44(2) : 131∼ 137 (2013)
131
Ferric Chloride 로 유도된 렛트 경동맥 손상 및 혈전에 대한 수용성 엉겅퀴 잎 추출물의 혈행 개선 효과
강현주1·김현수2·전인화3·목지예2·정승일4·심재석1·장선일2,3*
1임실생약영농조합법인, 2전주대학교 보건관리학과, 3(주)아토큐앤에이, 4전주생물소재연구소
Ameliorative Effect of the Water Extract from Cirsium japonicum var.
ussuriense Leaves on Blood Circulation in a Rat Model of Topical Ferric Chloride-Induced Carotid Artery Damage
Hyun Ju Kang1, Hyeon Soo Kim2, In Hwa Jeon3, Ji Ye Mok2, Seung-Il Jeong4, Jae Suk Shim1, and Seon Il Jang2,3*
1Imsil Herbal Medicine Association, Imsil 566-895, Korea
2Department of Healthcare & Science, Jeonju University, Jeonju 560-759, Korea
3Ato Q&A Incorporation, Jeonju 560-759, Korea
4Jeonju Biomaterials Institute, Jeonju 561-360, Korea
Abstract − The present study has been undertaken to investigate the effect of the extract of Cirsium japonicum var. ussuriense leaves (CLE) on blood circulation in a rat model of topical ferric chloride (FeCl3)-induced carotid artery damage. FeCl3 treatment seriously damaged the carotid artery such as the walls of the artery, blood flow and inflammation. However, CLE administration has ameliorated blood circulation and suppressed vessel inflammation. CLE administration also has ameliorated the FeCl3- induced artery tissue damage. Furthermore, CLE significantly suppressed the expression of adhesion molecules. These results suggest that CLE ameliorate blood circulation through suppress inflammatory mediator and adhesion molecule production.
Key words − Cirsium japonicum var. ussuriense, Leaf extract, Blood circulation, Ameliorative effect, Anti-inflammation
혈전(thrombus)은 혈관 속에서 피가 굳어진 덩어리를 말 하는데, 혈전으로 인해 생기는 질환을 혈전증(thrombosis)이 라 한다.1) 우리 몸은 여러 가지 혈전형성인자와 조절인자가 균형을 이루고 있어서, 정상인에서는 과도한 혈전이 만들어 지지 않지만, 혈전형성억제에 관여하는 인자들의 균형이 깨 지게 되면 혈전이 형성될 수 있다.1,2)뇌졸중, 심근경색과 같 은 죽상동맥혈전 또는 혈전 뇌경색은 혈관의 평활근 세포 증식, 혈관 내피세포 염증, 혈소판 응집에 영향을 미친다.1-3) 혈관질환은 크고 작은 크기의 근육성 동맥의 병리학적 상 태이고 혈관내피세포의 기능장애에 의해 유발된다.3,4) 이러 한 혈관 손상은 병원체, 산화된 저밀도지방(low density lipid, LDL)과 기타 염증 자극 면역세포와 같은 요소들이 활성화 되기 때문이다.3-6)이와 같이 혈관 손상이 진행되면, 혈관내
