76 책임저자：박해룡, 631-701, 경남 마산시 월영동 449번지
경남대학교 식품생명학과
Tel: 055-249-2689, Fax: 055-249-2995 E-mail: [email protected]
접수일：2010년 1월 4일, 1차수정일: 2010년 1월 8일, 2차수정일: 2010년 1월 11일, 게재승인일：2010년 1월 13일
Correspondence to：Hae-Ryong Park
Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, 449, Wolyoung-dong, Masan 631-701, Korea
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대장암 세포주 HT-29에 대한 애엽 (Artemisia argyi) 추출물의 항암 활성
경남대학교 식품생명학과 이정민ㆍ김현정ㆍ문성희ㆍ박해룡
Anticancer Activity of Artemisia argyi Extracts on HT-29 Human Colon Cancer Cells
Jeung-Min Lee, Hyun-Jung Kim, Seong-Hee Moon and Hae-Ryong Park Department of Food Science and Biotechnology, Kyungnam University, Masan 631-701, Korea
Natural products have recently become the focus of increased research interest, due to their potential for pharmacological activities. In this paper, we report on the anticancer activities of methanolic extracts from Artemisia argyi (AAM) against HT-29 human colon cancer cells. The primary objective of this study was to determine the mechanisms inherent in AAM-induced cytotoxicity and apoptosis in HT-29 cells.
We found that AAM induced cytotoxicity in a dose-dependent manner, as determined by the results of an MTT reduction assay, an LDH release assay, and a colony formation assay. As expected, AAM induced characteristic apoptosis signs in HT-29 cells, including apoptotic body and sub-G1 DNA content via Hoechst staining and flow cytometric analysis. These results indicate that AAM may contains bioactive materials and potential candidates as a chemotherapeutic agent in human colon cancer cells. (Cancer Prev Res 15, 76-82, 2010)
Key Words: Natural products, Artemisia argyi, HT-29 cells, Cytotoxicity, Apoptosis
서 론
1990년대 이후 산업이 급속도로 발달함에 따라 식습 관의 변화로 인하여 영양부족이나 전염성 질병으로 인 한 문제점 보다는 만성질환에 대한 문제점이 크게 대두 되고 있다.1,2) 이러한 만성질환으로는 암, 비만, 고혈압, 당뇨병 등이 있지만 그 중에서 높은 치사율을 가지며, 아직까지도 완전한 치료제가 없는 질환인 암이 대표적 이다.3) 암은 정상세포가 돌연변이를 일으켜 무분별적으 로 증식하여 나타나는 질병으로 혈액, 장기, 뼈 등에서
병을 일으키며, 혈관을 통해 다른 장기로 이동하여 전이 를 일으킨다.4) 이러한 암을 치료하기 위해서는 수술을 통해 제거하거나, 방사선을 이용하여 제거하거나, 약물 을 통해 치료하는 방법이 있지만 수술의 경우는 위험성 이 높으며, 방사선과 약물치료 시 암세포에만 선택적으 로 작용하는 것이 아니라 정상세포에도 피해를 주어 조 혈기능 억제, 구토, 점막 궤양, 탈모증 등의 부작용을 야 기한다.5∼7) 이러한 부작용을 개선하기 위하여 복합적으 로 치료하는 기법을 도입하여, 수술을 통해 암세포를 제 거한 후 약물과 방사선치료를 통해 완전히 제거하는 방 법으로 병행하거나,8,9) 고성능 컴퓨터로 조정되는 로봇
을 이용하여 고용량 방사선을 정확하고 안전하게 투여 하는 방법이 있지만, 이러한 기법도 미흡하지만 부작용 을 초래하며 경제적인 부담이 커진다는 단점을 가지고
있다.10∼12) 현재 암 치료 연구는 암세포에만 선택적으로
작용하는 기전을 찾아 그것을 저해하는 물질을 탐색하 는 방법에 중점을 두고 있다.13)
특히, 이러한 암 중에서 대장암은 맹장, 결장, 직장에 서 생기는 악성 종양으로서 대장 자체의 확장성으로 인 하여 조기발견 및 조기치료가 어려워 아주 높은 치사율 을 나타내고 있으며, 다른 장기들을 둘러싸고 있어 전이 가 잘 일어나며, 형태는 암세포가 서로 덩어리진 모습을 가진 전형적인 고형암으로서 완벽한 치료는 매우 어렵
다.14,15) 이러한 대장암을 치료하는 약물을 개발하기 위해
