신정원․전병열․김미영․최태윤․이유경*․김채현*

HBV-bDNA법과 혈청학적표지자 결과 간 비교 분석 및 불일치 검체에서의 PCR 시행 결과

신정원․전병열․김미영․최태윤․이유경*․김채현*

순천향대학교 의과대학 임상병리학교실, 순천향대학교 부천병원 임상병리과*

Comparison of the HBV-bDNA with Serologic Markers and the Results of PCR in Samples showing Discrepancy between Two Results

Jeong Won Shin, Byung Ryul Jeon, Mi Young Kim, Tae Yoon Choi, You Kyong Lee*, and Chae Hyun Kim*

Department of Clinical Pathology, Soonchunhyang University Hospital, Seoul;

Department of Clinical Pathology, Soonchunhyang University Bucheon Hospital*, Bucheon, Korea

Background：According to the development of molecular biology, many methods such as polymerase chain reaction (PCR), DNA-RNA hybridization, and branched DNA (bDNA) have been introduced to diagnose and monitor the hepatitis B infection. In our hospital, we have measured serum HBV DNA using the bDNA signal amplification assay to monitor the HBV infected patients treated with lamivudine since 1999. But sometimes we've had difficulties in interpretating the results of the samples showing weak positivity (2.5 - 10 pg/mL) because they were converted to negative when retested. In this study, we compared the results of bDNA with serologic markers and performed PCR in samples showing discrepancy between two results. Also, we investigated the samples showing weak positivity in bDNA.

Methods：We analyzed the results from 495 patients referred for the evaluation of HBV-DNA and serologic markers, over a period from November 1999 to June 2001. HBV-DNA quantitation was performed by VERSANT

HBV DNA Assay (bDNA) (Bayer Corp., NY, USA) and serologic markers by AxSYM

system (ABBOTT, IL, USA). In samples showing discrepancy between bDNA and serologic markers, we performed HBV-PCR. Also, we randomly selected 10 sera showing weak positivity in bDNA and performed bDNA retest and PCR with them.

Results：The bDNA and HBsAg were tested simultaneously in 293 among 495 patients and their concordant rates were 60%. The number of patients showing discrepancy between two tests were as followed: bDNA(+)/HBsAg(-), 5 patients (1.7%); bDNA(-)/HBsAg(+), 112 (38.2%). Seven patients showed both bDNA and anti-HBs positivity, and 5 of them were also HBsAg positive.

The concordant rate between HBeAg and bDNA were 75.3%, and the number of patients showing discrepancy were as followed: bDNA(+)/HBeAg(-), 79 patients (18.5%); bDNA(-)/HBeAg(+), 27 (6.3%). Among 10 sera showing weak positivity in bDNA, 6 showed negative results in retest and 4 of them were also negative in PCR.

Conclusions：It was thought that careful examination of the previous data and clinical findings is needed in patients showing weak positivity (2.5 - 10 pg/mL) in bDNA. Also, if necessary, further study such as PCR is needed to report the patient's data more accurately.

Key Words：HBV-bDNA, Serologic markers, HBV-PCR

교신저자：신정원

우) 40-743 서울시 용산구 한남동 657번지 순천향대학병원 임상병리과

전화：02-709-9423, FAX：02-790-5820

서 론

분자생물학적 기법의 발달에 따라 B형 간염 진단 및 치

Table 1. Nucleotide sequences of primers used for amplification of HBV DNA

Primers Sequences Amplified products

HBV-F 5'-ATGTTCTTATTGGTTCTTCT-3'

416 bp

HBV-R 5'-GTTAGGGTTTAAATGTATAC-3'

료 효과 판정에도 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction：PCR)을 비롯한 액상교잡법, 막교잡법, RNA- DNA 교잡법, branched DNA(bDNA)법 등 많은 방법이 도입되었다[1-3]. 이 중 bDNA법은 signal amplification 원리에 기초한 DNA 정량법으로서 수년 전부터 B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 사람면역결핍 바이러스 및 기타 여러 바이러스 검출 및 정량에 이용되고 있으며, 검사 방법이 비교적 간단하고 재현성이 우수한 것으로 보고되어 있다[4,5].