피세포는 사이토카인과 케모카인 그리고 부착분자(adhesion molecules)들을 방출하여 염증을 더욱 악화시키는 요인이 된 다.7,8) 그러므로 혈관손상과 관련된 혈행장애 질환을 치료하 기 위해서는 염증관련 사이토카인과 부착분자의 발현을 조 절할 수 있는 물질 개발이 필수적이다. 일반적으로 혈행장 애와 관련된 심혈관계질환에 사용되고 있는 대표적인 약물 은 rivaroxaban, enoxaparin, warfarin, vitamin K antagonist 와 aspirin 등이 자주 사용되는데, 장기간 복용하면 약물 내 성과 함께 부작용이 유발될 수 있다.9,10) 그러므로 최근에는 천연물에서 혈행개선에 관련된 물질을 발굴하기 위해서 연 구가 활발히 전개되고 있다.11-14)
엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense)는 국화과 (Compositae)에 속하는 다년생 초본으로 한방에서 전초를 대계라하고, 뿌리를 대계근으로 활용해왔다. 잎, 줄기, 꽃과 씨 등 지상부는 개화시기에서 씨가 여무는 5-6월에 채취하 고, 뿌리는 가을에 채취하여 건조시킨 후 열수 또는 알콜 추
*교신저자(E-mail):[email protected] (Tel): +82-63-220-3124
출에 의한 약성분을 토혈, 혈뇨, 대하, 간염 및 고혈압 등 치 료에 활용해왔다.15-18) 동의보감16)에 의하면 엉겅퀴는 성질 은 평(平)하고 맛은 쓰며[苦] 독이 없으며, 어혈이 풀리게 하 고, 코피를 흘리는 것을 멎게 하며 옹종과 옴과 버짐을 낫 게 할 뿐만 아니라 여자의 적·백대하를 낫게 하고 정(精) 을 보태 주며 혈을 보한다고 기록되어 있다. 엉겅퀴는 플라 보노이드 계열의 화합물이 풍부하여 항염증, 항암, 항돌연 변이, 항진균, 신경보호, 간보호 및 면역 증진 활성을 가지 고 있다.19-23) 그러나 혈관손상 및 혈전 개선에 대한 연구보 고는 지금까지 보고된바 없다.
최근에 저자 등은 엉겅퀴의 부위별 항산화 및 항염증 효 과에 대해 연구 보고한 바 있다.24,25) 본 연구는 엉겅퀴 잎을 대상으로 열수 추출하여 혈관손상에 따른 염증억제 및 혈 류 개선효과를 알아보고자 ferric chloride(FeCl3)에 의해 경 동맥 손상을 유도한 후 엉겅퀴 잎 추출물(Cirsium japonicum var. ussuriense leaf extract, CLE)을 경구투여하고 그 효과 를 조사한 바 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
재료 및 방법
시약 − Tumor necrosis factor-α(TNF-α)와 intracellular adhesion molecule(ICAM-1) 등 ELISA kit은 R&D Systems 사(Minneapolis, USA)로부터 구입하였으며, FeCl3, hemato- xylin & eosin(H&E)와 기타 시약은 Sigma-Aldrich사(St.
Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
엉겅퀴 잎 추출 − 실험에 사용한 전라북도 임실군 오수면 소재 임실생약영농조합법인에서 재배한 엉겅퀴(Cirsium japonicum var. ussuriense) 잎은 2011년 5월 30일에 채취하 여 우석대학교 한의과대학 방제학교실의 김홍준 교수에게 의뢰하여 동정하였고, 표본(#2012-053)은 전주대학교 대체 의학대학 건강관리 연구실에 보관하고 있다. 잘 건조된 시 료는 200 g을 분말로 제조하여 증류수(3 L)로 3시간 동안 추 출기로 열수 추출하였다. 추출물은 0.45 µm 필터를 사용하 여 여과한 후 동결건조기(Eyela FDU-2100, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)에서 건조하여 48.9 g을 회수한 후 -20oC 에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
실험동물 − 무균환경에서 사육된 8주령 수컷 Sprague Dawley rat(SD rat; 240-290 g)는 중앙실험동물(서울)로부터 구입하였다. 1주일의 순화기간을 거친 후 무작위로 6마리씩 배정한 다음 실험에 사용하였다. 실험동물은 전 실험기간 동안 고형사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였으며, 사 육환경 온도 23±3oC, 밤낮주기(12시간)가 조절되는 환경에 서 사육하였으며 전주대학교 실험동물위원회의 실험 규정 에 준하여 실행하였다.
