유산균 발효 흑무의 항산화 및 지방구 형성 억제 효과
김성은․백신화․이학성․김현규 콜마비앤에이치(주) 식품과학연구소
Inhibitory Effects of Black Radish Fermented with Probiotics on Antioxidant and Lipid Accumulation
Seong-Eun Kim, Sinhwa Baek, Hak Sung Lee, and Hyun-Kyu Kim Food Science R&D Center, Komar BNH Co., Ltd.
ABSTRACT Black radish (Raphanus sativus var. niger) has been reported to have anti-oxidant, anti-inflammatory and detoxification effects. In this study, we investigated the antioxidant and lipid accumulation inhibitory effects of fermented black radish (FBR) with Lactobacillus plantarum compared with non-fermented black radish (BR) and black radish extracts obtained using water, and 30%, 50%, 70% ethyl alcohol. The lipid accumulation inhibitory effect was determined by Oil-Red O staining activity after oleic acid treatment of HepG2 cells. Treatment with FBR at doses of 100 and 500 μg/mL inhibited lipid accumulation by 103% and 108% and BR at the same dose inhibited lipid accumulation by 72% and 61%, respectively. Extracts inhibited lipid accumulation ranging by 17% to 93% when applied in the same doses. FBR led to significant inhibition of lipid accumulation compared with BR and extracts.
In addition, FBR demonstrated antioxidant effect such as scavenging activity of (2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazo- line-6-sulfonic acid) and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical and super oxide dismutase (SOD)-like activity. Also the FBR was measured total polyphenol contents (TPC) and total flavonoid contents (TFC). Moreover, FBR showed sig- nificant greater antioxidant activity than BR and extracts. The TPC of FBR increased more than BR and the TFC of FBR was higher than that of other extracts. These results suggest that FBR might be a potential health functional food ingredient for enhancing liver function.
Key words: black radish, fermentation, antioxidant, lipid accumulation inhibitory activity, Lactobacillus plantarum
Received 2 May 2018; Accepted 3 July 2018
Corresponding author: Hyun-Kyu Kim, Food Science R&D Center, Kolmar BNH Co., Ltd., Sejong 30003, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-44-860-4220
서 론
간은 소장에서 흡수된 영양소나 독성물질 등을 대사물질 로 합성하거나 인체에 무해한 물질로 분해하는 역할을 담당 하며, 이러한 간 조직은 지방합성 및 대사와 관련하여 가장 중요한 역할을 한다. 지방합성 및 대사에 불균형이 유발될 경우 간세포 내에 지방조직이 축적되어 지방간, 간경화뿐만 아니라 대사증후군의 일종인 비만, 제2형 당뇨 등의 원인으 로 작용하게 된다(1,2). 활성산소종(reactive oxygen spe- cies, ROS)은 호기성 대사체계에서 필수적인 요소지만 대사 과정 중 다량으로 발생한 활성산소종은 에너지를 얻어 sin- glet oxygen이나 슈퍼옥사이드 라디칼(superoxide radi- cal), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical), 과산화수소 (hydrogen peroxide), 알칼리계 라디칼(alkoxy radical), 과산화라디칼(peroxyl radical) 등과 같이 강한 반응성을 갖 는 라디칼을 형성하고 산화적 스트레스를 유발하여 세포 구
성성분의 손상을 유발하며 세포의 정상적인 대사를 저해한 다(3-5). 또한, 이러한 손상은 간세포의 지방 축적 및 섬유 화를 더욱 촉진하여 지방간이나 간경화를 더욱 진행시킨다 (6,7). 흑무(Raphanus sativus var. niger)는 십자화과의 뿌 리채소로 무의 한 종류이다. 일반 무보다 매운맛이 좀 더 강하다고 알려져 있으며 겉은 검은색이고 속은 희다. 흑무에 포함된 여러 화합물 중 생리활성을 나타내는 성분으로 glu- cosisymbrin, glucoputrajivin, sinigrin, glucoraphenin 등 이 보고되어 있으며, 공통적으로 질소나 황을 포함한 분자구 조에 glucose가 연결되어 있는 구조로써 이러한 구조의 화 합물을 glucosinolate라고 칭한다(8). 이러한 glucosino- late 계열의 화합물은 조직이 손상되면 myrosinase에 의해 분해되어 매운맛을 내며, 항고지혈, 항염증, 항산화, 독소 제거 등 다양한 생리활성이 보고되어 있다(9-12). 하지만 흑무는 매운맛과 대중성의 부족으로 낮은 소비율과 가공품 의 경우에도 대부분 무절임 등의 단순 가공 수준에 머물러 있다. 우리나라에서는 오래전부터 발효를 이용해왔다. 식품 원재료 혹은 가공품에 미생물을 접종시켜 배양하는 발효는 식품이 미생물에 의해 영양성분이 대사되어 생리활성물질 의 흡수 촉진이나 생성을 통해 기능성의 증가 혹은 신규 기
능성이 발생하기도 한다. 또한, 미생물의 대사과정을 통해 섭취하는 데 어려움을 주던 풍미가 개선되기도 한다(13-16).
