AdBMP7 have a significant potential for bone formation and the regeneration of various bone diseases.

Departments of Orthopaedic Surgery, Biochemistry & molecular biology*, College of Medicine, Yeungnam University, Daegu, Korea

Woo Seok Jang, M.D., Jeong Rae Kim, M.D., Wook Jin Sohn, M.D., Jae Sung Seo, M.D., Myun Whan Ahn, M.D., Yeon Sil Jang*, Hyun Kyung Kim*, and Jae Ryong Kim, M.D.*

Osteoinduction Using Recombinant Bone Morphogenetic Protein-7 Gene

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재조합 Bone Morphogenetic Protein-7 유전자를 이용한 골 유도

장우석ㆍ김정래ㆍ손욱진ㆍ서재성ㆍ안면환ㆍ장연실*ㆍ김현경*ㆍ김재룡*

영남대학교 의과대학 정형외과학교실, 생화학 분자생물학교실*

598 598 통신저자 : 안 면 환

대구광역시 남구 대명동 317-1 영남대학교병원 정형외과

TEL: 053-620-3643∙FAX: 053-628-4020 E-mail: mwahn@med.yu.ac.kr

*본 연구는 경일약품의 연구비 지원에 의하여 이루어졌음.

Address reprint requests to Myun Whan Ahn, M.D.

Department of Orthopaedic Surgery, College of Medicine, Yeungnam University, 317-1 Daemyeong-dong, Nam-gu, Daegu 705-717, Korea

Tel: +82.53-620-3643, Fax: +82.53-628-4020 E-mail: mwahn@med.yu.ac.kr

골형성 단백질(Bone morphogenetic protein, BMP) 은 transforming growth factor- (TGF- ) super- family에 속하는 펩타이드 성장 인자의 하나이다. 포유 동물에서 조직 간세포(stem cell)에 작용하여 골세포 및 연골 세포로 분화를 촉진시키는 역할을 하는 것으로 알 려져 있다²⁴⁾. 지금까지 15종류의 골형성 단백질이 밝혀 져 있으며 이 중에서 골형성을 유도하는 것으로 확인된 것은 5종으로 BMP2, BMP3, BMP4, BMP6, BMP7

이다^8,10,12). 그 외에 세포 성장 및 분화 조절, 세포 사멸

에도 관여하는 것으로 알려져 있다^4,14).

BMP의 임상적 활용은 BMP 단백질과 BMP 유전자 를 이용한 유전자 치료제로 크게 나누어진다. BMP 단백 질의 경우 유전자 재조합 기법에 의해 생산된 인간 BMP2 (rhBMP2), 인간 BMP7 (rhBMP7) 단백질을 근골격계 재생에 이용한 임상 연구들이 보고되었다^11,25). 재조합 BMP 단백질을 임상에 적용하기 위해서는 마이크로그 램에서 밀리그램 단위의 많은 양이 필요하며²⁶⁾ BMP를 지속적으로 분비시키고 골세포의 성장을 위한 구조물로 작용할 수 있는 운반체가 필요한 것으로 알려져 있다^1,23). 따라서 운반체는 감염, 염증 반응, 면역 반응 등을 일으 키지 않아야 하지만 아직까지 이런 조건을 갖춘 적절한 운반체가 유용하지 않은 것으로 알려져 있다¹⁶⁾. 재조합 BMP 단백질을 대신하여 BMP 유전자를 이용한 유전자 치료법도 많이 연구되고 있다. 레트로바이러스 벡터^5,13) 나 아데노바이러스 벡터를 이용하여 BMP 유전자를 조 직에서 직접적으로 발현시키는 in vivo 방법이나^2,21)재 조합 BMP 바이러스 벡터를 골수 세포, 근육 세포, 섬유 아세포 등으로 먼저 감염시킨 후 이를 조직에 이식하는 ex vivo 방법들이 여러 동물 모델에 적용, 성공적으로 골 형성 및 재생 효과를 나타내는 것으로 보고되었다^10,17,18). 바이러스 벡터를 이용하지 않고 재조합 BMP 플라스미 드를 전기충격법에 의해 직접 조직에 넣어 발현시키는 방법도 보고되고 있다¹⁶⁾.

