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의한 신장 세포고사 억제에 미치는 영향
Melatonin and Cranberry Attenuate Infection-induced Apoptotic Renal Damage in a Vesicoureteral Reflux Rabbit Model
Sun Wook Kim, Chang Hee Han
From the Department of Urology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea
Purpose: We evaluated the protective effects of melatonin and cranberry on infection-induced renal damage in a rabbit model of vesicoureteral reflux (VUR).
Materials and Methods: Thirty-six New Zealand male rabbits were divided into the following 5 groups: 1) control, 2) VUR, 3) E. coli, 4) cranberry, and 5) melatonin. After creating unilateral VUR, infection was induced by intravesical instillation of an E. coli suspension. Cranberry powder was supplied with the feed. Melatonin was injected into the peritoneal cavity.
Three weeks after surgery, the rabbits were sacrificed, and the kidneys were extirpated and examined histopathologically to evaluate inflamma- tion, fibrosis, and tubular changes. Apoptosis in the renal tissue was assessed with a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deo- xyuridine triphosphate (dUTP) in situ nick-end labeling (TUNEL) study.
Results: Grossly, the refluxing kidney was larger than the contralateral normal kidney, and the refluxing ureter was dilated and tortuous. Micro- scopic examination of the kidneys from the E. coli group showed an apparent periglomerular mononuclear cell infiltration, tubular dilatation and atrophy, and interstitial fibrosis. The kidneys from the reflux, cran- berry, and melatonin groups showed mild mononuclear cell infiltration without interstitial fibrosis. The mean number of apoptotic cells in the kidneys of the E. coli group was significantly higher than that in the control, cranberry, and melatonin groups (p＜0.05), but there was no signi- ficant difference between the cranberry and the melatonin groups.
Conclusions: This study demonstrates that the balance of apoptotic activity may play a key role in the development of reflux nephropathy. Melatonin and cranberry may prevent infection-induced renal damage by attenuating apoptosis. (Korean J Urol 2008;49:937-944)
Key Words: Vesico-ureteral reflux, Apoptosis, Cranberry, Melatonin
대한비뇨기과학회지 제 49 권 제 10 호 2008
가톨릭대학교 의과대학 비뇨기과학교실
김선욱ㆍ한창희
접수일자：2008년 6월 3일 채택일자：2008년 8월 14일
교신저자: 한창희
가톨릭대학교 의정부성모병원 비뇨기과
경기도 의정부시 금오동 65-1
480-130
TEL: 031-820-3128 FAX: 031-847-6133 E-mail: [email protected]
서 론
방광요관역류는 배뇨 중 소변이 요관을 통하여 신장으로 역류하는 질환으로 신손상을 유발하여 소아에서 고혈압 및 만성 신부전을 일으키는 가장 흔한 원인 중의 하나이다. 현
재까지 예방적 항생제 사용부터 수술적 치료까지 다양한 치료법이 시행되고 있으며 이런 치료의 목적은 신손상의 진행을 막아 신부전을 예방하는 것이다. 따라서 방광요관 역류에서 신손상의 기전을 알기 위해 다양한 동물을 이용 한 많은 실험과 연구 결과들이 발표되어 왔다. 그러나 아직 까지 역류성 신손상의 병태생리는 명확하게 정립되지 않았
으며 역류성 신손상 발생에 있어 요로감염 및 세포 고사가 관련되어 있음이 보고되고 있다.1-5
감염에 의한 신손상 기전으로 병원균의 독성에 의한 직 접적인 신손상 외에도 최근에는 oxygen free radical에 의한 세포고사가 제시되고 있다. Roberts 등6은 실험적으로 유발 시킨 신우신염 동물모델에서 antioxident superoxide dismu- tase의 항염 작용을 보고하여 항산화제가 oxygen free radical 에 의한 세포사멸을 억제할 수 있음을 보고하였다.
멜라토닌은 세포고사를 효과적으로 억제하는 것으로 알 려져 있으며 인체에 큰 부작용이 없어 여러 임상분야에 적 용되고 있고,7 생활에서 쉽게 접할 수 있는 크랜베리 역시 항산화작용에 의해 신손상의 예방에 도움이 되는 것으로 알려져 있다.8 저자는 이 실험을 통해 방광요관역류를 유발 시킨 동물모델에서 발생한 요로 감염 및 세포 고사와 신손 상의 병태생리를 확인하고 멜라토닌 및 크렌베리의 신손상 억제 효과를 확인하여 방광요관역류 환자의 증상 개선 및 삶의 질 향상에 도움이 되고자 하였다.