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 연구에서는 흑무를 생리활성을 갖는 기능성 식품으로 개발하기 위하여 주정을 활용한 용매 추출 및 유산균 발효의 공정을 통해 발효물을 제조하였다. 제조된 조성물은 제조 수율과 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 라디 칼 양이온, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디 칼 제거 활성 및 superoxide dismutase(SOD) 유사 효능평 가와 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 화합물 함량 분석을 통 해 항산화 활성을 측정하였으며, oleic acid(OA)로 유도한 비알콜성 지방간 HepG2 간세포 모델에서 지방구 형성 억제 활성을 측정하였다. 총 폴리페놀 화합물 및 총 플라보노이드 화합물 함량을 제외한 항산화 효능 및 간세포 지방구 형성 억제 효능에서 모두 흑무 유산균 발효물이 가장 우수한 효능 을 보였다.
재료 및 방법
시약 및 재료
실험에 사용된 흑무는 제주 성산일출봉농협으로부터 제 공받아 사용하였으며, 발효에 사용된 Lactobacillus plan- tarum 균주는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea), Lactobacilli MRS 액 체배지와 고체배지는 Difco(Detroit, MI, USA), ABTS, DPPH, Folin-Denis, thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT), oleic acid, formaldehyde solution, Oil-Red O, isopropanol, lipopolysaccharide(LPS), pyrogallol은 Sig- ma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사 용하였다. Dimethyl sulfoxide(DMSO)와 탄산나트륨 (Na2CO3), hydrochloric acid 시약은 대정화금(Siheung, Korea), sodium hydroxide 시약은 덕산약품공업(Ansan, Korea), naringin은 Acros Organics(Geel, Belgium), di- ethylene glycol은 삼전순약공업(Pyeongtaek, Korea), 세 포 배양에 사용된 Dulbecco’s minimum Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum(FBS), antibiotic-antimycotic 은 Gibco(Waltham, MA, USA), 밀크씨슬 추출물은 엠에스 바이오텍(Eumseong, Korea), Tris-base와 EDTA는 바이 오세상(Seongnam, Korea)으로부터 구입하여 사용하였다.
흑무 추출물의 조제
흑무를 세척한 후 절단하여 흑무 중량의 15배수 정제수 또는 30%, 50%, 70%의 혼합주정을 가하여 정제수는 95°C, 혼합주정은 70°C에서 4시간 동안 1차 추출하였다. 1차 추 출 후 여과하여 남은 잔사에 1차 추출과 동일한 추출용매를 10배수 가해 95°C에서 2시간 동안 추출한 다음 여과하여 1차 추출물과 혼합 농축한 후 동결건조기(MCFD8512, iSBio, Yangju, Korea)를 이용해 분말화하였다. 제조된 각 추출물
은 흑무 투입량 대비 생산 수율을 측정하였다.
Lactobacillus plantarum 종균 배양
한국미생물보존센터에서 구매한 L. plantarum을 Lacto- bacilli MRS 고체배지에 도말하여 37°C에서 배양한 후, Lactobacilli MRS 액체배지에 분리한 단일콜로니를 접종하 여 37°C에서 24시간 배양하였다.
흑무 유산균 발효분말의 조제
세척 후 절단한 흑무를 95°C에서 15분간 1차 멸균한 후 분쇄하여 121°C에서 15분간 2차 멸균하여 흑무 배지를 제 조하였다. 일부 흑무 배지는 발효물과의 비교를 위해 동결건 조 후 분말화하여 비 발효 흑무 분말(BR)을 제조하였다. 제 조한 흑무 배지 중량당 L. plantarum 종균 1%를 접종한 후 37°C에서 2일간 배양하였다. 배양 종료 후 95°C에서 15분 간 멸균한 다음 동결건조 및 분말화하여 발효분말(FBR)을 제조하였다. 제조된 발효물은 흑무 투입량 대비 생산 수율을 측정하였다.
ABTS 라디칼 양이온 제거 활성 측정
ABTS 라디칼 양이온 제거 활성은 Re 등(17)의 방법을 변형하여 측정하였다. ABTS 시약은 2.45 mM potassium persulfate와 7 mM ABTS를 3차 증류수에 녹인 후 실온의 암실에서 12시간 동안 방치시키고 사용하였다. 제거 활성 측정을 위해 시료를 농도별로 10% DMSO에 녹인 후 원심분 리 하여 그 상등액을 사용하였다. 상등액 10 μL에 ABTS 시약 190 μL를 혼합한 후 실온에서 7분간 반응시키고 UV/
VIS spectrophotometer(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였다. ABTS 라디칼 양이온 제거 활성은 아 래와 같은 식을 통해 계산하였다.