따라서 본 연구에서는 사람 BMP7 유전자를 안정적으 로 발현하는 세포와 재조합 BMP7 유전자를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 개발함으로써 골형성 및 골재생 과 관련된 근골격계 질환에 활용하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 연구 대상

BMP7을 증폭하는데 사용한 primer들은 Bionix사 (캐나다)로부터 제작하였다(Table 1). 사람 골육종 세포 U2OS, 사람 배아신장 세포 HEK293, 생쥐 promy- oblast C2C12세포는 미국 ATCC사로부터 구입하였다.

수컷 면역결핍 생쥐(SCID mice/Balb c)는 중앙실험동 물로부터 구입하여, 청정 사육실에서 사육하였다.

2. 방법 1) RNA 추출

RNA는 acid-phenol-quanidinium thiocyanate- chloroform extraction방법으로 분리하였다⁷⁾. RNA 농도는 260 nm에서의 흡광도를 측정하여 결정하였다.

2) 역전사 중합효소 연쇄 반응

사람 BMP7의 유전자는 역전사 중합효소 연쇄 반응으 로 증폭하였다. PCR 반응은 PerkinElmer 2400 중합 효소 연쇄 반응 기계를 사용하여 95℃에서 3분간 반응 시킨 후 94℃10초, 68℃2분 30초로 5회, 94℃10초, 67℃ 15초, 68℃2분 30초로 5회, 94℃10초, 65℃ 15초, 68℃2분 30초로 20회 반복하고, 68℃7분간 더 반응시켰다. Primer로는 110F, 123F, 1423R, 1441R 을 이용하였다(Table 1).

3) BMP7의 클로닝 및 염기서열 확인

역전사 중합효소 연쇄 반응으로 증폭된 BMP7 DNA 들을 gel extraction kit를 사용하여 추출하였다. 추출 한 DNA를 PCR2.1-Topo TA cloning kit를 사용하 여 PCR2.1 플라스미드 벡터로 삽입한 후 Top10 com- petent E. coli를 형질 전환하였다. 정제한 플라스미드 를 제한 효소 처리한 후 아가로즈 겔에서 전기영동하여 Key Words: BMP7, Adenovirus, Osteogenesis, Gene therapy

primer sequence

110F TAG AGC CGG CGC GAT GAC CGT G 123F ATG CAC GTG CGC TCA CTG CGA G 1423R AGG AGC TAG TGG CAG CCA CAG G 1441R AAG GGT CTG AAT TCT CGG AGG AGC Table 1.Primers used for cloning the BMP7

BMP7 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 가진 E coil클론을 확인하였다. 클로닝된 BMP7 유전자의 염 기서열은 Macrogen사(한국)에 의뢰하여 dideoxy sequencing법으로 확인하였다.

4) pcDNA3.1 벡터로 BMP7의 subcloning

pCR2.1/BMP7을HindIII, EcoRV 처리하여 BMP7 유전자를 분리한 후, 진핵세포 발현 벡터인 pcDNA3.1 의 Hind III, EcoR V 자리로 삽입시켰다. pcDNA/

BMP7이 제대로 제작되었는지는 Hind III, EcoR V 처리한 후 아가로즈 겔 전기영동으로 확인하였다.

5) HEK293세포에서 유전자 재조합 BMP7의 발현

LipofectAMINE 2000 (Life technologies사)을 사 용하여 pcDNA3.1/BMP7 재조합 플라스미드를 HEK- 293세포로 진핵형질전환(transfection)하였다. BMP7 의 발현은 Northern blot 분석과 alkaline phospha- tase 활성 염색으로 확인하였다.

6) Alkaline phosphatase 활성 염색

C2C12세포를 24 well plate에 70% 정도 차지하도 록 배양하였다. 배양액을 제거한 후, BMP7을 발현하는 것으로 확인된 HEK293 세포의 배양액을 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 72시간 동안 배양하였다.