FeCl3를 이용한 경동맥 혈전 유발 동물모델 제작 − 실험 전 체중을 측정하고 Kurz 등26)의 방법에 준하여 zoletil (0.1 ml/체중 100 g, 복강투여)로 마취한 후 체온조절장치에 고정하여 수술을 진행하였다. 어깨선이 이어지는 목 부근의 피부와 근육을 절개하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의 하여 왼쪽 경동맥을 노출시킨 후 유발 전 Doppler flow
Fig. 1. Experimental scheme of topical FeCl3-induced carotid artery damage and administration of CLE in rats.
probe(MyLab 25, Esapte, Italy)로 초음파를 측정하여 혈류 속도(blood flow rate), 혈관 지름(blood vessel diameter), 혈 관 면적(blood vessel area), 혈류량(blood flow amount)을 측정한 후 70% FeCl3 를 적신 filter paper(3×5 mm)를 10분 간 접촉시켜 유지하였다. 그 후 filter paper를 제거하고 초 음파를 측정하여 혈전유발을 확인하고 수술부위를 봉합한 후 정상군과 대조군은 생리식염수(2 mL/마리)을 투여하였 고, 실험군은 생리식염수 2 mL에 CLE(100 mg/kg) 또는 aspirin(5 mg/kg)을 20일간 경구투여하였다(Fig. 1).
항혈전 효능 및 혈관조직 H&E 염색 − CLE를 20일 간 경구투여한 후 Fig. 1과 같이 Doppler flow probe를 이용하 여 혈류속도, 혈류량, 혈관지름, 혈관면적을 측정하여 혈전 유발 전의 결과와 개선정도를 비교하였다. 혈전유발 부위 혈관의 조직학적 관찰을 위해 혈관 양쪽을 단단히 고정하 고 경동맥을 3~4 mm 적출하여 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 파라핀에 포매한 후 절편(두께 5 µm)을 제작하였 다. 혈관 조직의 조직학적 변화를 관찰하기 위해 H&E 염 색을 실시하여 광학현미경(Leica DMRB, Germany)을 이용 하여 관찰하였다.
사이토카인 및 ICAM-1 − 실험동물로의 간문맥으로부터 정맥혈액을 채취하고 4oC 냉장상태에서 약 12시간 보관 후 3,000 rpm으로 원심분리하여 혈청을 얻고 TNF-α와 ICAM- 1를 측정하였다. 혈청내 TNF-α와 ICAM-1량은 anti-mouse TNF-α 또는, anti-mouse ICAM-1 항체를 사용하여 각각에
특이적으로 작용하는 ELISA kit을 사용하여 R&D Systems 사가 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다. 요약하 면, 5배 희석 혈청 100 µL을 각각의 항체가 코팅된 plate에 주입하고 반응시킨 후 잘 세척한 다음 horseradish peroxidase 가 부착된 2차 항체를 주입하고 반응시킨 후 발색 기질을 주입하고 반응시켜 ELISA reader로 측정하였으며, 각 물질 에 대한 정량은 각각의 물질을 농도별로 처리하여 반응시 켜 표준곡선을 정하고 혈청에 함유된 물질의 량을 계산하였다.
통계처리 − 모든 실험값은 평균±표준편차로 표시했으며, 통계분석은 ANOVA와 Student’s t-test로 처리하였으며, 유 의성 한계는 p<0.05로 정하였다.
결 과
FeCl3 유도 경동맥 혈전 혈관에 대한 CLE의 Doppler 효과 − 본 연구는 FeCl3로 유도된 렛트 경동맥의 혈관상태 와 혈류에 미치는 CLE의 효과를 알아보았다. 정상군의 혈 관상태와 혈류는 일정한 상태의 doppler를 보였지만, FeCl3 로 처리하여 혈관 손상 및 혈전을 유발한 대조군는 정상군 에 비해 doppler 관찰결과 현저히 억제되는 것을 확인하였 다. 그러나 CLE(100 mg/kg)를 하루에 1회씩 20일 동안 경 구 투여한 후 doppler를 관찰한 결과 혈전유발 대조군에 비 해 혈관 및 혈류가 개선된 것을 확인하였다(Fig. 2). 이러한 CLE의 혈관 및 혈류 개선 효과는 참고약물로 사용한 aspirin
Fig. 2. Effects of CLE on vessel doppler in topical FeCl3-induced carotid artery injury. Rats were orally administrated with CLE (100 mg/kg) or aspirin (5 mg/kg) once daily for 20 days after topical FeCl3 treatment at carotid artery injury. Vessel doppler was measured as described in the section of Materials and Methods.