본원에서는 1999년 bDNA법을 이용한 B형 간염 바이러 스 정량 검사를 시작하여 현재 월 80-100건 정도를 시행 하고 있으며, 주로 B형 간염 진단 후 lamivudine 치료를 받는 환자의 추적 검사 목적으로 이용하고 있다. 그러나 간 혹 이와 같이 추적 검사를 받는 환자 중 bDNA 결과가 약 양성(2.5 - 10 pg/mL)이었다가 동일 검체 재검시 음성으 로 전환되어 판단에 어려움을 겪는 경우가 있다. 본 연구에 서는 그간 시행한 bDNA 결과를 혈청학적 표지자 검사 결 과와 비교 평가하는 한편, 약양성을 보인 검체로 PCR을 시행하여 그 결과를 검토하고자 하였다.

재료 및 방법 1. 대 상

1999년 11월부터 2001년 6월까지 순천향대학병원에 내원하여 HBV-bDNA 검사를 시행한 만성간질환 환자 610명 중 혈청학적 표지자 검사 결과와 비교가 가능하였던 495명을 대상으로 하였다.

2. 방 법 1) HBV DNA 정량

VERSANT

HBV DNA Assay (bDNA) (Bayer Corp., NY, USA)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 다음 과 같이 시행하였다. 즉, 먼저 lysis working reagent 10 µL를 capture probe가 부착되어 있는 capture well에 넣 고 여기에 환자 혈청과 4 종류의 표준물질, 양성 및 음성 대조물질을 각각 10 µL씩 넣은 후 63℃에서 30분간 반응시 켜 HBV DNA를 유리시켰다. 다음 target probe working reagent 10 µL를 각 capture well에 넣고 역시 63℃에 서 30분간 반응시킨 후 다시 neutralizing reagent 10 µL를 넣고 63℃에서 16-20시간 반응시켜서 유리된 단일 염기 가닥의 HBV DNA와 target probe 및 capture

probe를 결합시켰다. Capture well을 세척액으로 2회 세척 한 후, 여기에 bDNA가 포함되어 있는 amplifier working reagent를 40 µL씩 가하여 53℃에서 15분간 반응시켰다.

다시 2회 세척한 후 alkaline phosphatase가 결합되어 있는 label probe 40 µL를 넣고 역시 53℃에서 15분간 반응시킨 후 5회 세척하였다. 마지막으로 chemilumines- cent substrate 30 µL를 각 capture well에 넣고 37℃

에서 25분간 반응시킨 후 luminescence를 측정하였다.

HBV DNA 정량값을 얻기 위해서는 4종류의 표준물질의 relative luminescence units (RLU) 값으로 표준곡선을 작성한 후, Bayer Data Management Software를 이용 하여 각 검체의 RLU 값을 HBV DNA equivalents per milliliter (Eq/mL)로 환산하였으며, 약 2.5 pg/mL의 HBV DNA에 해당하는 700,000 Eq/mL 이상인 경우를 양성으로 간주하여 그 정량값을 보고하였다.

각 표준물질과 대조물질은 모두 중복검사를 시행하였고, 변이계수가 20% 이상인 경우 재검하였다.

2) B형 간염 혈청학적 표지자 검사

혈청 HBsAg, anti-HBs, HBeAg, anti-HBe, IgM anti-HBc 및 anti-HBc는 AxSYM

system(ABBOTT, IL, USA)을 이용하여 microparticle enzyme immunoa- ssay 방법으로 측정하였다.

3) HBV DNA PCR

Chapel 등[6]의 방법에 따라 pol 부위를 표적으로 하는 시발체를 사용하여 PCR을 시행하였으며(Table 1), 반응 완충액과 dNTP, Taq polymerase가 혼합되어 있는 Accu PowerTM PCR Premix (Bioneer, 한국)를 사용하여 최 종액 50 µL에 300-700 ng의 genomic DNA와 한쌍의 시발체 50 pmole을 각각 첨가하여 DNA를 증폭시켰다.

