인 체 의 난 관 수 종 액 이 생 쥐 의 배 아 발 달 에 미 치 는 영 향

인 체 의 난 관 수 종 액 이 생 쥐 의 배 아 발 달 에 미 치 는 영 향 (II) :포 배 기 내 의 세 포 수 에 미 치 는 영 향

성균관 의과대학, 삼성제일병원, 산부인과, 불임연구실¹

궁미경, 전진현¹, 송상진¹, 송지홍, 홍수정, 손일표, 김정욱¹, 강인수

A dv ers e Effe ct of Hum an Hy dros alping e al F luid on the D ev elopm ent of M ou s e Embry o (II)

M i Ky ou n g K oon g , Jin H y un Ju n¹, S an g Jin S on g¹, Ji H on g S on g , S oo Ju n g H on g , Il P y o S on , J eon g W ook Kim¹, Inn S oo K an g Depart m en t of Ob st etr ics an d Gy n ecolog y , Infer tilit y R esear ch L ab or at ory¹,

Colleg e of M edicin e, S u n g ky u nk w an Univ er sit y

S am n sun g Ch eil H ospit al & W om en ' s H ealth car e Cent er , S eou l, K or ea

= A b s tract =

In our pr ev iou s st u dy , w e ob ser v ed th at h y dr osalpin g eal flu id (H S F ) adv er sely effect m ou s w e em br y o dev elopm en t an d h at chin g . T h e aim of th is stu dy w a s t o ev alu at e t h e effect of H S F a s a s s es s ed by t h e bla st ocy st dev elopm en t r at e (BDR ) an d by cell cou nt in g in v itr o. H S F w a s collect ed fr om ninie pat ien t s un der g oin g salpin g on eost om y t o cor r ect hy dr osalpinx . T w o - cell em br y os w er e obt ain ed fr om su per ov ulat ed ICR m ice.

T 6 m edium an d T 6 +0.4% b ov in e ser um album in w er e u sed a s cont r ol m edia . T 6 m edium con t ain in g 10% or 50% H S F an d 100% H S F fr om each pat ient w er e u sed a s t est m edia . N in e t o 15 em br y os w er e cult ur ed in m icr odr op s pr epar ed fr om each of t h e se m edia T o a s se s s t h e t ot al cell nu m b er w it hin each b la st ocy st , th e bla st ocy st s w er e fix ed an d st ain ed w it h H oech st 33342 t o facilit at e cell coun tin g . T h e m ean BDR in t w o cont r ol m edia w er e 88.7% an d 85.3% . T h e m ean BDR in m edia con t ain in g 10% , 50% , 100% H S F w er e 90.0% , 89.4% an d 75.2%^*, r esp ect iv ely (^*: p < 0.05 ). T h e ov er all m ean cell coun t (+ S E M ) in con t r ol m edia w er e 86.9 + 3.2 an d 91.0 + 3.8. T h e BDR w a s affect ed adv er sely on ly by 100% H S F an d n ot in m edia cont ainin g 10% or 50%

H S F . M ean cell coun t s w er e decr ea sed sign ificant ly only in bla st ocy st s cu lt ur ed 100%

H S F (63.3 + 4.6 ; p < 0.01) b ut n ot in bla st ocy st s cultu r ed in 10% or 50% H S F (90.8 + 4.2 an d 81.9 + 6.1, r esp ect iv ely ). T hu s , it is con clu ded t h at H S F h a s n o em by ot ox ic effect b ut h a s a m ildly n eg at iv ely effect on em b ry onic gr ow th an d dev elopm en t .

서 론

난관수종이 있는 불임환자에서 체외수정시술시 임신율과 착상율이 감소된다는 것이 여러 저자들에 의해 보고되었다 (Ander son et al., 1994; Kas s abji et al., 1994; Vandr om m e et al., 1995 ; F lem m in g et al., 1996 ). 또한 난관수종을 수술적으로 교정하였을 경우 착상율과 임신율이 다시 회복되는 것도 보고되었다 (Sh elt on et al., 1996; 궁미경 외,1997). 최근 그 기전의 하나로 난관수종액의 영향에 대해 많은 보고가 있었으나 아직 견해의 일치를 보지 못하고 있다. 본 저자들은 지난 연구를 통해 난관수종액이 생쥐배아의 발달, 즉 포배기 까지의 발달율을 저하 시킨다고 보고하였고(궁미경 외, 1997), 본 연구는 그의 연장으로 배아발달율 뿐아니라 포배기 내의 세포수를 관찰 함으로써 세포분열에 난관수종액이 어떤 영향을 미치는 가를 보고자 하였다.