서는 약물이 종양의 중심부분까지 영향을 주어 암세포 에만 선택적으로 활성을 가지게 하여 부작용이 없는 치 료제를 찾는 것이 중요한 부분이라 할 수 있다.16,17) 본 연구팀은 국내ㆍ외에서 자생하고 있는 약용 식물 을 대상으로 인간 유래의 대장암 세포주 HT-29의 성장 을 효과적으로 저해하는 천연추출물의 탐색을 시도하 여, 애엽(Artemisia argyi) 추출물로부터 HT-29 세포주에 대 해서 강력한 세포독성과 apoptosis를 유도하는 활성을 확 인할 수 있었다. 애엽은 국화과에 속한 황해쑥의 잎을 건조한 것으로 우리나라 각지에서 자생을 하며 높이는 60∼120 cm이며 꽃은 7∼9월에 피는데, 원줄기 끝의 원 추화서에 한쪽으로 치우쳐서 달린다.18) 수과는 길이 1.5 mm, 지름 0.5 mm이며 털이 없다. 약재는 지상부의 윗부 분을 잘라 20∼25 cm 길이의 다발로 묶여 있다. 줄기는 지름 1∼4 mm이며 짧은 흰털이 밀생하여 엷은 황백색을 이루고 5∼8개의 세로줄이 있으며, 인체에 차가운 기운 을 날리고 통증을 완화시키는 작용이 있으며 경락을 따 뜻하게 하고 출혈을 멈추게 하는 효능이 있으며,19) 효모 를 이용한 추출물 또한 좋은 효능이 있다고 보고되어 있 다.20) 성분으로는 tricyclene, limonene, caryophyllene oxide 등의 정유 성분을 대부분 함유하고 항균효과를 가진다 고 알려져 있으며,21) eupatilin을 함유하고 있어 항궤양 효 과를 가진다고 보고되고 있으며,22) in vitro에서 항암활성 효과가 있다고 보고되어 있지만, 대장암 세포주에 대한 항암활성은 보고가 되어 있지 않다.23)
따라서 본 연구에서는 천연자원으로부터 항암 활성을 가지는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 애엽 추출물을 이용하여 대장암 세포주 HT-29에 대한 선택적인 항암 활성 효과를 밝히고자 하였다.
재료 및 방법 1. 실험 재료
본 실험에 사용한 애엽(Artemisia argyi)은 2009년 9월 경 남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 실험에 사용 하였다. 동물 세포주의 배양을 위해 RPMI1640 medium, fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고, 암세 포의 세포독성 효과를 알아보기 위한 시약으로 MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co. (St Louis, Mo, USA)로부터 구입하였으 며, LDH (lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하 였다. 그 외의 연구에 사용된 여러 종류의 용매 및 시약 은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
2. 추출물 제조
애엽 5 g에 methanol 용매 100 ml을 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출한 후, 여과지(Advantec, Tokyo, Japan)를 이용해 여과하였다. 여과된 추출여액은 회전감 압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 40°C에서 감 압 농축하였으며, 이를 AAM이라 명명하였다. 또한 농도 에 맞게 AAM을 DMSO에 녹였고, 세포주에 처리 시 DMSO 농도가 1%로 되도록 희석하여 사용하였다.
3. 암세포의 배양
본 실험에 사용된 인간 유래의 대장암 세포주인 HT-29는 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 분양 받 아 사용하였다. 세포배양을 위해 RPMI1640 medium에 10% fetal bovine serum (FBS) 및 100 unit/ml의 penicillin, 100 μg/ml의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습 도가 유지되는 37°C, 5% CO2 incubator (MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
4. 암세포의 형태학적 변화 관찰
HT-29 세포주의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해 6-well plate에 2⨉105 cells/well로 2 ml씩 첨가한 후 24시간 동안 배양하고, AAM을 각각 50, 100, 250 μg/ml의 농도 로 처리한 후 24시간을 배양하였다. Phase contrast micro- scope (Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 형태학적 특징을 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
5. MTT reduction assay
HT-29 세포주의 세포생존율을 확인하기 위해 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포를 1⨉105 cells/ml로 맞 추고 96-well plate에 각각 100 ml씩 첨가하여 24시간 동안 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, AAM을 각각 50, 100, 250 μg/ml의 농도로 HT-29 세포주에 처리한 후, 24 시간 동안 배양하였다. 각 well에 PBS 완충용액에 녹인 MTT (5 mg/ml) 용액을 10 μl씩 첨가하여 다시 1시간 동 안 배양하였다. Formazan 형성을 확인한 후, 배지를 완전 히 제거하고, 100 μl의 DMSO를 첨가한 후 ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도 를 측정하였다. AAM을 처리하지 않고 배양시킨 대조군 세포를 100%로 하였을 때, 상대적인 세포생존율을 측정 하였다.