PCR 반응은 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, Cetus, USA)을 사용하여 95℃에서 5분간 1주기 를 시행한 후, 95℃에서 30초, 47℃에서 40초, 72℃에서 30초씩 40주기를 반복 시행하였고, 72℃에서 10분간 연장 반응을 시행하였다. 증폭된 DNA 산물은 ethidium bromide 를 첨가한 2% agarose gel에 20-30분간 전기영동한 후 416 bp 위치에서 band가 관찰되면 양성으로 판정하였다.

결 과

1. HBV bDNA와 혈청학적표지자 검사 결과 비교

Table 4. PCR results of the cases showing weak positivity in HBV-bDNA and their results of retested bDNA

Case No. bDNA (pg/mL)

First Retest PCR

1 4.3 < 2.5 -

2 3.2 < 2.5 +

3 4.7 2.7 -

4 7.4 < 2.5 -

5 2.7 2.5 +

6 6.1 7.2 +

7 3.5 < 2.5 +

8 4.1 7.2 +

9 2.7 < 2.5 -

10 3.0 < 2.5 -

Table 2. Comparison the results between HBV-bDNA and serologic markers

bDNA HBsAg Anti-HBs HBeAg Anti-HBs

+ - + - + - + -

+ 156(53.2)* 5( 1.7) 7( 2.7) 135(51.7) 168(39.3) 79(18.4) 67(19.8) 122(36.1) - 112(38.2) 20( 6.8) 14( 5.4) 105(40.2) 27( 6.3) 154(36.0) 123(36.4) 26( 7.7) * No(%) of patients

Table 3.

bDNA Serologic markers

No. PCR

HBsAg HBeAg Positive Negative

+ - - 5 1(20.0)* 4(80.0)

- + - 21 15(71.4) 6(28.6)

- + + 25 23(92.0) 2( 8.0)

* No(%) of patients

bDNA 검사와 HBsAg 동시 분석이 가능하였던 환자는 495명 중 293명이었으며, 이 중 176명에서 두 검사의 결 과가 일치하여 60%의 일치율을 보였다. 불일치를 보인 환자 중에서는 bDNA(+)/HBsAg(-)이 5명(1.7%), bDNA(-) /HBsAg(+)이 112명(38.2%)이었다. Anti-HBs와 bDNA 동시 양성인 환자는 7명이었는데, 이 중 5명은 만성간질환 환자로 HBsAg 역시 양성이었다. HBeAg과 bDNA 동시 분석은 428명에서 가능하였고, 322명에서 두 검사 결과가 일치하여 75.3%의 일치율을 보였다. 불일치를 보인 경우 는 bDNA(+)/HBeAg(-)이 79명(18.4%), bDNA(-)/

HBeAg(+)이 27명(6.3%)이었다(Table 2).

2. bDNA와 혈청학적표지자 검사 간 불일치 결과를 보 인 검체의 PCR 시행 결과

bDNA 검사에서는 2.5 pg/mL 미만으로 음성이지만, 혈 청학적표지자 검사 결과 HBsAg 또는 HBeAg이 양성으로

나타난 환자 중 검체량이 충분한 46명의 혈청 검체로 PCR 을 시행하였으며, 그 결과 HBsAg만 양성이었던 21명 중 15명(71.4%)이 PCR에서 양성 결과를 보였고, HBsAg과 HBeAg이 모두 양성 결과를 보였던 25명 중에서는 23명 (92%)이 PCR 양성으로 나타났다. bDNA에서만 양성으로 나타나고 HBsAg과 HBeAg은 모두 음성이었던 5명 중에 서는 1명(20%)만이 PCR 양성이었다(Table 3).