연 구 재 료 및 방 법

1. 연구 재료

난관수종액(Hy dr os alpin geal fluid, H SF )은 난관수종을 교정하기위해 수술을 받는 9명의 환자로부터 채취되었고, 300rpm 에서 10분간 원심분리 시킨 후, 상층액만을 채취하여 - 20^oC에서 실험 전까지 보관하였다. 생쥐는 ICR str ain을 사용하여 7 IU의 pr egnanct

m ar e s er um g on adotr opin (P M S G, S igm a )을 주사하고 48시간 후에 7 IU 의 hu m an g on adot r opin (h CG, S ig m a )을 주사하여 교접시켰고, h CG 주사후 46시간에 교접 흔적(copulation plu g )을 갖는 생쥐의 수란관을 떼어 flu shing 함으로써 2 세포기의 생쥐배아를 획득하였다.

2. 배양 방법

냉동보관된 난관수종액은 실험 직전에 녹여 0.22um filter (M illipore )에 통과시켰으며 여과된 난관수종액을 각각의 환자별로 구분하여 사용하였다. 실험군의 배양액은 3 Gr oup으로, T 6 배양액을 기본배양액으로 하여 10% 와 50%의 비율로 난관수종액을 첨가시켰거나 순수한 100% 난관수종액만을 배양액으로 사용한 경우이였고, 이에 반해 대조군의 배양액은 2 Gr oup으로 단순한 T 6 m edium 과 T 6 m edium 에 0.4% bovine serum albu m in (BS A ; Gib co )을 첨가한 배양액을 사용한 경우로 하였다. 이와 같이 5가지 종류의 배양액을 배양접시(cultur e dish )위에 m icr odr op으로 준비하였고, 그 위에 m in er al oil (S ig m a )로 덮었다. 준비된 배양접시를 5% CO2가 첨가된 공기를 함유한 37^oC의 in cu b at or 에서 6시간 이상 보관한 후에 2- 세포기의 생쥐배아 9- 15개을 각각의 배양액속에 넣어 72시간 동안 배양하였다.

3. 배아의 발달판정

배아의 발달정도를 판정하기 위하여 포배기 발달율(Bla st ocy st dev elopm ent rate;BDR )과 포배기 배아내의 세포수를 측정하였다. 포배기 발달율은 현미경하에서 포배기로 보이는 배아의 수를 첨가되었던 2- 세포기의 배아수로 나누어 백분율하였다. 포배기내의 세포수를 측정하기 위해서 Ebert 등(1985)이 사용한 방법을 이용하였다. 포배기의 배아를 1%

g lu t ar aldehy de 용액에서 고정시켜 Bisb en zim ide s olut ion (10u g/ m l; H oech st 33342, S igm a )으로 염색한 후 slide 옮겨 flu or escent m icr os cop e (Opt iph ot - 2, N ik on )으로 관찰하였다. 포배기의 배아내에서 염색된 핵의 수를 세포 수로 간주하여 세었다.

4. 통계 처리

각각의 배양액에서 배양된 배아의 포배기 배아발달율의 비교는 chi- squ ar e test를 사용하였고, 포배기 내의 평균 세포수의 비교는 Duncan ' s m ultiple r an ge t est를 이용하였다. p< 0.05일 때를 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

결 과

채취된 난관수종액의 Osm olarity는 277- 297 m Osm이였으며, pH는 7.9- 8.4이였으나 in cub at ion 후에는 7.37 - 7.51로 생리적 범주내에 있었다. T able 1에서 보는 바와 같이 포배기 발달율은 9명에서 채취된 난관수종액에 따른 개별적인 차이를 보이지 않았다 (p =0.34 ). 따라서 평균 포배기 발달율은 T 6, T 6+B SA , 10% H SF , 50% HSF , 100% H SF (n =97, 102, 100, 104, 105 )에서 각각 88.7% , 85.3% , 90.0% , 89.4% , 75.2% *이였다 (*; p < 0.05, 그림 1). 따라서 포배기까지의 배아 발달율은 오직 100%의 HSF 에서만 장애를 받는 것으로 나타났다.

T ab le 2는 각각의 난관수종액이 각기 다른 농도에서 포배기의 배아 세포 수에 미치는 영향을 나타낸 표이다. 세포수가 측정된 포배기의 배아수는 T 6, T 6+BSA , 10% H SF , 50%

H S F , 100% H S F 에서 각각 81, 86, 88, 81, 79이였으며, 포배기 내의 평균 세포수 (+S E M )는 각각 86.9+3.2, 91.0+3.8, 90.8+4.2, 81.9+6.1, 63.3+4.6*이였다(*; p < 0.01, 그림 2). 역시 100%의 난관수종액에서 배양된 포배기 배아에서 그 세포 수가 현저히 감소됨을 알 수 있었다.