대상 및 방법 1. 실험 동물
생후 2개월된 뉴질랜드산 수컷 토끼 (Samtako, 오산, 한 국)를 1주일간의 적응기간을 거친 후 사용하였다. 동물들은 18-21oC의 온도와 50%의 습도를 유지시키며 12시간씩 밤과 낮의 밝기를 지켜주었고, 토끼 표준의 적절한 사료와 물을 공급하였다.
2. 방광요관역류 모델
실험동물을 25ml/kg의 케타민과 10ml/kg의 xylazine을 근 주하여 마취시킨 후, 하복부 정중절개를 통해 방광을 노출 시켰으며 방광을 정부에서부터 경부 직상부까지 절개하여 양측 요관구를 노출시켰다. 25 게이지의 angio needle sheath 를 좌측 요관구를 통해 요관으로 넣은 뒤, 방광 내 요관을 전층에 걸쳐 12시 방향에서 절개하였으며 방광경부의 손상 이 일어나지 않도록 주의하였다.9,10 방광은 4-0 polydioxa- none (PDS)를 사용하여 봉합을 하였고, 복벽은 4-0 chromic catgut을 사용하여 봉합하였다. 방광요관역류 발생 여부는 수술 2주 후에 방광조영술로 확인하였으며 방광요관역류 가 2등급 이상으로 발생하지 않은 경우 실험에서 제외하고 그 수만큼 추가의 수술 및 처치를 시행하였다.
3. 실험군
실험을 시작하기 전에 방광조영술과 요배양검사를 시행 하여 방광요관역류와 요로감염이 없는 것을 확인하였으며
방광요관역류시술 3주 뒤 토끼를 도살하여 방광요관역류 가 발생한 쪽의 신장을 채취하여 분석하였다.
1) 대조군 (n=4): Sham 수술을 시행한 군으로 방광을 절개 한 후 아무런 조작도 하지 않고 봉합하였다.
2) 방광요관역류군 (n=8): 방광요관역류 수술 후 세팔로 스포린 (50mg/kg)을 매일 주사하여 무균뇨를 유지시켰다.
3) E. coli 투여군 (n=8): 방광요관역류 수술 후 방광 내에 E. coli를 주입하여 요로감염을 유발시켰다.
4) 크랜베리 투여군 (n=8): 방광요관역류 수술 후 E. coli 를 주입하여 요로감염을 유발시키고 1g/kg의 크랜베리 분 말 (Hankintatukku, Finland)을 우유와 혼합하여 사료와 함께 공급하였다.
5) 멜라토닌 투여군 (n=8): 방광요관역류 수술 후 E. coli 를 주입하여 요로감염을 유발시키고 20mg/kg의 멜라토닌 (Sigma, St. Louis, USA)을 5% 에탄올에 녹여서 수술 직후 와 매주 1회씩 복강 내에 주사하였다.
4. E. coli 투여
급성신우신염으로 확진받은 소아의 요배양검사에서 동 정된 E. coli (P67)의 표현형검사를 통해 P-fimbria와 hemoly- sin 생성 여부를 확인한 뒤 LB 배양액에서 배양하여 사용하 였다. 실험동물에 감염을 유발시키기 위해 생리식염수 1ml 에 대장균 105마리가 포함되도록 희석시킨 후 요도를 통해 방광까지 삽입한 카테터를 통하여 방광 내에 주입하였다.
각 군의 감염 여부를 확인하기 위해 실험이 끝날 때까지 요배양검사를 주 1회 정기적으로 실시하였다.
5. 검체 조직 채취
실험동물을 도살한 후 역류방광요관역류가 유발된 신장 을 채취하여 병리조직학적 검사와 TUNEL (terminal deoxy- nucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine tripho- sphate (dUTP) in situ nick-end labeling) 검사를 위하여 10%
포르말린 용액에 24시간 동안 고정시킨 후 파라핀에 포매 한 후 파라핀 절편을 만들었다.