ABTS 라디칼 양이온 제거 활성(%)＝
대조군의 흡광도－시료의 흡광도 대조군의 흡광도 ×100
DPPH 라디칼 제거 활성
DPPH 라디칼 제거 활성은 Blois(18)의 방법을 변형하여 측정하였다. 6.3 mg의 DPPH 시약을 50 mL의 에탄올에 녹 여 DPPH 시약으로 사용하였다. 제거 활성 측정을 위해 시료 를 농도별로 10% DMSO에 녹인 후 원심분리 하여 그 상등 액을 사용하였다. 상등액 10 μL에 DPPH 시약 90 μL를 혼합 한 후 실온에서 10분간 반응시키고 UV/VIS spectropho- tometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
DPPH 라디칼 제거 활성은 아래와 같은 식을 통해 계산하였 다.
DPPH 라디칼 제거 활성(%)＝
대조군의 흡광도－시료의 흡광도 대조군의 흡광도 ×100
SOD 유사 활성
SOD 유사 활성은 Marklund와 Marklund(19)의 방법을 변형하여 측정하였다. 먼저 50 mM Tris-base에 10 mM EDTA를 첨가한 후 pH를 8.5로 맞춰 Tris-HCl buffer를 제조한다. Tris-HCl buffer 120 μL에 각 농도별 시료 40 μL와 7.2 mM pyrogallol 20 μL를 혼합한 후 실온에서 10분 간 반응시킨다. 반응 후 1 N HCl 20 μL를 첨가한 다음 잘 혼합시키고 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사 활성은 아래와 같 은 식을 통해 계산하였다.
SOD 유사
활성(%) ＝대조군의 흡광도－시료의 흡광도 대조군의 흡광도 ×100
총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 화합물 함량 측정 총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin-Denis법(20)에 따라 측 정하였다. 10% DMSO에 용해한 시료를 원심분리 후 상등액 을 취하여 실험에 사용하였다. 상등액 20 μL에 Folin-Denis 시약 100 μL를 혼합한 후 40°C에서 1분간 반응시켰다. 7.5
% Na2CO3 용액 80 μL를 첨가한 후 40°C에서 15분간 반응 시키고 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 765 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하여 gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.
총 플라보노이드 화합물 함량은 Davis 등(21)의 방법에 따라 측정하였다. 10% DMSO에 용해한 시료를 원심분리 후 상등액을 취하여 실험에 사용하였다. 상등액 20 μL에 di- ethylene glycol 200 μL와 1 N NaOH 20 μL를 혼합한 후 37°C에서 1시간 동안 반응시킨 다음 UV/VIS spectropho- tometer를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 총 플라보노이드 화합물은 naringin을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 계산하여 naringin equivalent(NE)로 나 타내었다.
세포배양
HepG2(HB-8065, ATCC, Manassas, VA, USA) 세포는 DMEM에 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic을 넣어 만든 배지에 배양하였으며, 적절한 산성도를 유지시키기 위 해 37°C, 5% CO2 조건 하의 세포배양기(Thermo Fisher Scientific)를 이용하였다.
세포 독성 측정
MTT 시약은 최종 농도 5 mg/mL가 되도록 1×PBS에 녹인 후 빛을 차단하여 사용하였다. 세포 독성 측정을 위해 세포를 96-well plate에 1×105 cells/mL 분주한 후 24시간 배양하고, 배지에 녹인 각 시료를 농도별로 처리하여 24시 간 배양한다. 배양 후 약 10:1의 비율이 되도록 MTT 시약을 첨가하고 3시간 동안 반응시킨다. 배양액을 제거한 후 DMSO
를 100 μL씩 분주하여 MTT formazan을 녹여내고 540 nm 에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측 정하였다. 흡광도가 낮을수록 독성을 갖는 것으로 확인하였 다.
지방구 형성 억제 시험
지방구 형성 억제 활성은 Kang 등(22)의 방법을 변형하 여 측정하였다. HepG2 세포를 24-well plate에 2×105 cells/mL 분주한 후 24시간 배양한다. 각 시료를 농도별로 처리하고 1시간 후 oleic acid를 600 μM 농도로 처리하여 24시간 배양한다. 양성대조군으로는 밀크씨슬 추출물(MT) 을 0.5 mg/mL 농도로 사용하였다. 배양액 제거 후 1×PBS 로 2회 세척한 다음 상온에서 formaldehyde solution을 희 석하여 만든 10% formalin에 1시간 이상 처리한다. For- malin 제거 후 증류수를 이용하여 2회 세척한 다음 Oil-Red O(ORO) 용액에 실온에서 1~2시간 반응시킨다. ORO 용액 제거 후 증류수로 4회 세척하고 지방구에 염색된 색소를 isopropanol로 녹여 96-well plate에 옮기고 490 nm에서 UV/VIS spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정하 였다. 흡광도가 낮을수록 지방구 형성이 억제된 것으로 확인 하였다.
