약학회지제 54 권제 5 호 392-397 (2010)
Yakhak Hoeji Vol. 54, No. 5
Quercetin
에 의한 혈관어완효과에 대한 알코올의 추가적인 역할진영배 • 제현동^
대구가틀릭대학교 약학대학 약물학 교실
(Received July 23, 2010; Revised September 29, 2010： Accepted September 29, 2010)
The Synergistic Effect of Additional Ethanol Exposure on Quercetin-induced Vasorelaxation in a Vasoconstrictor-dependent Manner
Youngbae Jin and Hyun Dong Je^
Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Catholic University of Daegu, Gyeongbuk 712-702, Korea
A b s tra c t — The aim of present study was to investigate the possible influence and related mechanism of additional alcohol on the flavonoid- induced arterial relaxation. Agonist-induced vascular smooth muscle contractions involve the activation of thick or thin filament pathway. However, there are no reports addressing the question whether this pathway is involved in quercetin-induced relaxation cotreated w ith alcohol in rat aortae contracted with phorbol ester, fluoride or thromboxane A2
m im etic U-46619. We hypothesized that cotreated alcohol plays a role in vascular relaxation evoked by quercetin in rat aor
tae. Endothelium-denuded arterial rings from male Sprague-Dawley rats were used and isometric contractions were recorded using a computerized data acquisition system. Quercetin inhibited phorbol ester, fluoride or thromboxane A^- induced contraction regardless of endothelial function. However, alcohol didn't decrease any agonist-induced contraction.
Interestingly, only in thromboxane A2-induced contraction, synergistic results were observed in aortae denuded and cotxeated w ith quercetin and alcohol suggesting that additional pathways different from antioxidation or endothelial nitric oxide synthesis m ight be involved in the vasorelaxation. In conclusion, in the agonists-contracted rat aortae, quercetin and alcohol together showed synergistic response regardless of endothelial function in an agonist-dependent manner.
K e y w o rd s □ alcohol, fluoride, phorbol ester, quercetin, Rho-kinase, thromboxane mimetic, vasoconstriction
고혈압에 영힘별주는 요인으로 경제적 수준, 비만, 식 습관, 신체 활동, 흡연,음주, 스트레스, 가족력 등이 있다고생 각된다.« 특히 주의 경우적정량의 알코을을섭취하면심혈관 질환의 위험을감소시키는 것으로보고되고었고^'® 과량또는
만성 섭취의 경우그위험성이 중가되는 것으로 생각된다.^> 그
런데이것은주로 내피세포에의한산화질소유리와관련이 있 는것으로보고되었는데 저용량의알코올은내피세포에 의한산 화질소유러룰증가시켰고 고용량알코을이나만성섭취는내 피기능을손상시켜 산화 질소의 을감소시켜® 작용하는 것으로생각된다.
폴러페놀화합물인폴라보노이드는식물의뿌리, 즐기, 열매등 에함유되어 있으며, 폴라보노이드의 항암, 항염증, 항바식러스,
***본논문에 관한 문의는저자에게로 (견화) 053-850-3615 (팩스) 053-850-3602 (E-mail) [email protected]
연구 뇌졸 항알러지등의 생리활성이 보고되었다.®* 역학적 및실험적 결과를종합할때이런폴라보노이드들은심혈관계질환,
중등에관련이 깊고이들질병을예방하고발생을억제하는것 으로 알려져 많은 제품들이 시관되고 었는 실정이다. 그 중
quercetin은앙파, 사과, 딸기 , 포도주, 기타식물속에 널러존재 하는폴라보노이드로서 건강상유용성과생리활성 때문에 많은 관심이 집중되고있다(Fig. 1)7' 관련연구결과 quercetin은내 피기능을활성화시키거나항산화효과로혈관이완을초래하는 것으로알려져 있다. 또한알코올은매우오래된 식품이지만향 정신성약품이면서 득성물질이다. 즉알코을과량섬취또는만 성중득의 경우고혈압, 동맥경화등심혈관계 질환을초래하는 것으로알려져 있다. 그런데 저농도알코을의 혈관이완효과의 경우 내피에 의한 산화 질소 생성®이외에 알려진 바가 없고
quercetin과 ethanol의상호작용에의해나타나는혈관효과에대
해서도알려진바가거의 없다.