6. 병리조직학적 검사
파라핀 포매한 신장 조직을 두께가 5μm가 되도록 조직 절편을 만들어 hematoxylin-eosin (H&E) 염색을 실시하여 광 학현미경으로 관찰하였다. 신장을 채취할 때 신장과 요관 의 육안적 변화를 먼저 살펴보고, 실험군을 모르는 두 명의 병리의가 간질 내의 단핵염증세포 침윤, 간질의 섬유화, 세 뇨관의 확장 및 위축 여부를 관찰하였다.
7. TUNEL 검사
각 실험군에서 원위치 세포고사 검출장비 (ApopTag Pero- xidase kitⓇ, Intergen Co., USA)를 이용하여 TUNEL 방법으 로 신장조직에서의 세포고사를 확인하였다. 준비된 조직을 크실렌으로 처리하여 탈파라핀화하고 각종 에탄올로 재함 수화시킨 후 phosphate buffered saline (PBS)로 세정하였다.
20μg/ml의 단백분해효소 K로 처리한 후 내인성 퍼록시다 제 활성을 제거하기 위하여 3% 과산화수소수로 처리하였 다. 75μl의 평형완충액으로 10초간 처리한 후 즉시 TdT 효 소로 습윤실에서 반응시켰다. 반응중지/세척 완충액 (stop/
wash buffer)으로 반응시킨 후 항디곡시제닌 (anti-digoxi- genin)으로 처리하고 퍼록시다제 (peroxidase)로 처리하였다.
각 군의 TUNEL 조직 슬라이드에서 신장 조직 전체 중 10개 의 영역을 400배 고배율시야에서 관찰하여 양성으로 염색 된 세포수를 측정한 후 평균값을 산출하였다.
8. 통계 분석 방법
통계 분석은 윈도우용 SAS 8.2 프로그램을 사용하였으며 결과치들은 평균값과 표준편차로 표시하였다. 통계 검정은 비모수검정법인 Kruskal-Wallis test를 시행하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적 유의성을 가진 것으로 판정하였다.
결 과 1. 조직학적 검사
육안으로 방광요관역류를 유발한 쪽의 신장이 반대쪽 신장보다 커져 있으며, 요관의 확장 및 비틀림이 있는 것을 관찰할 수 있었다. 광학현미경을 통해 각 군별 조직학적 차 이를 비교했을 때 대조군에서는 염증 소견이나 간질의 섬 유화 등의 조직학적 변화가 없었고, 방광요관역류군에서는 간질의 섬유화는 관찰되지 않았으나 경도의 단핵세포 침 윤을 관찰할 수 있었다. 크랜베리 투여군과 멜라토닌 투여 군에서는 조직학적 변화와 세포침윤이 방광요관역류군과 유의한 차이가 없었다. E. coli 투여군에서는 사구체 주위의 단핵세포 침윤과 세뇨관의 위축을 동반한 확장소견이 여 러 곳에서 관찰되었고 간질 내 단핵세포의 침윤과 섬유화 도 발견되었으며 일부 E. coli 투여군의 세뇨관에서는 확장 소견과 함께 미세한 크기의 고름집을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1).
2. 세포고사에 의한 신손상
대조군과 방광요관역류군의 신장 조직에서는 TUNEL 검 사 양성세포가 거의 관찰되지 않았다 (Fig. 2A, B). 반면 E.
coli 투여군에서는 다수의 양성세포가 관찰되었으며 (Fig.
2E, F), 크렌베리와 멜라토닌 투여군에서는 대조군에 비해 양성 세포가 증가되었으나 E. coli 투여군보다는 현저히 적 은 수의 양성 세포가 관찰되었다 (Fig. 2C, D).
감염에 의한 역류성 신손상 발생에 있어 세포고사의 역 할을 알아보기 위해 대조군, 방광요관역류군, E. coli 투여군 의 신장조직 내 TUNEL 양성 세포수를 비교하였다. E. coli 투여군의 양성 세포수는 32.87±4.64/HPF로 대조군의 2.23±
0.89/HPF와 방광요관역류군의 2.76±1.73/HPF보다 통계적으 로 유의하게 높았다 (p＜0.05). 요로 감염에 의한 신손상에 대한 크랜베리와 멜라토닌의 방어효과를 알아보기 위하여 E. coli 투여군, 크랜베리 투여군, 멜라토닌 투여군의 신장조 직 내 TUNNEL 양성 세포수를 비교하였다. E. coli 투여군의 양성 세포수는 크랜베리 투여군의 10.08±3.14/HPF, 멜라토 닌 투여군의 9.66±2.09/HPF보다 통계적으로 유의하게 높았 고 (p＜0.05), 크랜베리 투여군이 멜라토닌 투여군보다 높게 측정되었지만 통계적 유의성은 없었다 (Fig. 3).