통계처리
모든 데이터의 통계처리는 각 항목에 따라 SPSS(18.0.0, IBM, Armonk, NY, USA)를 이용하여 분석하였고 각각의 시료에 대해 평균과 표준편차로 나타내었다. 각 시료군에 대한 유의성 검정은 신뢰수준 95%(P<0.05)에서 Student’s t-test를 실시하였다.
결과 및 고찰
제조 공정별 수율
각 제조 공정에 따라 흑무 원재료를 100 g씩 투입하여 추출 조건별 흑무 추출물과 유산균 발효한 흑무 발효물을 제조하여 수율을 측정한 결과 각 추출물은 3~6% 내외로 확인되었으며, 흑무 유산균 발효물은 약 16%로 측정되었다 (data not shown). 흑무 유산균 발효물의 경우 추출 후 발생 하는 잔사를 폐기하는 다른 추출물과 달리 발효 후 발생하는 잔사까지 모두 활용하기 때문에 다른 추출물 대비 수율이 높게 확인되었다. 따라서 흑무 유산균 발효물은 다른 추출물 대비 수율이 높고 생산 완료 후 폐기되는 부산물이 없어 활용 가치가 높다.
ABTS 라디칼 양이온 및 DPPH 라디칼 제거 활성 흑무 추출물과 흑무 발효물의 ABTS 양이온 라디칼 제거 활성 측정 결과 모든 농도에서 흑무 발효물이 가장 높은 활 성을 나타내었다. 추출물은 50 μg/mL 농도에서 1.45~2.22
%, 250 μg/mL 농도에서 7.77~9.54%, 500 μg/mL 농도에
Table 1. DPPH radical scavenging activity of black radish ex- tracts and fermented black radish (%) Sample1) 100 μg/mL 500 μg/mL 1,000 μg/mL
BR Water 30%EtOH 50%EtOH 70%EtOH
FBR
N/D N/D
<100
<100 N/D 0.77±1.65
N/D N/D N/D N/D N/D 7.98±2.18*
2.50±1.082) 1.54±0.73
N/D N/D 1.14±0.40 11.92±2.13*
1)BR, non-fermented black radish; Water, water extract of black radish; 30%EtOH, 30% ethanol extract of black radish; 50%
EtOH, 50% ethanol extract of black radish; 70%EtOH, 70%
ethanol extract of black radish; FBR, fermented black radish.
2)Values are mean±SD (n=6).
*P<0.05 compared to BR by Student’s t-test.
N/D mean none detected.
0 5 10 15 20 25
BR Water 30%EtOH 50%EtOH 70%EtOH FBR Sample
ABTS cation radical scavenging . activity (%) .
50 μg/mL 250 μg/mL 500 μg/mL
*
*
Fig. 1. ABTS radical cation scavenging activity of black radish extracts and fermented black radish. Values are mean±SD (n=6).
*P<0.05 compared to BR by Student’s t-test. BR, non-fermented black radish; Water, water extract of black radish; 30%EtOH, 30% ethanol extract of black radish; 50%EtOH, 50% ethanol extract of black radish; 70%EtOH, 70% ethanol extract of black radish; FBR, fermented black radish.
0 2 4 6 8 10 12
BR Water 30%EtOH 50%EtOH 70%EtOH FBR Sample
SOD-like activity (%) .
200 ug/mL 1000 ug/mL 2000 ug/mL
*
*
*
*
*
μg/mL μg/mL μg/mL
Fig. 2. SOD-like activity of black radish extracts and fermented black radish. Values are mean±SD (n=6). *P<0.05 compared to BR by Student’s t-test. BR, non-fermented black radish; Water, water extract of black radish; 30%EtOH, 30% ethanol extract of black radish; 50%EtOH, 50% ethanol extract of black radish;
70%EtOH, 70% ethanol extract of black radish; FBR, fermented black radish.
서 14.11~17.27%의 활성을 나타내었으며, 이에 비해 흑무 발효물은 각각 2.83%, 11.29%(P=0.007), 19.87%(P=0.006) 로 250, 500 μg/mL 농도에서 유의하게 항산화 활성이 증가 하였으며, 발효과정을 거치지 않은 비 발효 흑무 분말의 활 성은 2.14%, 9.40%, 17.76%로 확인되었다(Fig. 1). 흑무 추출물과 흑무 발효물의 DPPH 라디칼 제거 활성 측정 결과 모든 농도에서 흑무 발효물이 가장 높은 활성을 나타내었다.