효능약이나증가된 혈관내압에 대한혈관평활근수측은 칼슘
Quercetin 에의한혈관이완효과에 대한알코을의추가적인 역할 393
0 H
CKJercetin
Fig. 1 - Chemical structure of quercetin.
과칼모듈린에 의한마어오신의 조절성 경사슬의 인산화를포함 하는고견적인 평활근의 생화학적 경로에주로 의존한다. 이들 경로의 존재는분리된혈관평활근에서 세포내 칼슘에대한형 광측정과전기영동적 평가로직접적으로 확인되었다. 혈관평 칠근수측의개시가마식오신의 20 k D a 경사슬인산화의 칼슘의 존적증가에의해 전적으로조절된다고 생각되었지만*^> 다른경 로듬도세포내칼슘이온의 증가와상관없이 마이오신의 20 kD a
경사슬인산화률조절하여 평활근수축성을조절한다고생각된
다.9-II} 마이오신경사슬인산화는악틴과머식오신의 상호작용
과평활근수측을촉진한다. 그런데 마이오신 경사슬 인산화나 수축의 정도는세포내 칼슘이온농도와언제나평행하지는앉다.
효능약자국에의한마의오신경사슬인산화나수축력의 정도는 대개세포내 칼슘이온농도상증가에 의한 것보다더높고, 이 현상은소위칼슘이온감작이라고설 명 된 다 따 라 서 마의오신 경사슬인산화수준과수축정도를조절하는추가조절기전이 제안 되었다. 즉 R h o G E Fs(guanine nucleotide- exchange fectors),
R ho A , Rho-kinase 등에의한마이오신 탈인산화효소의 억제가
칼슘이온감작에서주요한경로라는것이뒤이은연구들에서 밝 혀졌다.^^
Thromboxane A2는 throm boxane synthase 에 의^ pro
staglandin Hg 이성질체화를 통해 주로 혈소판에서 생성되는
arachidonic a d d의불안정한 대시산물이다. T hrom boxane A j는 평활근수측과증식 , 혈소판모양번화와응집등을유도한다. 그
것의 작용은' 0 단백결합수용체인 throm boxane 수용체률통
해매개되며 throm boxane A；；수용체에 throm boxane Ag가결합 되면 Gq/ii을통해 phospholipase C p가활성화되어 세포질내 유 리칼슴이온농도가증가되고 칼슘이온감작이 일어난다. 그런 데 thromboxane A2자체가불안정하기에 안정한 throm boxane
A2 유사체인 U-46619가흔히 사용된다. 다양한 평활근에서
thromboxane 유사체인 U-46619는수측을유도하고 이것은
세포내 칼슘이온동원과칼슘이온 감수성증진에 기인된다. 이 번실험에서 세포내신호전달에 대한 throm boxane A2의다양한
효과때문에 flavonoids에의한평활근이완에관련된신호전달
경로률조사하기위한유용한도구로 throm boxane A # 사용하
였다. Throm boxane Ag에의한 수죽에 RhoA /Rho-kinase 경로 활성화가포 함 된 다 또 한 유사한기전으로 fluoride도있으며 이와 대조적으로 주로 th in filam ent 조절을 통해 작용하는
phorbol ester도 사용되었다. 그러나 quercetin 단득 또는
quercetin과 ethanol 병용에 의한혈관평활근이완에서 이러한
경로가 억제되는지에 대한문헌상보고는 없었다. 따라서 이번 실험의 목적은폴라보노이드 quercetin 단득또는 저농도알코
을을함께사용하여 flavonoids 또는알코올에 의한대동맥 혈관
조절관찰과이에 대한항산화또는 내괴에 의한산화질소생
성외에 칼슘이온 탈감작에 대한 M E K 또는 RhoA/Rho-kinase
활성 억제의 역할을설명하는것이다.