고 찰
방광요관역류와 신손상과의 상관관계를 알기 위해 다양 한 동물을 이용한 많은 실험과 연구 결과들이 발표되어 왔 다. 그러나 아직까지 역류성 신손상의 병태생리는 명확하 게 정립되지 않고 있다. 또한 역류성 신손상 발생에 있어 요로감염이 필수요소인지에 대해서도 아직 논란이 있다.
Han 등8은 방광요관역류 토끼모델을 이용한 실험을 통하여 oxygen free radical에 의해 무균성 방광요관역류가 신손상을 유발할 수 있다고 보고하였고 Hodson 등11은 무균성 방광요 관역류에서도 높은 압력이 동반되면 요폐색이 발생할 때와 유사한 상황이 발생하여 의미 있는 신반흔이 형성될 수 있 다고 발표하였으며, Paltiel 등12은 동물실험을 통하여 무균 성 방광요관역류를 유발시킨 결과 정상 신장에 낮은 압력 으로도 부분적인 신반흔 형성, 간질의 만성적 염증과 섬유 화가 발생할 수 있다고 발표하였다. 반면 Smellie와 Nor- mand13는 합병증이 동반되지 않은 방광요관역류 환자들을 추적 관찰한 결과 지속적으로 예방적 항생제를 복용한 환 자들에게는 새로운 신반흔이 형성되지 않았다고 보고하였 다. 저자들의 경우 방광요관역류군에서 경도의 염증반응과 함께 세포고사가 다소 증가되는 소견을 보였으며, 이는 무 균성 방광요관역류가 신손상을 일으킬 수 있음을 시사한 다. 그러나 E. coli를 투여하여 감염을 유발시킨 경우와 비교 해서는 그 정도가 미약하여 감염이 신손상을 심화시킬 것 으로 생각한다.
세포고사는 건강한 세포와 질병이 있는 세포의 균형을
Fig. 1. Histologic findings from the kidneys obtained 3 weeks after surgery. There was no histologic change and inflammation in the control group (A); there was a mild mononuclear cell infiltration in the vesicoureteral reflux (VUR) group (B), mild-to-moderate mononuclear cell infiltrations in the cranberry (C) and melatonin (D) groups, but a marked periglomerular mononuclear cell infiltration and tubular dilatation with atrophy and interstitial fibrosis in the E. coli group (E, F) (H&E, x200).
Fig. 2. The terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) in situ nick-end labeling (TUNEL) study in the rabbits' kidneys. Kidneys from the control and VUR groups showed few apoptotic cells (A, B). There was a marked increase in apoptotic cells in the E. coli group (E, F). Apoptotic cells are frequently found in the cranberry (C), and melatonin (D) groups. Arrows indicate apoptotic cells (x400).
Fig. 3. Mean number of apoptotic cells in each group. (A) Mean number of apoptotic cells of the E. coli group is higher than the control and VUR groups. (B) Mean number of apoptotic cells of the cranberry group and the melatonin group is lower than the E. coli group.
VUR: vesicoureteral reflux; *: p＜0.05 compared with the other group.
조절하는 데 중요한 역할을 하며, 특히 신우신염이 있는 경 우 손상된 세포를 제거하는 역할을 한다. Chertin 등14은 방 광요관역류에 의해 신반흔이 발생한 조직에서 세포고사가 증가된 소견을 관찰하여 세포고사의 증가가 신손상의 중요 한 병태생리라고 하였으며, Sencan 등4은 방광요관역류 동 물모델에서 caspase-8과 caspase-9 경로를 통한 신장조직 내 세포고사의 증가를 관찰함으로써 신손상 발생에 있어 세포 고사의 역할을 보고하였다. 저자들의 경우에도 대조군에 비해 E. coli 투여군에서 세포고사가 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있어 감염으로 인한 신손상 발생의 병태생리에 세포고사가 관여할 것으로 생각한다. 반면 Guvel 등5은 방 광요관역류 동물모델에서 세포고사가 감소되었다고 보고 하였는데, 그들은 실험 동물을 42일 후 희생시킨 것으로 그 기간 동안 상처 치유가 끝나 세포고사의 활동이 감소되었 을 가능성이 있으며 또한 동물 모델도 쥐를 사용하여 저자 들의 토끼와 달라 실험 환경에 영향을 받았을 가능성도 있다.