3. bDNA 검사에서 약양성 결과를 보인 환자의 재검 및 PCR 결과

B형 간염 진단 후 lamivudine 치료를 받으며 추적 관

찰을 받고 있는 환자 중 이전 검사에서 음성으로 전환이 되

었다가 다시 2.5 - 10 pg/mL의 약양성 결과를 보였던 환

자 10명을 무작위로 선정하여 bDNA 재검 및 PCR을 시

행하였으며, 그 결과 bDNA 재검에서 2.5 pg/mL 미만의

음성으로 전환된 경우가 6명이었고, 나머지 4명은 역시 약

양성 결과를 보였다. PCR은 10명 중 5명은 양성, 5명은 음성이었으며, bDNA 재검에서 음성 전환되었던 6명 중 4 명이 PCR 역시 음성이었다(Table 4).

고 찰

bDNA 검사는 각각의 바이러스 DNA에 특이한 probe 를 이용하여 환자의 혈청 내에 존재하는 바이러스 유전자를 포획한 후, 포획된 유전자에 다시 probe와 증폭체를 반응 시킴으로써 DNA를 정량하는 방법으로, 수년 전부터 B형 간염 바이러스를 비롯한 여러 바이러스의 진단 및 치료 효 과 판정에 이용되고 있다[7]. 이 방법은 기존의 HBV DNA 정량법에 비해 민감도가 우수하고 DNA 자체를 증폭 하는 PCR에 비해 위양성이 적은 장점이 있다고 보고되었 으며[4,5,8], 국내에서도 bDNA 검사의 재현성과 민감도 가 우수하고 검사 방법이 비교적 간단하여 시행에 어려움이 없다고 보고된 바 있다[2,7].

본원에서는 1999년 만성간질환 환자의 치료 효과 판정 목적으로 bDNA 검사를 시작하여 현재 주 1회씩 월 80- 100건을 시행하고 있는데, bDNA kit가 96개의 capture well과 4 종류의 표준물질 및 기타 probe들로 구성되어 있 고 표준물질과 양성, 음성 대조물질은 중복검사를 시행하기 때문에 대개 3회 정도로 나누어 1 kit를 소비하고 있다. 따 라서 -20℃에 보관하도록 되어 있는 표준물질들을 2회 이 상 얼렸다 녹이는 과정을 반복하게 되고, 이에 따라 표준곡 선이 다소 불안정하게 나올 가능성이 있는 현실이다.

본 연구에서는 그간 본원에서 시행한 bDNA 검사 결과 를 혈청학적 표지자 검사와 비교하고 상호 불일치 결과를 보인 검체에 대해서는 PCR을 시행하여 검토함과 동시에, lamividine 치료를 받으며 추적 검사를 받는 환자 중 이전 검사에서 음성 결과를 보였다가 약양성으로 전환된 환자를 대상으로 bDNA 재검 및 PCR을 시행하여 표준물질을 반 복 사용하였을 때의 안정성을 검토하였다.

혈청학적표지자 검사와의 비교 평가 결과, bDNA와 HBsAg의 일치율은 60%, HBeAg과의 일치율은 75%로 나타나 HBeAg과 bDNA의 일치율을 95%로 보고하였던 기 등[2]의 보고보다는 다소 낮게 나타났다.

bDNA와 HBsAg 검사 간에 불일치를 보인 환자 중 bDNA 양성이면서 HBsAg 음성은 293명 중 5명(1.7%) 이었는데, 이들을 대상으로 PCR을 시행한 결과 급성골수 성백혈병으로 골수이식을 받은 후 재발한 환자 1명에서만 양성 결과를 보였고, 나머지 4명은 모두 음성 결과를 보여 bDNA 검사의 위양성이 의심되었다. PCR 음성 결과를 보 였던 4명의 진단명은 각각 만성췌장염, 위선종, 위용종 및 신증후군이었다. 그러나 이 등[9]의 연구에서는 HBsAg 음 성 예 중 20%가 PCR 양성으로 나타나 만성 간염 환자의 일부에서 불 수 있는 혈청학적 검사의 위음성 결과가 의심