의 doppler 관찰결과와 유사하였다.
혈류속도, 혈관지름, 혈관면적, 혈류량에 대한 CLE의 효 과 − 본 연구는 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 20일간 CLE 를 투여한 후 초음파 장비를 이용하여 혈류 속도, 혈관 지 름, 혈관 면적, 혈류량을 측정하였다. 정상군(혈류: 13.31±1.81 cm/sec; 혈관직경: 0.164±0.007 cm; 혈관면적: 2.23±0.21 mm2; 혈류량: 17.82±2.51 ml/min)에 비해 혈전유발 대조군에서 모 든 수치(혈류: 7.32±0.74 cm/sec; 혈관직경: 0.121±0.008 cm;
혈관면적: 1.28±0.11 mm2; 혈류량: 7.12±1.90 ml/min)가 유 의하게 감소하였고(p<0.001), CLE 투여군은 혈전유발 대조
군에 비해 모든 수치(혈류: 9.37±2.64 cm/sec; 혈관직경:
0.156±0.019 cm; 혈관면적: 2.051±0.056 mm2; 혈류량: 12.8±
5.04 ml/min)가 유의적으로 혈행이 개선된 것을 확인하였다 (p<0.05). 특히, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으 로 개선되었으며 대조약물로 사용한 aspirin과 비슷한 수준 으로 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 3).
TNF-α 및 ICAM 생성에 대한 CLE의 억제 효과 − FeCl3 로 유도된 혈전모델에서 20일간 CLE를 투여한 후 염증유 발 인자인 TNF-α와 부착분자인 ICAM을 측정하였다. 정상 군은 TNF-α와 ICAM의 혈청내 함량이 베이스 수준인데 비
Fig. 3. Effects of CLE on blood flow rate, vessel diameter, vessel area and flow amount in topical FeCl3-induced carotid artery injury. Same as in Fig. 2. Values represent the means±SE of n=5 individuals. #p<0.05 versus normal group. *p<0.001 versus control group.
Fig. 4. Effects of CLE on TNF-α and ICAM levels in topical FeCl3-induced carotid artery injury. Same as in Fig. 2. TNF-α and ICAM levels were measured using ELISA kits. Values represent the means±SE of n=5 individuals. #p<0.001 versus normal group.
*p<0.05 versus control group.
해 혈전유발 대조군은 혈청내 TNF-α와 ICAM이 각각 595.6±55.4 pg/mL과 319.8±12.7 pg/mL으로 현저히 증가한 반면(p<0.001), CLE 투여군은 TNF-α와 ICAM이 각각 320.5.6±80.3 pg/mL과 175.2±20.7 pg/mL으로 유의하게 억 제되는 효과가 있었다(p<0.05). 이러한 CLE의 TNF-α와 ICAM 억제 효과는 참고약물인 aspirin과 유사하였다(Fig. 4).
FeCl3 유도 경동맥 혈전 혈관에 대한 CLE의 조직학적 개선효과 − 본 연구는 FeCl3를 이용한 경동맥 혈관 손상 후 20일 동안 CLE를 투여한 후 경동맥을 적출한 후 파라핀 절 편(5 µm)을 제작하여 H&E로 염색하고 조직학적 변화를 관 찰하였다. FeCl3로 유발된 혈전 혈관 대조군의 혈관은 정상 군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부분이 상당히 손상되고 두 터워졌으나, 엉겅퀴 잎 추출물을 투여함으로써 혈전 생성이 감소되고 혈관내의 교원 섬유의 손상도 억제되는 것을 확 인하였다(Fig. 5).