전반적으로 흑무 추출물은 100 μg/mL, 500 μg/mL 농도에 서는 활성을 나타내지 않았고, 1,000 μg/mL 농도에서 약한 활성을 나타내었다. 흑무 발효물은 각 농도에서 0.77%, 7.98
%(P<0.05), 11.92%(P<0.05)로 높진 않지만 500, 1,000 μg/mL 농도에서 추출물 및 비 발효 흑무 분말 대비 유의적 으로 높은 활성을 보였다(Table 1). Jung 등(23)의 유산균 발효 곡류의 항산화 활성 연구에 따르면 발효 전 항산화 활 성이 29.23~65.13% 수준이었던데 비해 발효 후 33.53~
71.30%까지 증가하였으며, Lee와 Hong(24)의 보고에 따 르면 유산균 발효 오디의 항산화 활성이 발효 전 대비 1.5배
에서 2배 정도 증가한 결과를 나타내었다. 이를 토대로 흑무 용매 추출물 대비 발효분말의 DPPH 라디칼 제거 활성이 더 우수함을 확인하였다.
SOD 유사 활성
흑무 추출물과 흑무 발효물의 SOD 유사 활성 측정 결과 흑무 추출물은 200 μg/mL 농도에서 0.48~1.89%, 1,000 μg/mL 농도에서 3.41~4.82%, 2,000 μg/mL 농도에서 3.67
~7.26%의 활성을 보였으며, 비 발효 흑무 분말은 농도별로 1.61%, 1.92%, 2.96%의 활성을 보였다. 흑무 발효물이 농 도별로 3.21%, 7.24%(P<0.05), 8.68%(P=0.002)로 추출 물과 발효시키지 않은 비 발효 흑무 분말 대비 1,000 μg/mL, 2,000 μg/mL 농도에서 유의적으로 활성이 증가하였다(Fig.
2). SOD 유사 활성 실험에 사용되는 pyrogallol은 산소와 반응하여 과산화수소(H2O2)나 활성산소(O2-)와 같은 활성 산소종을 생성한다. 이러한 과산화수소나 활성산소는 체내 대사과정 중에서 생성되어 세포의 손상을 일으키는 원인 중 하나로 이를 억제하는 정도를 측정함으로써 항산화 활성을 확인할 수 있다. 본 실험 결과에서 흑무는 SOD 유사 활성을 갖는 것으로 보이며, 발효분말의 경우 그 활성이 더 증가한 것을 확인하였다. Lugasi 등(11,25)에 따르면 흑무 착즙물 에서 항산화 효능의 주요 작용기전인 전자 공여체로써의 정 도와 환원력, 과산화수소 라디칼 제거 활성 등을 확인하였으 며, 고지방 식이로 간 손상을 유도한 랫드에 흑무 착즙물을 투여할 경우 간 조직에서 지질과산화를 억제하는 것으로 보 고하였다. 또한, Song 등(26)과 Kwon(27)의 연구에 따르면 미생물을 활용한 발효 시 발효 전보다 기존에 나타내던 생리 활성이 발효 후 더욱 증가하는 결과를 나타내었다. 따라서 본 결과는 흑무 유산균 발효물의 처리가 산화적 스트레스를 효과적으로 억제할 수 있으며 용매 추출방법보다 더 우수함 을 보여주었다.
Table 2. Total polyphenol contents and total flavonoid contents of black radish extracts and fermented black radish
Sample1) Total polyphenol
contents (mg/g) Total flavonoid contents (mg/g) BR
Water 30%EtOH 50%EtOH 70%EtOH
FBR
1.860±0.1232) 3.939±0.145* 3.712±0.165* 2.740±0.062* 3.115±0.057* 3.392±0.266*
0.243±0.091 N/D N/D N/D N/D 0.450±0.082*
1)BR, non-fermented black radish; Water, water extract of black radish; 30%EtOH, 30% ethanol extract of black radish; 50%
EtOH, 50% ethanol extract of black radish; 70%EtOH, 70%
ethanol extract of black radish; FBR, fermented black radish.
2)Values are mean±SD (n=6).
*P<0.05 compared to BR by Student’s t-test.
N/D mean none detected.
0 20 40 60 80 100 120
Control Vehicle BR Water 30%EtOH50%EtOH70%EtOH FBR Sample
Cell viability (%) .
100 ug/mL 500 ug/mL
30% 50% 70% FBR EtOH EtOH EtOH
μg/mL μg/mL
Fig. 3. Cytotoxicity of black radish extracts and fermented black radish. Values are mean±SD (n=6). Control, non-treated; Vehicle, distilled water; BR, non-fermented black radish; Water, water extract of black radish; 30%EtOH, 30% ethanol extract of black radish; 50%EtOH, 50% ethanol extract of black radish; 70%
EtOH, 70% ethanol extract of black radish; FBR, fermented black radish.