세포를 PBS 용액으로 한 번 세척한 후, 2% parafor- mal-dehyde 용액으로 30분간 고정하였다. PBS로 두 번 세척하고 alkaline phosphatase 활성을 alkaline phosphatase 염색 시약(Sigma사)으로 확인하였다.

7) BMP7 유전자 재조합 아데노바이러스 제작

BMP7 유전자 재조합 아데노바이러스는 Q. Biogene 사의 AdEasy vector system을 사용하여 제작하였다.

pCR2.1/BMP7를 Hind III와 Xba I으로 절단한 후 BMP7 유전자를 분리하였으며, pShuttle-CMV 벡터 의HindIII, XbaI 자리로 삽입하였다. PmeI 효소를 처리한 pShuttle/BMP7 플라스미드 1 g을 100 ng의 pAdEasy-1 벡터와 섞은 후, Bio-Rad electroporator 를 사용하여 200 Ohms, 25 F, 2.5 KV에서 BJ5183 competent cell을 형질 전환하였다. 형질 전환된 세포 를 LB-kanamycin (50 g/mL) 한천 배지에서 하룻

밤 배양하였다. 크기가 작은 세포 군집(colonies)들을 2 mL의 LB-kanamycin 배양액에 접종한 후, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 플라스미드를 분리 정제한 후 0.7% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 플라스미드 크기 가 40 kb인 것을 선별하였다. 선별한 플라스미드들을 DH5 E. coli균주로 전기 충격기를 사용하여 형질 전 환하고, LB-kanamycin 배양액에 배양한 후 플라스미 드를 분리하였다. 최종적으로 3회 더 선별, 정제하여 재 조합 BMP7 아데노바이러스(AdBMP7)를 제조하였다.

8) 면역결핍 생쥐에서 HEK293/BMP7, AdBMP7 바이러스 및 AdBMP7 형질 도입된 사람 섬유아세포의 골형성 조사 HEK293/BMP7와 HEK293/pcDNA 세포를 배양 한 후 1×10⁶개의 세포를 3마리의 면역 결핍 생쥐의 오 른쪽과 왼쪽 종아리 근육, 그리고 등쪽 피하 조직으로 주사하였다. BMP7 재조합 아데노바이러스의 효과를 관찰하기 위하여 정제된 AdBMP7 또는 대조군으로 AdLacZ 바이러스를 9×10¹¹개를 각각 3마리의 면역 결 핍 생쥐의 오른쪽과 왼쪽 종아리 근육으로 주사하였다.

2주와 4주 후 생쥐들을 에테르로 마취시킨 후 X선 촬영 을 하였다. 생쥐를 희생시킨 후, 조직을 절제하여 조직 염색을 시행하여 현미경으로 관찰하였다.

결 과

1. 역전사 중합효소 연쇄 반응을 이용한 BMP7의 증 폭 및 클로닝

증폭된 유전자를 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인한 결과 BMP7은 1.3 kb의 진한 DNA 띠와 1.1 kb, 0.8 kb 의 연한 DNA 띠가 증폭됨을 확인할 수 있었다(Fig. 1A).

2. BMP7의 subcloning 및 BMP7을 발현하는 HEK293세포 제작

pcDNA3.1/BMP7의 경우 Hind III, EroR V 처리 하였을 때 1.4 kb의 DNA 띠가 각각 관찰되어 예상대로 올바르게 subcloning되었음을 확인하였다(Fig. 2A).

BMP7의 발현을 방사성 동위원소가 표지된 BMP7 probe 를 사용하여 Northern blot 분석으로 확인한 결과 BMP7 재조합 유전자가 HEK293 세포에서 잘 발현되었다(Fig.

2B). C2C12 세포는 생쥐 promyoblast로서 BMP의 처리에 의해 골세포로 분화되며, 그 과정에서 alkaline

phosphatase 활성이 증가하는 것으로 잘 알려져 있다

22). 본 연구에서도 HEK293/BMP7 세포의 배양액을 C2C12세포에 처리한 결과, alkaline phosphatase 활성이 증가됨을 확인하였다(Fig. 2C).