된다고 하였고, Brechot 등[10]도 HBsAg 음성 환자에서 HBV-DNA의 증식을 보고한 바 있어 본 연구에서도 HBsAg의 위음성 가능성을 완전히 배제할 수는 없을 것으 로 생각되었다. bDNA 검사는 음성이지만 HBsAg이 양성 이었던 환자는 112명(38.2%)이었는데, 이 중 21명에서 PCR을 시행한 결과 71.4%인 15명에서 양성 결과를 보였 으며, 이는 bDNA의 검출 한계가 2.5 pg/mL에 해당하는 0.7×10

Eq/mL인 것에 비해 PCR은 10

pg으로 보다 민감하기 때문으로 생각되었다[2,11].

bDNA와 HBeAg 간에 불일치를 보인 환자 중 bDNA 양성, HBeAg 음성은 428명 중 79명(18.5%)이었는데, 이는 HBeAg이 소실되고 항-HBe로 혈청학적 전환이 일어 나는 과정에서 DNA의 낮은 복제 상태를 bDNA가 보다 민 감하게 검출하였거나[12,13], HBeAg 음성이지만 B형 간 염 바이러스 DNA가 10

copies/mL 이상인 돌연변이 바 이러스 감염[14]에 의한 것으로 생각되었다. 그러나 bDNA 검사 중 부득이하게 표준물질을 얼렸다 녹이는 과정을 반복 하게 되면서 표준곡선의 RLU 값이 낮아짐에 따라 상대적 으로 환자 검체의 RLU가 높게 계산되어 나타난 위양성일 가능성 역시 배제할 수 없었다. bDNA는 음성이지만 HBeAg 이 양성으로 나타난 경우는 27명(6.3%)이었는데, 이는 HBeAg이 음성 전환되기 전 혈청 내 바이러스 DNA가 먼 저 소실되었거나[15,16], HBeAg이 B형 간염 바이러스의 core 단백 생성에 필요한 양보다 과다 생성되어 분비되었기 때문에 혈청 중 완전한 바이러스 입자 없이 나타난 결과로 생각되었다[17].

항-HBs와 bDNA가 동시에 양성 결과를 보인 환자는 모 두 7명이었는데, 이 중 5명은 HBsAg 역시 양성이었다.

HBsAg과 항-HBs가 동시에 양성으로 나오는 원인으로는 숙주의 면역체계에 이상이 있어 공통항원인 “a" 결정기에 대한 특이항체를 생성하지 못하고 항-HBs와 유사한 항체 를 만든 경우와 바이러스의 공통 항원을 coding하는 유전 자에 돌연변이가 생긴 경우 등이 있는데[7,18], 본 연구에 서는 동시 양성을 보인 환자의 항-HBs의 역가가 모두 낮 게 나타나 숙주의 면역체계의 이상으로 인한 결과로 생각되 었다.

한편, bDNA에서 10 pg/mL 미만의 약양성 결과를 보

였던 환자 10명 중 6명이 재검시 음성으로 전환되었고 이

중 4명은 PCR 역시 음성으로 나타나 1차 시행한 bDNA

검사의 위양성이 의심되었다. 이는 본원에서 1 kit를 2-3

회에 나누어 소비하는 과정 중 표준물질을 얼렸다 녹이는

것이 반복되면서 이들의 측정값이 낮아지고 이에 따라 검체

의 측정값이 상대적으로 높아졌기 때문으로 생각되었다. 실

제로 본원의 경험상 bDNA kit 사용 첫주에는 표준물질의

RLU 값 및 표준곡선이 잘 나오다가 2주, 3주째가 되면서

표준물질의 RLU 값이 이전 값의 50-70%까지 떨어지고

이에 따라 표준곡선이 전반적으로 낮게 그려지면서 lami-

vudine 치료 후 음성 전환되었던 환자들이 다시 약양성으 로 나타나는 경우가 있어 판독시 어려움을 겪고 있다. 따라 서 보다 안정적인 검사 결과를 얻기 위해서는 kit 자체의 표준물질을 2-3개로 나눔으로써, 얼렸다 녹이는 과정을 반 복하지 않도록 하는 제조 회사 차원의 노력이 필요할 것으 로 생각되고, 이와 더불어 각 검사실에서도 2.5 - 10 pg/

mL의 결과를 보인 환자에 대해서는 이전 결과 및 임상 양 상을 보다 주의 깊게 관찰하여 필요한 경우 PCR 등 추가 검사도 시행해야 할 것으로 생각된다.