실험방법
재료, 시약 및 기기
다옴과 같은 약품이 사용되었다. P otassium chloride(Sigm a, St. Louis, M O , U SA), U-46619(Sigma), sod ium bicarbonate (Sigm a), pentobarbital sodium (D ongw on, Korea), sodium fluoride(Sigm a), porbol 12,13-dibutyrate(Sigma), acetylcholine (Sigma), quercetin(Sigma), D-(+ )-glucose(Sigma), SD(Sprague- D aw ley) 쥐 (H yochang Science, Korea). 그외다른시약은특급
또는 일급으로사§"하였다. 약품은 3차증류수에 용해되어 필요
에따라 K rebs 용액이나생러식염수에 첨가되었다.
실험과정
본실험은 U S National In stitu te of H e a lth (N IH , 1996)에의 해즐판된 실험동물의 care와 use에대한 guide에따라서 수행 되었다. 무게 2 5 0 ~ 3 5 0 g의성숙한 웅성 Sprague-Dawley 쥐가 실험에사용되었다. 실험동물은분리된 상자에 개별적으로수용 되었고 1주일 이상사료와물이 충분히 공급되었다. 실험 당일
pentobarbital sodium (50 m g/kg)을 복강으로투여하여 마취시키 고고정시켰다.
대동맥 적출
중부 절개로흉곽이 열렸고 수술도구로 심장과 주번 부위룰 노출시켰다. 심장과폐는분리되지 않았고대동맥 적출을위한 충분한공간을 확보하기 위해좌측으로 밀어서 생리식염수로적 셔진 천으로덮었다. 대동맥은간근처에서 심장부근까지 적출
되었고죽시차가운 Krebs 용액에담꿔졌다. 대동맥내 혈액과각
중결체조직은제거되었다. 대동맥은 4 m m 길이의 고리로잘려 졌다.
기계적 활성 측정
동맥의고리 조각은 2개의 금속같고리로수조내 현수되었다.
394 진영배 ■제현동
아래쪽같고리는수조바닥에고정되었고 위쪽같고리는등장력 번환기에 연결되었다. 등장력번환기의 신호는 physiograph에표
시되었다. 수조의 부피는 2 0 m /이고수조내 용액은 37°C에서
95% € > 2와 5 % C O ^토포화되었다. Krebs 용액의 조성은다옴과 같다. N aC l, 118.4; K C l, 4.7： C aC lj, 2.5： M g C lj, 1.18：
N a H C O j, 25; K H ^PO ^, 1.2： glucose, 11.7 용액의 최중 p H는
7.4~7.5S_ 유지되었다. 1 시간의평형기간동단휴지기장력은 2.0 g
으로조절되었다. 평형기간후대동맥 고리는 50 m M K C l로자 극되었고 근육이층분히수축할경우실험이시작되었다. 용량-
빈움곡선을얻기위해 혈관수축제들이수조내로투쉬되었다. 결 과는 5 0 m M K C l에의한대조수측의 %로표시되었다.
통계 분석
모든실험걸과들은평균±표준오차로나타내었고통계처리는
Student's t-test를실시하여 p < 0 .0 5률기준으로 유의성여부를 관정하였다.
실험결과
내퍼가 제거된 쥐 대동맥에서 thromboxane Aj에 의한 수측에 대한 quercetin 단독 또는 quercetiii파 ethanol 병용의 어완효과
분리된쥐대동맥의휴지기장력은공기틀통한 Krebs 용액관
류 60분후안정상태에도달하였고휴지기 장력은2 . 0 조 절하였다. 물리적으로내피가제거된쥐대동맥에서 thromboxane A2에의한수축에 대한 quercetin의효과를조사하였다. 금속봉
을쥐대동맥 고리 안에 넣고 3 ~ 5회돌려 내괴를제거하였다.