3. HEK293/BMP7의 골형성 효과 조사

2주 후 HEK293/BMP7 세포를 주입한 오른쪽 종아

리 근육에서 딱딱한 덩어리가 만져졌으나 BMP7 유전자 가 삽입되지 않은 HEK293/pcDNA3.1 세포를 주입한 왼쪽 종아리 근육에서는 변화가 없었다. 피하 조직에서도 마찬가지로 HEK293/BMP7 세포를 주입한 부분에서 는 딱딱한 덩어리가 만져졌으나 HEK293/pcDNA3.1 세 포를 주입한 부분에서는 변화가 없었다(Fig. 3A). X-선 촬영을 한 결과 HEK293/BMP7 세포를 주입한 종아리 근육에서 뼈로 추정되는 직경 4 mm, 길이 7 mm 정도 의 X-선 비투과성 종괴가 관찰되었다(Fig. 3B).

현미경으로 골조직이 형성되었는지 관찰하였는데 피 하 조직에서는 2주째에, 주위 조직과 잘 구분이 되고, 내 부에 HEK 세포로 추정되는 세포들을 포함하고 있는 해 면골 조직이 형성되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 4A, B). 4주째에는 치밀골 조직이 확실히 형성되었으며 내 부에는 적혈구 등과 같은 골수 세포들이 존재함을 확인 할 수 있었다(Fig. 4C, D). 4주째 골조직 내에는 HEK 세포에서 유래된 것으로 추정되는 종괴가 관찰되었다.

근육 조직의 경우, 적출한 2주째 종괴에서는 근육과 잘 구분되며 내부에 적혈구, HEK 세포로 추정되는 세포들 Fig. 1.RT-PCR of BMP7 from U2OS cells (A) and cloning of

BMP7 into a pCR2.1 vector (B).

A

M 1

kb

2 - 1.5 - 1.0 -

B

M 1

kb

3 - 2 - 1 - 0.5 -

Fig. 3.In vivo bone formation of BMP7-stable HEK293 cells injected into subcutaneous tis- sues (A) and calf muscles (B).

A HEK/pcDNA

HEK/BMP7

B

HEK/BMP7 HEK/pcDNA

Fig. 2.Construction of BMP7-stable HEK293 cells and BMP7 expression in the cells.

A B C

M 1

kb

1.5 -2 - 1.0 -

BMP7

GAPDH

-28S -18S

-18S

1

2

3 1 2 3

과 함께 해면골 조직 및 골 조직이 관찰되었다(Fig. 5A, B). 4주째 조직에서는 골수 조직, 치밀골 조직들과 함께 암세포들의 증식으로 치밀골 조직의 일부가 분해된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 5C, D).

4. BMP7 유전자 재조합 아데노바이러스 제작 및in vitro활성조사

pCR2.1/BMP7 플라스미드로부터 BMP7을 분리한 후 pShuttle 벡터로 subcloning하였다(Fig. 6A). pShut- tle/BMP7을 각각 pAdEasy-1 벡터와 대장균 내에서 상동 재조합한 후 pAdEasy/BMP7이 제대로 만들어졌 음을 확인하였다(Fig. 6B, C).

QBI-293A 세포로 pAdEasy/BMP7을 진핵형질전 환하고 3주 후에 바이러스 집락을 육안으로 뚜렷이 관찰 할 수 있었다. 최종적으로 선별된 재조합 바이러스에 BMP7 유전자가 존재하는지 중합효소 연쇄 반응으로 확인하였다(Fig. 7A). AdBMP7 바이러스를 사람 섬유 아세포에 형질 도입 하였을 때 BMP7이 발현됨을 역전 사 중합효소 연쇄 반응법으로 확인하였다(Fig. 7B). 그 리고 AdBMP7를 형질 도입한 섬유아세포에서 alkaline phosphatase가 활성화되는지 직접 alkaline phos- phatase 활성염색으로 확인하였다(Fig. 7C).