최근 이러한 세포고사를 억제하기 위한 여러 물질들이 논의되고 있다. 그중 멜라토닌은 여러 연구를 통하여 세포 고사 억제효과가 증명된 물질로, 원형질막 (plasma mem- brane)의 MT1/MT2 수용체에 결합하여 세포고사를 조절하 는 것으로 알려져 있으며15 Reiter 등16은 멜라토닌이 항산화 작용을 통하여 세포고사를 억제한다고 보고하였다. 또한 Imamoglu 등17은 신우신염을 유발한 동물실험에서 멜라토 닌이 신장의 보호에 효과가 있음을 보고하였다. 본 실험에 서도 멜라토닌 투여군에서 E. coli 투여군보다 신장의 염증 소견 및 세포고사가 유의하게 적어 신손상이 적게 일어났
음을 확인할 수 있었다.
한편 크랜베리는 멜라토닌에 비해 일상생활에서 좀 더 쉽게 접할 수 있고 저렴하게 구입할 수 있어 쉽게 임상 적 용이 가능한 식품이다. 크랜베리는 미국을 비롯한 서양에 서 17세기경부터 소화불량, 간질환 등에 민간요법처럼 쓰 여 왔으며 항생제가 널리 사용되기 전에는 요로감염의 치 료에도 사용되었다.18 이전에는 크랜베리의 항요로감염 효 과가 hippuric acid의 배설 증가에 의한 세균 활성 억제 및 소변의 산화에 의한 것으로 생각하였다. 그러나 크랜베리 를 사용한 여러 실험에서 fructose나 proanthocyanidins와 같 은 성분이 요로감염을 유발하는 대장균의 요로상피로의 부 착을 억제하여 요로감염을 예방한다는 것이 증명되었다.19 최근에는 크랜베리의 주성분인 proanthocyanidins의 항산 화작용이 대두되면서 실생활에 접목하려는 여러 노력이 이 루어지고 있으며 Park 등20은 크랜베리가 항상화작용 및 항 염작용이 있어 만성전립선염 환자에서 증상 완화 및 재발 방지에 효과가 있다고 하였다. 그러나 신우신염에서 크랜 베리와 세포고사의 관계에 대한 연구는 아직 부족하며 주 로 종양에서 크랜베리의 효과가 연구되고 있다. Kresty 등21 은 크랜베리가 식도선암세포를 고사시키는 효과가 있어 항 암효과가 있다고 보고하였으며, Sun 등22은 유방암에서 p21 의 증가 및 Cyclin D1과 CdK4의 감소를 통하여 세포고사를 유발한다고 보고하였다. 반면 Johnson-Varghese 등23은 쥐를 이용한 동물 실험에서 크랜베리의 주요성분인 proanthocy- anidins가 항산화작용을 통해 폐세포의 세포고사를 방지한 다고 보고하였으며 Bagchi 등24은 proanthocyanidins가 심근 세포고사를 예방한다고 보고하였다. 저자들은 본 실험을
통하여 크랜베리 투여군에서 E. coli 투여군보다 신장의 염 증소견 및 세포고사가 유의하게 적어 신손상이 적게 일어 났음을 확인할 수 있었으며 크랜베리 투여군, 멜라토닌 투 여군 사이에는 유의한 차이가 없었다. 이는 크랜베리도 멜 라토닌과 비슷한 정도의 세포고사를 억제하는 효과가 있음 을 시사한다. 이런 결과는 기존의 종양에서 세포고사를 유 발하는 것과는 상반되는 결과로 신우신염에서는 아마도 크 랜베리가 항산화작용에 의해 신손상을 억제하여 세포고사 가 감소한 것으로 생각한다.
결 론
저자들은 본 연구를 통하여 크랜베리와 멜라토닌이 방광 요관역류가 있는 토끼에서 세포고사억제를 통한 감염성 신 손상 예방에 도움이 될 것으로 생각한다. 이는 크랜베리와 멜라토닌이 방광요관역류가 있는 환아에서 예방적 항생제 요법의 보조요법으로 시도될 수 있음을 시사하며, 향후 크 랜베리와 멜라토닌의 실제 임상 적용을 위해서는 더 많은 기초적, 임상적 연구가 필요할 것으로 생각한다.
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