고 찰

난관수종액이 배아에 미치는 영향에 관해서는 여러 저자들에 의해 결과가 보고되고 있으나 그들의 결과들이 서로 일치하고 있지 않다. M ukh erjee et al,(1997)은 10%의 난관수종액이 포함된 배양액에서는 5%의 생쥐배아만이 포배기로 발달할 수 있었고 100%의 난관수종액에서는 모든 배아가 포배기까지 발달하지 못하였다(0% )고 보고하면서, 따라서 난관수종액은 생쥐배아에 대해 독성(t oxicity )을 갖는다고 보고하였다, S achdev et al.(1997 )은 1%의 난관수종액이 배양액에 포함되어 있어도 배아가 생존하지 못하였다고 하였으며, M urr ay et al.(1997)은 100%의 난관수종액에서도 배아의 61%가 포배기로 발달하였다고 보고하였다. 저자들(궁미경 외, 1997)도 지난번의 실험을 통해 100%의 난관수종액에서 75%의 배아가 포배기로 발달하였으나 이는 대조군에 비해 유의하게 배아발달율이 감소된 것으로 보고하였다. 그외에도 S chat s et al.(1997)은 정자를 사용하여, S a w in et al.(1997 )은 hu m an t r oph obla st 를 이용하여 각각을 난관수종액에서 배양시켜

보았을 때, 그들에 대해 난관수종액이 t oxicity를 갖지 않는 것으로 보고하였다. 이번의 실험 결과 역시 100%의 난관수종액에서도 생쥐배아는 포배기까지 발달 할 수는 있었지만 그의 비율이 현저히 감소되었고 특히 포배기내의 세포수가 현저히 감소되었음을 알 수 있었다. 이는 난관수종액이 배아발달에 대해 독성은 가지지는 않지만 배아발달을

저해하는 것으로 나타났고 그 기전은 아직 불분명하다. Gott et al.(1990)은 난관수종액에는 pr

o

감소되었다고 보고하였다. 따라서 난관수종액에는 배아발달에 필요한 물질이 부족되거나 배아발달을 저해하는 요소가 존재할 가능성이 있는 것으로 사료된다.

결 론

본 연구를 통해 난관수종액은 생쥐배아가 포배기까지의 발달을 저해하는 것으로 나타났으며 또한 포배기까지 발달하였을 지라도 그의 세포수가 현저히 감소됨을 알 수 있었다. 따라서 난관수종액은 비록 배아발달에 t ox icity를 갖지는 않을 찌라도 배아발달을 저해하는 요소(inhibit ory fact or )가 있거나 발달에 필요한 물질이 결여(deficien cy of m et ab olit es ) 되어 있을 것으로 추정된다.

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T able I. Com par is on of bla st ocy st dev elopm en t r at e s (% ) u sin g m edia w it h an d w it h out H S F an d H S F alon e by pat ient fr om w h ich H S F w a s obt ain ed .

P atien t T 6 T 6+0.4% BS A T 6 +10% H S F T 6+50% H S F

100% H S F

1 100 (10) 82 (11) 91(11) 100(11) 90 (10)

2 100 (10) 90 (10) 100(10) 91(11) 73 (11)

3 67 (12) 92 (12) 92 (13) 92 (13) 77 (13)

4 83 (12) 83 (12) 91(11) 82 (11) 73 (11)

5 100 (14 ) 80 (15 ) 93 (14) 87 (15) 73 (15)

6 100 ( 9 ) 91(11) 80 (10) 100(10) 80 (10)

7 80(10) 90 (10) 100(10) 64 (11) 73 (11)

8 70(10) 70 (10) 80 (10) 91(11) 67 (12)

9 100 (10) 91(11) 82 (11) 100(11) 75 (12)

Dat a in par ent h es es in dicat e t h e n um b er of m ou se em br y os u s ed.

T able 2. M ean cell coun t s for bla st ocy st s cult ur ed in T 6, T 6 +0.4% B S A , T 6 +10% H S F , T 6 +50% H S F or 100% H S F alon e, r elativ e t o each pat ient . T h e m ean cell cou nt s at each m edia w er e ex pr es sed a s t h e av er a g e cell cou nt s for all of th e bla st ocy st s cultu r ed in a sin gle m icr odr op .

F ig ur e 1. M ean bla st ocy st dev elopm en t r at e (BDR ) for m ou se em b ry os cu lt u r ed in T 6, T 6 +0.4% B S A , T 6 +10% H S F , T 6 +50% H S F or in 100% H S F alon e . R esu lt s ar e ex pr e s sed a s m ean + S E M . T h e st at istical differ en ces ar e den ot ed by a st erisk s (*:P < 0.05 com par ed w ith all ot h er gr oup s ).

F ig ur e 2. Ov er all m ean cell cou nt s for bla st ocy st s u sin g t h e nin e H S F p atien t sam ples for each m edium pr epar ation . T h e r esu lt s ar e ex pr es s ed a s m ean + S E M . T h e st atist ical differ en ces ar e den ot ed by a st erisk s (*:P < 0.01 com p ar ed w ith t w o con tr ol g r oup s ).