총 폴리페놀 화합물 함량 및 총 플라보노이드 화합물 함량 측정
흑무 추출물과 흑무 발효물 및 비 발효 흑무 분말의 총 폴리페놀 함량(TPC) 측정 결과 흑무 열수 추출물 3.939 mg/
g, 30% 주정 추출물 3.712 mg/g, 50% 주정 추출물 2.740 mg/g, 70% 주정 추출물 3.115 mg/g, 흑무 발효물 3.392 mg/g(P<0.05), 비 발효 흑무 분말 1.860 mg/g으로 측정되 었으며(Table 2), 총 플라보노이드 함량(TFC) 측정 결과 추출물은 모두 측정한계 미만으로 측정되었으며, 흑무 발효 물은 0.450 mg/g(P=0.003), 비 발효 흑무 분말은 0.243 mg/
g으로 측정되었다(Table 2). 총 폴리페놀 함량에서는 흑무 발효물이 열수, 30% 주정 추출물보다 낮은 함량을 보였으 나, 총 플라보노이드 함량에서는 가장 높은 함량을 보인 것 으로 미루어 보아 흑무 발효물에 더 다양한 생리활성물질이 포함된 것으로 보인다. 또한, 비 발효 흑무 분말과 비교하여 유산균 발효에 의해 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량이 모두 증가하였으며, 발효과정 중 유산균의 대사과정 을 통해 폴리페놀계열의 화합물과 플라보노이드계열의 화 합물이 증가하였다. Yamada 등(28)의 연구에 따르면 TPC 와 TFC가 증가함에 따라 항산화 효능이 증가하나 폴리페놀 과 플라보노이드의 종류 및 비율에 따라 라디칼 제거 활성에 차이가 있다고 보고되었다. 이를 토대로 볼 때 흑무 유산균 발효물의 TPC는 다른 추출물보다 월등히 높지는 않지만 유 용한 활성성분의 비율이 높아 다른 추출물보다 높은 항산화 활성을 나타낸다고 생각한다. 그에 대해 Lugasi(29) 및 Lutomski와 Speichert(30)의 연구에 따르면 흑무에는 폴리 페놀 및 플라보노이드 계열의 화합물 외에 아스코르브산, 베타카로틴, 토코페롤, 쿼세틴, 캠페롤 등 항산화 활성을 갖 는 다양한 활성 물질을 포함하고 있다. 이로 미루어 볼 때 발효를 통해 기존보다 유용한 폴리페놀 및 플라보노이드 계 열의 화합물이 증가하여 항산화 활성의 증가하였다.
지방구 형성 억제 시험
흑무 추출물과 흑무 발효물, 비 발효 흑무 분말에 대한
HepG2 세포의 생존률을 측정하였다. 흑무 추출물과 흑무 발효물, 비 발효 흑무 분말의 모든 농도(100, 500 μg/mL)에 서 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 3). 따라서 상기 농도 에 따라 HepG2 세포에 대한 지방구 형성 억제시험을 실시 하였다. 각 실험군의 실험 결과는 농도와 상관없이 OA군과 비교하여 통계분석 하였다. HepG2 세포에 OA를 처리하여 지방구 형성을 유도한 결과 221%가량 지방구 형성이 증가 한 것을 확인하였다. 흑무 열수 추출물 100 μg/mL 처리군과 50% 주정 추출물 100, 500 μg/mL 처리군을 제외한 실험군 모두에서 유의적인 지방구 형성 억제 효능을 확인하였다.
흑무 발효물은 100 μg/mL, 500 μg/mL 농도 모두 OA처리 군과 비교하여 지방구 형성률이 117.8%(P<0.05), 113.6%
(P<0.05)로 유의하게 지방구 형성이 감소하였으며, OA를 처리하지 않은 무처리군과 유의차가 없이 거의 동등한 수준 의 지방구 형성을 보였다. 또한, 양성대조군으로 사용한 밀 크씨슬보다 지방구 형성이 11.68% 더 억제되었으며, 비 발 효 흑무 분말 대비 1.3~1.4배의 지방구 형성 억제 활성을 보였다(Fig. 4). 간세포는 손상을 입은 후 회복하는 과정에 서 세포 내에 지방구를 형성하게 되며 이는 지방간으로 발전 되고 더 나아가 간 경화에 이르게 된다. 따라서 간세포의 지방구 형성이 억제되는 정도를 통해 시료가 간세포를 외부 요인으로부터 얼마나 보호할 수 있는지 간접적으로 확인할 수 있었다. Hanlon 등(12)에 의하면 흑무의 정제수 추출물 을 HepG2 세포주에 처리하면 간의 해독작용에 관여하는 cytochrome P450 계열의 효소와 quinone reductase, heme oxygenase 1, thioredoxin reductase 1의 발현을 유도하 여 간의 해독작용을 증가시키는 것으로 보고되었다. 또한, 본 연구팀이 선행연구로 진행한 Kim 등(31)에 의해 CCl4로 유도된 간 손상 랫드에서 항산화 효능 및 alanine amino- transferase, aspartate aminotransferase 및 지질과산화 의 감소를 확인하였다. 이러한 결과를 토대로 볼 때 흑무는
0 50 100 150 200 250
Vehicle OA MT BR Water30%EtOH50%EtOH70%EtOHFBR Sample
Lipid accumulation (%) .