고 찰
인체 내에서 혈액은 응고와 용해작용이 항상 평형을 이루 고 정상적으로 순환하고 있는데, 스트레스를 비롯한 활성산 소, 과도한 LDL 등 여러 가지 요인에 의해 혈전이 형성된 다.3)혈전은 심장 또는 혈관 내에 굳어진 혈액 덩어리로 혈 관내피세포의 손상과 더불어 혈액순환 장애을 일으켜 조직, 기관의 각종 병리증상을 일으키게 된다.1-6) 혈전으로 인한 인체질환은 뇌출혈, 뇌졸증, 심부전, 심장마비 등 뇌혈관질 환과 심장질환을 들 수 있다.6)노인성 혈전은 혈관의 죽상 동맥경화는 혈소판 응집력의 항진에 의한 혈전 형성의 직접 원인이 되며, 혈관 손상에 따른 염증반응이 진행되면 혈전 이 가속화되어 혈관계 질환을 악화시킨다.7-9)특히, 혈전으 로 인한 뇌혈관 질환과 심장 질환은 연령이 높아질수록 그
발병률이 높아 사망의 주요 요인이 되고 있기 때문에 이를 예방하고 치료하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.10-14)
현재 뇌졸중 및 심혈관계 질환을 일으키는 혈전을 효과적 으로 예방하기 위해 혈전 분해효소제, 혈전분해제, 항응고 제, 항혈소판제 등 많은 치료제들이 사용되고 있다. 혈전분 해효소는 streptokinase, urokinase, aminocaproic acid, numbrokinase 등이 사용되고 있으며,27) 항응고제로는 heparin, wafarin 및 dicunarol 등이 있고,28)항혈소판제로는 aspirin, dipuydanol, cilostazol 등이 있다.27,29)이들 약물은 혈전 치료 또는 개선하는데 효과적이지만, 장기간 사용할 경우 출혈 촉진, 소화성궤양 및 위장관 손상 등 부작용이 있 는 단점이 있다.27-29) 따라서최근에는 합성약물 및 생물약품 에 비해서 부작용이 없는 천연물 유래 약물 개발에 대한 관 심이 높아지고 있다. 본 연구는 전통적으로 토혈, 혈뇨, 대 하, 간염 및 고혈압 등 치료에 활용15-17)해 온 엉겅퀴를 대 상으로 렛트 혈전 모델에서 그 효과를 조사하였다.
본 연구는 FeCl3로 유도된 렛트 혈전모델에서 20일간 엉 겅퀴 잎 추출물인 CLE를 투여한 후 초음파 장비를 이용하 여 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 모든 수치가 현저하게 개선되었 다. 특히, 혈관 지름과 혈관 면적은 정상군의 수준으로 개 선되었으며, 대조약물로 사용한 아스피린과 비슷한 수준으 로 효과가 있음을 확인하였다(Fig. 3). 이러한 결과는 본 연 구에서 처음으로 밝혔다.
엉겅퀴는 apigenin, luteolin, myricetin, kaemferol, pectolinarin, 5,7-dihtdroxy-6,4'-dimethoxyflavone, hispidulin- 7-neo-hesperioside flavonoid, luteolin, myricetin, kaemferol, pectolinarin, 5,7-dihydroxy-6,4'-dimetethoxy flavone, hispidulin- 7-neo-hesperioside 등 플라보노이드 계열의 화합물이 풍부하 게 함유되어 항염증, 항암, 항돌연변이, 항진균, 신경보호 및 면역 증진에 대한 생리활성이 우수한 것으로 알려졌다.16-24) 특히 엉겅퀴 성분 중 apigenin은 잎, 줄기, 꽃 등에 함유된 물질로 예방 효과 및 신경 보호 효과, 항염증, 항균작용 등 의 생리 활성이 있다고 알려졌다.19-23) 최근에 저자 등은 엉 겅퀴 부위별 항산화 효과를 조사한 결과 뿌리보다 잎과 꽂 부위가 황산화 효과가 우수하여 잎 추출물을 대상으로 염 증 매개물인 nitric oxide와 prostaglandin E2을 효과적으로 억제하는 결과도 보고하였다. 더불어 엉겅퀴 잎을 대상으로 열수 추출하여 적혈구의 항용혈 효과를 조사한 결과 항용 혈 효과가 매우 우수함을 보고하였다.24) 그러나 CLE를 대 상으로 FeCl3로 유도된 렛트 혈전모델에서 혈관 염증과 관 련된 TNF-α와 ICAM에 대한 억제 효과에 대한 보고는 없 는 실정이다.