요 약

배경：분자생물학적기법의 발달에 따라 B형 간염 진단에 도 중합효소연쇄반응, DNA-RNA 교잡법 및 branched DNA(bDNA) 등 많은 방법이 도입되었다. 본원에서는 1999년부터 주로 B형 간염 진단 후 lamivudine 치료를 받는 환자의 추적 검사 목적으로 HBV-bDNA 정량 검사를 시행하고 있다. 그러나 bDNA 검사 결과 약양성(2.5 - 10 pg/mL)을 보이는 환자에서 동일 검체 재검시 결과가 음성 으로 전환되는 경우가 있어 판독에 어려움이 있는 실정이 다. 따라서 본 연구에서는 그간 시행한 bDNA 결과를 혈청 학적 표지자 검사 결과와 비교 평가하는 한편, 약양성을 보 인 검체로 PCR을 시행하여 그 결과를 검토하고자 하였다.

방법：1999년 11월부터 2001년 6월까지 순천향대학병 원에 내원하여 HBV-bDNA 검사를 시행하였던 환자 610 명 중 HBsAg, 항-HBs, HBeAg, 항-HBe 등의 혈청학적 표지자 검사 결과와의 비교가 가능하였던 495명을 대상으 로 하였다. bDNA는 VERSANT

HBV DNA Assay (bDNA) (Bayer Corp., NY, USA) kit를 이용하였고, 혈청학적 표지자는 AxSYM

system (ABBOTT, IL, USA)을 이용하여 효소면역법으로 측정하였다. 두 검사간 불일치를 보인 검체에 대해서는 HBV-PCR을 시행하였다.

또한 bDNA에서 약양성 결과를 보였던 검체 중 10 검체를 무작위로 선정하여 bDNA 재검 및 PCR을 시행하였다.

결과：bDNA와 HBsAg 동시 분석이 가능하였던 환자 293명 중 176명에서 두 검사의 결과가 일치하였으며(일치 율, 60%), 불일치를 보인 환자 중에서는 bDNA(+)/

HBsAg(-)이 5명(1.7%), bDNA(-)/HBsAg(+)이 112 명(38.2%)이었다. 항-HBs와 bDNA 동시 양성은 7명이었 는데, 이 중 5명은 HBsAg 역시 양성이었다. HBeAg과 bDNA 검사는 428명 중 322명에서 일치하는 결과를 보였 으며(일치율, 75.3%), 그밖에 bDNA(+)/HBeAg(-)이 79명(18.5%), bDNA(-)/HBeAg(+)이 27명(6.3%)이었 다. bDNA에서 10 pg/mL 미만의 약양성을 보였던 환자 10명 중 재검에서 2.5 pg/mL 미만의 음성으로 전환된 경 우가 6명이었고, 이 중 4명은 PCR 역시 음성이었다.

결론：bDNA 검사 건수가 월 100건 미만인 검사실에서

보다 안정적인 검사 결과를 얻기 위해서는 검사시 표준물질 을 얼렸다 녹이는 과정을 반복하지 않도록 kit 제조시 표준 물질을 2-3개로 나누는 등의 노력이 필요할 것으로 생각되 었고, 이와 더불어 각 검사실에서도 2.5 - 10 pg/mL의 약 양성 결과를 보인 환자에 대해서는 이전 결과 및 임상 양상 을 보다 주의 깊게 관찰하여 필요한 경우 PCR 등의 추가 검사를 시행해야 할 것으로 생각되었다.

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