100 μg/mL 500 μg/mL
Water 30% 50% 70% FBR EtOH EtOH EtOH
* * *
*
*
*
*
* *
*
Fig. 4. Effect of black radish extracts and fermented black radish on oleic acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells. Values are mean±SD (n=6). *P<0.05 compared to OA group by Stu- dent’s t-test. Vehicle, distilled water; OA, oleic acid; MT, milk- thistle extract; BR, non-fermented black radish; Water, water extract of black radish; 30%EtOH, 30% ethanol extract of black radish; 50%EtOH, 50% ethanol extract of black radish; 70%EtOH, 70% ethanol extract of black radish; FBR, fermented black rad- ish.
간 기능을 개선시키는 활성이 있으며, 유산균 발효 제조공정 이 이러한 간 기능 개선효능을 뒷받침해주는 지방구 형성 억제에 높은 활성을 나타내었다.
요 약
본 연구는 Lactobacillus plantarum을 이용하여 발효시킨 흑무 유산균 발효물의 간 손상 보호 효과를 알아보기 위해 기초적인 항산화 효능 및 간세포 지방구 형성 억제 활성 실 험을 하였다. 흑무 유산균 발효물은 단순 추출물 및 발효 전 단계의 영양원과 비교하여 유의적으로 증진된 항산화 효 능을 보였으며, 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 역시 발효를 통해 증가한 것을 확인하였다. 또한, 간 손상 유발 시 간세포에 형성되는 지방구의 형성 억제를 통한 간세 포 보호 효능도 단순 추출물 및 발효 전 단계 영양원과 대비 하여 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 이상의 결과를 통해 흑무 유산균 발효물은 종전의 흑무 추출물과 대비하여 손상에 의한 간세포의 지방구 형성 억제 효능이 증진되었으 며 이를 토대로 유산균 발효 흑무는 간 건강 개선을 위한 건강기능식품 소재로써 활용될 수 있는 가능성을 확인하였 다.
감사의 글
본 연구는 2017년도 농림축산식품부 농림수산식품기술기 획평가원에서 시행한 농생명산업기술개발사업(과제번호:
316006-5)의 지원에 의하여 수행되었으며 이에 감사드립 니다.
REFERENCES
1. Bradbury MW. 2006. Lipid metabolism and liver inflamma- tion. Ⅰ. Hepatic fatty acid uptake: possible role in steatosis.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G194-G198.
2. Reddy JK, Rao MS. 2006. Lipid metabolism and liver in- flammation. Ⅱ. Fatty liver disease and fatty acid oxidation.
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G852-G858.
3. Song YB, Kwak YS, Park KH, Chang SK. 2002. Effect of total saponin from red ginseng on activities of antioxidant enzymes in pregnant rats. J Ginseng Res 26: 139-144.
4. Coyle JT, Puttfarcken P. 1993. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science 262: 689-695.
5. Ricci JE, Waterhouse N, Green DR. 2003. Mitochondrial functions during cell death, a complex (Ⅰ-Ⅴ) dilemma. Cell Death Differ 10: 488-492.
6. Bertram C, Hass R. 2008. Cellular responses to reactive oxy- gen species-induced DNA damage and aging. Biol Chem 389: 211-220.
7. Wang Y. 2008. Bulky DNA lesions induced by reactive oxy- gen species. Chem Res Toxicol 21: 276-281.
8. Ediage EN, Di Mavungu JD, Scippo ML, Schneider YJ, Larondelle Y, Callebaut A, Robbens J, Van Peteghem C, De Saeger S. 2011. Screening, identification and quantifica- tion of glucosinolates in black radish (Raphanus sativus L.
niger) based dietary supplements using liquid chromatog- raphy coupled with a photodiode array and liquid chroma- tography-mass spectrometry. J Chromatogr A 1218: 4395- 4405.
9. Castro-Torres IG, Naranjo-Rodríguez EB, Domínguez-Ortíz MÁ, Gallegos-Estudillo J, Saavedra-Vélez MV. 2012. Anti- lithiasic and hypolipidaemic effects of Raphanus sativus L.
var. niger on mice fed with a lithogenic diet. J Biomed Bio- technol 2012: 161205.