5 0 m M K C l에의한수측에 대한 l | iM acetylcholine의이완이
2 0% 이하일경우내피가제거되었다고관단하였다. 내피가제거 된쥐대동맥에서 폴라보노이드단득또는 알코을병용투여의 기저수측에대한효과는없었고(data not shown) thromboxane A j(l(T구M )에의한수측에 대해 quercetin(0.1 m M ) 단득은유의
성있는이완효과가있었지만알코을단득(3% ethanol)은유의
성있는이완효과가없었다(Fig. 2, Fig. 3). 그런데 quercetin과
A
B
C
D
■il
t 0.1 |jM T h ro m b o x a n e h i m im e tic w ith co n tro l (A ), q u e rc e tin (B ), e th a n o l (C ) o r b o th (D ).
Fig. 2 - A representative tracing of vasorelaxation induced by pretreated quercetin or alcohol in rat aortic rings with endothelium denuded contracted with 0.1 |oM U46619. Each muscle was pre treated with control (A), quercetin (B), ethanol (C) or both quercetin and ethanol (D).
0 10 20 30 40 50 60 70 T im e (m in )
Fig. 5 - The effect of pretreated quercetin or ethanol on 1 phorbol 12,13-dibutyrate-induced vascular contraction in the absence of endothelium. Developed tension is ex
pressed as a percentage of the maximum contraction to 50 m M KCl. Data are expressed as means of 3-5 experiments with vertical bars showing SEM . *P <0.05,
**P<0.01, presence versus absence of quercetin or alcohol.
0 10 20 30 40
Tim e (min)
50 60 70
Fig. 4 - The effect of pretreated quercetin or ethanol on 8 m M fluoride- induced vascular contraction in the absence of endothelium. Developed tension is expressed as a percentage of the maximum contraction to 50 m M KCl.
Data are expressed as means of 3-5 experiments with vertical bars showing SEM . *P<0.05, **P<0.01, presence versus absence of quercetin or alcohol.
Quercetin 에의한혈관이완효과에대한알코을외 추가적인역할 395
0 10 20 30 40 Time (min)
50 60 70
또는 알코울병용투여의 기저수축에 대한효과는없었고(data
n o t show n) fluoride( 8 m M )에의한수■측에대해 quercetin 단'득 은유의성 있는이완효과를보였고알코올단득은효과가 없었 다(Fig. 4). 그런데 quercetin과알코을병용은 quercetin 단득파 유사한 효과률보였다(Fig. 4). 따라서 알코을은 Rho-kinase 활 성에 대한 억제 효과가 전혀 없는 것으로 생각된다. 또한
quercetin 단득또는 알코올병용투여에 의한이완기전은 비항
산화 및내피 비의존성이며 endothelial nitric oxide synthase, cyclooxygenase product prostacyclin, endothelium -derived hyperpolarising factor 등이 관여하지 않는다고생각된다.
Fig. 3 - The effect of pretreated quercetin or ethanol on 0.1 U46619- induced vascular contraction in the absence of endothelium. Developed tension is expressed as a percentage of the maximum contraction to 50 m M KCl.
Data are expressed as means of 3-5 experiments with vertical bars showing SEM . *P<0.05, **P<0.01, presence versus absence of quercetin or alcohol.
알코을병용은완전한 이완효과를 보였다. 따라서 quercetin와 알코을의 이완기전은다르며 quercetin 단득또는 알코을병용 투여에 의한 이완기전은 비항산화성 및내피 버의존성이며
endo± elial nitric oxide synthase, cyclooxygenase product prostacyclin, endothelium-derived hyperpolarising factor 등이
관여하지 않는다고생각된다.