Fig. 6.Construction of BMP7 adenoviral vectors.

A B C

M 1 M 1* 2 3* 4 5 M 1 2

kb

3 - 1.6 - 1 -

0.5 -

kb

40 - 15 - 6 - 4 - 2 -

3 - 2 -

1 - kb Fig. 4.Histological fingings for bone formation of BMP7-stable

HEK293 cells injected into subcutaneous tissues.

A

C

B

D

Fig. 5.Histological examination for bone formation of BMP7-sta- ble HEK293 cells injected into calf muscle.

A

C

B

D

5. AdBMP7 아데노바이러스의 골형성효과 조사 주사한 지 4주 후에 X-선 촬영을 한 결과, AdBMP7 바이러스를 주입한 다리에서 경골과 붙어 있는 뼈로 추 정되는 직경 3 mm 정도의 둥근 X-선 비투과성 종괴가 관찰되었다(Fig. 8A). 조직표본을 제작하여 관찰한 결 과 피질골, 해면골, 골수조직을 갖춘 골 조직이 경골과 부착하여 생성되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 8B, C).

2주 후 AdBMP7가 형질 도입된 섬유아세포를 주사한 피하 조직에서 딱딱한 종괴가 만져졌으며 피하 조직을 박리하여 조사한 결과 뼈로 추정되었다(Fig. 9A). 마찬 가지로 근육조직에서도 딱딱한 종괴가 만져졌으며 X- 선 촬영결과 직경 3.5 mm, 길이 9 mm 정도의 뼈로 추

정되는 종괴가 관찰되었다(Fig. 9B). 그러나 AdLacZ 가 형질 도입된 섬유아세포를 주사한 조직에서는 별 변 화가 없었다. 세포를 주입한 지 2주와 4주 후에 생쥐를 희생시켜 각각의 조직 표본을 제작하여 골형성 정도를 조사하였다. 피하 조직과 근육 조직 모두에서 2주째에 는 주위 조직과 잘 구분되는 해면골로 구성된 골조직의 형성을 관찰할 수 있었으며(Fig. 10A, B, 11A,B), 4주 째에는 치밀골, 골수를 갖춘 성숙된 골조직이 형성되었 음을 관찰할 수 있었다(Fig. 10C, D, 11C, D). 주사한 3마리 모두에서 골형성이 관찰되었다.

Fig. 8.In vivo bone formaion of AdBMP7 injected into calf mus- cles.

B

A

C

AdBMP7 AdLacZ

Fig. 9.In vivo bone formation of AdBMP7-transdued human fibroblasts injected into sub- cutaneous tissues (A) and calf muscles (B)

A AdLacZ/Fb

AdBMP7/Fb

B

AdBMP7/Fb AdLacZ/Fb

Fig. 7.Construction of a recombinant BMP7 adenovirus (AdBMP7) and expres- sion of BMP7 from AdBMP7.

A B C

M 1 2 M 1 2 3 4

1

2 kb

3 - 1.6 - 1 - 0.5 -

3 - 1.6 - 1 - 0.5 -

GAPDH kb

고 찰

BMP7은 osteogenic protein-1 (OP-1)으로도 알려 져 있는데 431 아미노산으로 이루어진 분자량 49 kDa 의 단백질이다. 세포 내에서 합성된 후, 절단 및 당화 (glycosylation) 과정을 거치면서 139 아미노산의 성숙 단백질이 된 후 골형성 활성을 가지는 것으로 알려져 있 다⁶⁾. 그리고 BMP7은 골형성 이외에 신장과 눈의 발생 에 중요한 역할을 하는 것으로도 알려져 있다^15,19).