10. Sipos P, Hagymási K, Lugasi A, Fehér E, Blázovics A. 2002.
Effects of black radish root (Raphanus sativus L. var niger) on the colon mucosa in rats fed a fat rich diet. Phytother Res 16: 677-679.
11. Lugasi A, Blázovics A, Hagymási K, Kocsis I, Kéry A. 2005.
Antioxidant effect of squeezed juice from black radish (Ra- phanus sativus L. var niger) in alimentary hyperlipidaemia in rats. Phytother Res 19: 587-591.
12. Hanlon PR, Webber DM, Barnes DM. 2007. Aqueous ex- tract from Spanish black radish (Raphanus sativus L. var.
niger) induces detoxification enzymes in the HepG2 human hepatoma cell line. J Agric Food Chem 55: 6439-6446.
13. Wang CY, Wu SJ, Shyu YT. 2014. Antioxidant properties of certain cereals as affected by food-grade bacteria fermen- tation. J Biosci Bioeng 117: 449-456.
14. Dordevic TM, Siler-Marinkovic SS, Dimitrijevic-Brankovic SI. 2010. Effect of fermentation on antioxidant properties of some cereals and pseudo cereals. Food Chem 119: 957-963.
15. Hur SJ, Lee SY, Kim YC, Choi I, Kim GB. 2014. Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods. Food Chem 160: 346-356.
16. Jeng KC, Chen CS, Fang YP, Hou RCW, Chen YS. 2007.
Effect of microbial fermentation on content of statin, GABA, and polyphenols in Pu-Erh tea. J Agric Food Chem 55:
8787-8792.
17. Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Yang M, Rice-Evans C.
1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS rad- ical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med 26:
1231-1237.
18. Blois MS. 1958. Antioxidant determinations by the use of
a stable free radical. Nature 181: 1199-1200.
19. Marklund S, Marklund G. 1974. Involvement of the super- oxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay of superoxide dismutase. Eur J Biochem 47: 469-474.
20. Folin O, Dennis W. 1912. On phosphotungstic-phosphomo- lybdic compounds as color reagents. J Biol Chem 12: 239- 243.
21. Davis WB. 1947. Determination of flavanones in citrus fruits.
Anal Chem 19: 476-478.
22. Kang OH, Kim SB, Seo YS, Joung DK, Mun SH, Choi JG, Lee YM, Kang DG, Lee HS, Kwon DY. 2013. Curcumin decreases oleic acid-induced lipid accumulation via AMPK phosphorylation in hepatocarcinoma cells. Eur Rev Med Pharmacol Sci 17: 2578-2586.
23. Jung TD, Shin GH, Kim JM, Choi SI, Lee JH, Lee SJ, Park SJ, Woo KS, Oh SK, Lee OH. 2017. Comparative analysis of γ-oryzanol, β-glucan, total phenolic content and antioxi- dant activity in fermented rice bran of different varieties.
Nutrients 9: 571.
24. Lee DH, Hong JH. 2016. Physicochemical properties and antioxidant activities of fermented mulberry by lactic acid bacteria. J Korean Soc Food Sci Nutr 45: 202-208.
25. Lugasi A, Dworschak E, Blazovics A, Kery A. 1998. Anti- oxidant and free radical scavenging properties of squeezed
juice from black radish (Raphanus sativus L. var niger) root.
Phytother Res 12: 502-506.
26. Song HS, Eom SH, Kang YM, Choi JD, Kim YM. 2011.
Enhancement of the antioxidant and anti-inflammatory ac- tivity of Hizikia fusiforme water extract by lactic acid bac- teria fermentation. Kor J Fish Aquat Sci 44: 111-117.
27. Kwon HN. 2013. The effect of the antioxidant activities of fermented mulberry extracts as cosmetic material. J Invest Cosmetol 9: 221-227.
28. Yamada T, Yamamoto M, Tanimura A. 1978. Studies on the formation of nitrosamines. Ⅶ. The effects of some poly- phenols on nitrosation of diethylamine. J Food Hyg Soc 19:
224-227.
29. Lugasi A. 2001. Effects of dietary antioxidants in primary and secondary prevention: Animal and human studies. PhD Dissetation. Semmelweis University, Faculty of Medicine, Budapest, Hungary.
30. Lutomski J, Speichert H. 1982. Black radish as a source of various phytopharmaceuticals. Pharm Unserer Zeit 11: 151- 155.
31. Kim JT, Ahn MJ, Kim SE, Lee HS, Kim HK, Kim GO, Shin TK. 2017. Hepatoprotective effect of fermented black radish (Raphanus sative L. var niger) in CCl4 induced liver injury in rats. J Prev Vet Med 41: 143-149.