따라서 본 연구는 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 20일간 CLE를 투여한 후 염증유발 인자인 TNF-α와 부착분자인 ICAM을 측정한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 TNF-α와 Fig. 5. Effects of CLE on histological chanes of blood vessels
in topical FeCl3-induced carotid artery injury. Same as in Fig. 2.
Blood vessels were stained using H&E (Original magnification:
×100).
ICAM을 효과적으로 억제하는 결과를 얻었다(Fig. 4). TNF- α는 대표적인 전염증성 사이토카인으로 손상 받은 조직에 서 증가되어 혈액응고를 촉진하는데, 혈관이 손상 받을 경 우 혈관내 혈액을 응고시켜 혈전을 촉진함으로써 혈전관련 뇌혈관 및 심혈관계 질환을 촉진시킬 수 있다.4,7,31) FeCl3가 처리된 경동맥은 심한 손상으로 혈관내 급성 염증이 진행 되어 혈전을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 활성산소뿐만 아니라 TNF-α와 같은 염증유발인자와 백혈구의 화학주성 (chemotaxis)을 촉진하는 ICAM 분자발현을 촉진시켜 염증 반응을 악화시킨다.6,32) FeCl3로 유도된 혈전모델에서 CLE 의 투여는 참고약물로 사용된 aspirin 과 유사하게 ICAM의 생성을 억제시키는 우수한 효과가 있었다. 이러한 결과는 CLE가 FeCl3로 유발된 혈관손상으로부터 염증반응을 효과 적으로 억제하여 혈전을 개선하는 효과를 발휘할 수 있음 을 제시해주었다.
마지막으로 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 CLE의 염증개 선을 통한 혈전 개선효과를 확인한 후 혈관의 조직학적 개 선 효과를 알아보았다. 그 결과 혈전유발 대조군에서는 혈 전이 유발됨으로써 정상군에 비해 혈관내의 교원 섬유 부 분이 상당히 손상되고 두터워졌으나, CLE를 투여한 실험군 에서는 혈전 생성이 감소되었고, 혈관내의 교원 섬유의 손 상도 억제되는 것을 확인하였다(Fig. 5).
이상의 결과를 종합해볼 때 CLE는 FeCl3로 유도된 혈전 모델에서 혈류 속도, 혈관 지름, 혈관 면적, 혈류량을 측정 한 결과 혈전유발 대조군에 비해서 모든 수치가 현저하게 개선시키는 효과가 있었으며, 혈관 지름과 혈관 면적은 정 상군의 수준으로 개선되어 대조약물로 사용한 아스피린과 비슷한 수준으로 효과가 있음을 확인하였다. 또한 FeCl3로 유도된 혈전모델에서 CLE는 염증유발 인자인 TNF-α와 부 착분자인 ICAM을 효과적으로 억제하였다. 이러한 결과는 CLE가 FeCl3로 유발된 혈관손상으로부터 염증반응을 효과 적으로 억제하여 혈전을 개선하는 효과를 발휘할 수 있음 을 제시해주었다.
사 사
이 논문은 2011년도 지역산업기술개발사업(#R0000122) 사업으로 한국산업기술진흥원의 지원을 받아 연구되었다.
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(2013. 4. 9 접수; 2013. 4. 23 심사; 2013. 5. 7 게재확정)