내퍼가 제거된 쥐 대동팩에서 fluoriddMI 의한 수측에 대한 quercetin 단득 또는 quercetin과 ethanol 병용의 이완효과
물리적으로내피가제거된 쥐대동맥에서 폴라보노이드단득
내퍼가 제거된 쥐 대동맥에서 phorbol esteiOII 의한 수측에 대한 quercetin 단독 또는 quercetin과 ethanol 병용의 이완효과
Phorbol ester의경우주로 th in filam ent regulation를활성화 시켜 혈관평활근을 수측시킨다고알려져 었다. 물리적으로 내 괴가 제거된쥐대동맥에서 폴라보노이드 단득또는 알코올 병 용투여의 기저수죽에대한효과는없었고(data n o t show n) 전 처처된 quercetin 단득은 phorbol 12,13-dibutyrate(l(T®M)에의 한수측에 대해 거의 완견한억제효과를보였지만알코을 단득 은전혀효과가없었다(Fig. 5). 그런데 quercetin과알코올병용 은 quercetin 단득보다약한이완효과를보였다(Fig. 5). 따라서
quercetin에 thin filam ent 조절에 대한억제기능이 있으며 알코
올에 th in filam ent 조절 억제 기능이 없을 뿐 아니라 병용된
quercetin의작용을감소시킨다고생각된다. 또한 quercetin 단득 또는 알코을병용투여에 의한 이완기전은비항산화성 및내피
c o -
^ o s
^ c o o
0/0
0 0 0
0 0
0 0 0
8 0
6 4 2 0 8 6 4 2
1 1
1 1
1
uolloejluo
나
%
396 진영배 • 제현동
비의존성이며 endothelial nitric oxide synthase, cydooxygenase product prostacyclin, endothelium-derived hyperpolarising
factor 등이 관여하지않는다고생각된다.
고 찰
식물에분포하는플라보노이드에 다양한 생리활성이 있으며
그중 quercetin은심혈관계 조절활성이 있는것으로보고되고
있는데주로항산화또는내피 산화질소생성을통해 작용하는 것으로알려져 있다. 또한함께시용된 알코을의 경우심혈관계 질환을 악화시키는것으로알려져 있으나최근연구결과에따 르면저농도에서 내피의산화질소생성으로오히려 혈압을저하 시키는 것으로밝혀졌다. 따라서이번 실험에서 내피를 제거한
혈관을 이용하여 quercetin 또는알코을의 추가기전을조사하
게되었다. 한편혈관수측기전에효능약자극에의한마이오신 경사슬인산화나수축력의정도는대개세포내 칼슘이온농도상 중가식1 의한것보다더높으며 이현상은소위 칼슘이온감작이 라고설명된다.^® 따라서 마식오신 경사슬인산화수준과수측정 도를조절하는추가조절기전이 제안되었다. 즉 P K C , M E K에의 한 th in filam ent 조절이나 R h o G E F s(g uanine nucleotide- exchange fectors), R h o A, Rho-kinase 등에 의한마이오신 탈 인산화효소의 억제가칼슘이온감작에서 주요한경로라는것이 뒤이은 연구들에서 밝혀졌다. 에률들어 phorbol ester는 M E K , E R K에의한 thin filam ent 조절을통해서, throm boxane A j는 L-
type 칼슘통로를통해 칼슘이온유입을 유도하고 R ho A / Rho-
kinase 활성화률통해 칼슘이온감작을일으킨다고알려져 있다.
이전까지는 quercetin이나알코을이 항산화작용이나내피의존 적으로혈관을이완시킨다고보고되었다. 그런데내괴가제거된 쥐대동맥에서 Rho-kinase 활성화와 L-type 칼슘통로를통한 칼슘유입으로작용한다는 throm boxane 에의한수죽미에 대 해 quercetin은유의성 있는이완효과를보였다(Fig. 2, Fig. 3).
따라서 quercetin에의한이완기전은버항산화성 및내피 비의
존성이며 endothelial nitric oxide synthase, cydooxygenase product prostacyclin, endothelium-derived hyperpolarising
factor 등어관여하지 않는다고생각된다. 또한알코을단득은 전
혀효과가없었는데 이전에 보고된이완효과는내피룰통한기 전으로 생각된다. 또한알코올과의 병용투여가 quercetin 단득 보다강력한이완효과룰보였기에 throm boxane Ag에의한혈관
평활근수측에서 quercetin 또는 알코올이 L-type 칼슘통로를
통한칼슘유입또는 Rho-kinase를억제하여 혈관을이완시킨다
고추측된다. Q uercetin과알코을어항산화또는내피를통해 작
용한다는것은이미여러문헌에서보고되었고따라서내피가제 거된 혈관에 대해이완을보이는것에혈관평활근자체에대한 활성이 관여될수있고이는간접적으로 quercetin 또는알코을
에악틴-마이오신상호작용을억제하는추가적인효과가있다는 것을의미한다.