골형성 및 재생을 유도하는 것으로 잘 알려진 BMP 중에서도 골형성 및 재생 연구와 관련하여 BMP 유전자 치료제 및 재조합 BMP 단백질의 활용은 BMP2가 대부 분이며 일부 BMP4, BMP7이 보고되어 있다³⁾. BMP7 을 유전자 치료제로 이용한 것은 Breitbart 등에 의해 처음 보고되었는데⁵⁾ BMP7 레트로바이러스 벡터를 제 작하여 골막세포를 형질 도입 한 후 이를 PCA 운반체에 이식하고 토끼의 두개골 결손 모델에 적용하므로 골형성 및 재생에 BMP7 유전자 치료제가 활용될 수 있음을 제 시하였다. BMP7 아데노바이러스를 사람 섬유아세포로 형질 도입 한 후 이를 젤라틴 스폰지에 넣어 면역 결핍 생쥐의 피하 조직으로 이식하였을 때 3주 후 골형성이 이루어짐을 확인하였으며 더 나아가 쥐의 두개골 결손 모델에서도 골재생 효과가 있음을 보고하였다¹⁷⁾. BMP7 아데노바이러스를 콜라겐 운반체와 섞어 직접 피하나 근

육으로 이식하였을 때 역시 4주 이내에 골형성이 유도됨 을 확인하였다⁹⁾. BMP7 레트로바이러스 벡터를 토끼의 골막에서 유래된 중배엽 간세포로 형질 도입한 후 이를 토끼의 슬관절 골연골 결손 모델에 적용하였는데 8-12 주 후 완전한 골 재생 효과가 있음을 보고하였다²⁰⁾.

본 연구 결과에서 제작된 AdBMP7의 골형성 능력을 조사한 결과, AdBMP7 바이러스 자체를 근육에 주사하 였을 경우 골형성이 유도됨을 관찰할 수 있었다. 더욱이 AdBMP7 바이러스를 사람 섬유아세포로 형질 도입하고, 이 세포를 이용하여 피하 조직과 근육 조직에서 골형성 능을 조사한 결과 2주에 해면골이 생성되고, 4주에 성숙 된 골수와 치밀골을 갖춘 성숙된 골조직이 형성됨을 관 찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 개발된 AdBMP7 유전자 치료제는 다른 연구자들에 의해 보고 된 BMP7 유전자 치료제들과 비교할 수 있을 정도로 골 형성에 매우 효과적임을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연 구 과정을 통하여 개발된 AdBMP7을 직접 또는 AdBMP7 을 형질 도입한 세포를 세라믹, 콜라겐, PLCA 등과 같 은 다양한 운반체에 부착하여 여러 가지 근골격계 질환 모델 즉, 두개골 결손, 척추 융합, 골연골 손상 등에 적 용하여 골형성 및 재생에 활용할 수 있도록 해야 할 것이 다. BMP7 유전자 치료제를 개발하는 과정에서 BMP7 을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 제작하므로 Fig. 10.Histological examination for bone formation of AdBMP7-

transduced human fibroblasts injected into subcutaneous tis- sues.

A

C

B

D

Fig. 11.Histological examination for bone formation of AdBMP7- transduced human fibroblasts injected into calf musles.

A

C

B

D

골형성 및 재생에 활용할 수 있는 세포 치료제의 가능성 을 조사하였다. BMP7을 발현하는 세포 치료제 개발에 대한 연구 보고는 아직 없다. 본 연구에서 개발된 HEK- 293/BMP7 세포가 면역 결핍 생쥐의 피하 및 근육 조 직에서 골형성을 유도하였지만 HEK293 세포가 불멸 화된 사람 세포이므로 이 세포에서 유래된 암조직이 동 시에 형성됨을 관찰할 수 있었다. 따라서 현재로서는 직 접 세포를 활용한 세포 치료제로 사용하기에는 어려움이 있을 것이다. 그러나 이 세포를 대량으로 배양하여 세포 밖으로 분비되는 BMP7 단백질을 분리 정제하여 활용 할 수 있는 방법을 개발하면 유용할 것이다.

결 론

본 연구에서 개발된 BMP7 발현 HEK293 세포와 재 조합 BMP7 아데노바이러스는 in vitro 및 in vivo 실 험에서 골형성 및 재생에 유용하게 활용될 수 있을 것으 로 생각한다.

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