Fluoride도 RhoA/Rho-kinase률활성화시켜 혈관평활근을수 측시킨다고알려져 있 다 . 내 피 가 제거된쥐대동맥에서 전처 치된 quercetin은 fluoride에의한수측에대해유의성있는억제
효과를보였고알코을과병용투여시 quercetin 단득과유사한
수측억제 효과를보였다(Fig. 4). 알코을과의 병용이 quercetin
단득과유사한혈관수측 억제효과를보였기에 적어도 fluoride
에의한혈관평활근수측에서 quercetin이 Rho-kinase률억제 하쉬혈관을이완시킨다고추측되며 알코을은그런기능이없는 것으로생각된다.
Phorbol ester는 M E K , E R K 등을활성화시켜혈관평활근을 수축시킨다고알려져 있다.^® 내피가제거된쥐대동맥에서 전 처치된 quercetin은 phorbol ester에의한수측에 대해 완전한 억제효과를보였고알코올과 병용투여시 quercetin 단득보다
약한 수측억제 효과를 보였다(Fig. 5). 알코을과의 병용이
quercetin 단득보다약한혈관수측 억제효과률보였기에적어
도 phorbol ester에 의한 혈관 평활근 수죽에서 quercetin은
M E K , E R K 등을억제하식 혈관을이완시킨다고추측되며알코
을은오히려 M E K , E R K 등을활성화시키는것으로생각된다.
본실험에서는심혈관계 질환, 뇌졸중등에 대해예방과치료
률목적으로사용될수있는 quercetin 단득또는알코을파의상
호작용에서의 혈관이완기전에 대해조사하늬 저농도알코을의 혈관이완기전, 알코올중득에서의주의 및새로운 7]능성을보
고자하였다. Quercetin은항산화나내괴에 대한작용외에 thin
filam ent 또는 thick filam ent 조절을통해평활근에직접작용하 여악틴-미오신상호작용을억제하쉬 작용하였고추가적인알코 올노출또는섬취는일부항고혈압치료제의 작용을증강시켜 저 혈압이나쇼크를악화시킬 수있으며그기견은내피와상관없
이 L-type 칼슘통로률통한 칼슘유입 억제등을통해 평활근
자체의악틴-미오신상호작용을억제하^ 작용하는것으로생각 된다.
결 론
본연구에서는고혈압, 당뇨병 등성인병에서 내피가손상되 기쉬우므로내피가제거된흰쥐 동맥혈관에 기전이 서로다른
phorbol ester, fluoride, throm boxane 등의수측제가투여되 었고 L-type 칼슘통로를통한칼슘유입또는 RhoA/Rho-kinase
활성화틀 통해 칼슘이온 감작을 일으킨다고 알려져 있는
thromboxane A2에의한수측에 대해 quercetin 또는 quercetin
과 ethanol이현저한이완효과가있옴을관찰하였다. 그런데동
일하게 RhoA/Rho-kinase룰활성화시켜 혈관평활근을수축시킨
다고알려져 있는 fluoride에의한 수축에 대해서는 전처치된
Quercetin 에외한혈관이완효과쉬1 대한알코을：의추가적인역할 397
quercetin 단득만수축억제효과가있었고알코올단득은효과가
없었다. 그런데 이전까지는 quercetin이나알코울이 항산화작용 이나내퍼의존적으로 혈관을이완시킨다고보고되었다. 따라서
thromboxane A2, fluoride 또는 phorbol ester에의한혈관평활 근수측에서의 flavonoids 또는 알코올노출의 이완반응은내피 비의존성이고항산화활성과도상관없으며 오히려 L-type 킬:슘
통로를통한칼슘유입 또는 Rho-kinase 활성에 작용하여 악틴
-미오신상호작용을불활성화할가능성이 있다. 향후알코을또 는 quercetin 등의 flavonoids의 RhoA/Rho-kinase 활성 억제효 과, m yosin phosphatase 활성증대 효과, M E K , E R K 의존성
th in filam ent 조절경로동을생화학적방법으로연구하고자한다.
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