6. LDH release assay
AAM의 세포독성 효과를 측정하기 위하여 LDH release assay를 실시하였다. HT-29 세포주를 1⨉105 cells/ml로 맞 춘 후, 100 μl씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에 서 24시간 배양한 뒤, 50, 100, 250 μg/ml의 농도로 제조 한 AAM을 HT-29 세포주에 처리하였다. 다시 24시간 동 안 배양한 후, 배양액의 상층 부분을 새로운 96-well plate 에 50 μl 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50 μl씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20분간 반응하였다. 반 응이 완료가 되는 것을 확인한 후 Stop solution인 1 N HCl 을 100 μl씩 첨가하여 반응을 중지 시킨 후, ELISA reader 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 살아남 은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 제거한 후, 0.5%
Triton X-100용액을 50 μl씩 첨가하여 10분 동안 shaking 시켜 세포벽을 제거한 후, LDH reagent를 50 μl씩 첨가 하여 반응 시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 대한 세포 독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 AAM을 처리하지 않은 대조군과의 값을 비교 하여 나타내었다.
7. Colony formation assay
HT-29 세포주에 AAM을 처리한 후 세포생존율을 측정 하기 위하여 colony formation assay를 실시하였다. 6-well plate에 5⨉104 cells/ml로 plating하여 배양시킨 후 AAM을
50, 100, 250 μg/ml의 농도로 처리하고 24시간 배양시킨 후 새로운 배지로 희석하여 6-well plate에 1⨉103 cells/ml 이 되도록 Replating하여 7∼8일 동안 37°C, 5% CO2
incubator에서 배양하였다. 형성된 colony는 10% formalin 으로 고정하고, 0.01% crystal violet으로 염색하여 coun- ting하였다. 세포생존율은 AAM을 처리하지 않은 대조군 값을 100%로 두고 나타내었다.
8. Hoechst 33342 staining
HT-29 세포주의 apoptotic body를 측정하기 위하여 Ho- echst 33342 (Sigma, Mo, USA)로 염색하였다. 6-well plate에 2⨉105 cells/well로 24시간 동안 배양하여 AAM 50, 100, 250 μg/ml 농도로 처리하고 24시간 배양 시킨 후, PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% formalin으로 고정한 후, Hoechst 33342 (10 μM)로 염색하여 형광현미경하에서 400배로 관찰하였다.
9. Flow cytometric analysis
HT-29 세포주의 apoptotic cell을 측정하기 위하여 flow cytometer로 세포주기를 측정하였다. 6 cm dish에 1⨉106 cells/dish로 세포를 분주하여 24시간 배양한 후, AAM을 50, 100, 250 μg/ml의 농도로 처리하였다. 세포를 48시간 배양시키고, 부유 세포 및 trypsin 처리한 세포들을 모아 서 4°C, 2,000 rpm으로 5분간 원심분리를 한 후 상층액을 제거하고, 다시 4°C, 5,000 rpm으로 5분간 원심분리를 하 여 상층액을 제거하고, 70% ethanol 1 ml을 넣고 4°C에서 세포를 고정시켰다. 4°C에서 2,000 rpm으로 2분간 원심 분리하고 PBS 용액으로 수세한 후, propidium iodide/
RNase staining buffer (BD pharmingenTM) 1 ml를 첨가하고, 어두운 상온에서 10분간 staining 한 후, flow cytometry ca- liber (Beckman coulter epics XL)를 이용하여 세포주기를 분 석하였다.
10. 통계처리
모든 자료처리는 SPSS-PC＋ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치±표준편차 (SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 One-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하 고 Scheffe’s test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가 하였다.
Fig. 1. Cytotoxic effect of methanolic extracts from Artemisia argyi (AAM) against HT-29 human colon cancer cells. (A) The cells were treated with 50, 100, and 250 μg/ml of AAM. After MTT assay, the cell viability (means±S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of AAM. (B) Morphological changes were monitored for 24 h. The cells were treated with various concentrations of AAM for 24 h (a: control, b: 50 μg/ml, c: 100 μg/ml, d: 250 μg/ml).
The photographs were taken with a phase-contrast microscope at 100⨉ magnification. *significant vs. control untreated cells (p＜0.001).
Fig. 2. Effects of AAM on cytotoxicity in HT-29 cells. The cells were exposed to 50, 100, and 250 μg/ml of AAM for 24 h.
Cytotoxicity was measured with the LDH release assay. As the results of LDH release assay (mean±S.D. of triplicate determination), data were normalized to the activity of LDH released from vehicle-treated cells (100%) and expressed as percentage of the control. *p＜0.01, **p＜0.001.
결과 및 고찰
1. 대장암 세포주 HT-29에 대한 애엽 추출물(AAM)의 세포독성 효과
대장암 유래의 세포주 HT-29 세포주에 애엽(Artemisia argyi)의 세포독성을 확인하기 위해 methanol로 추출하여 세포주에 처리하고 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 대장암 세포주에 대한 세포독성 효과를 확인 하였다. 애엽 추출물(AAM)의 형태학적 관찰과 MTT re- duction assay를 이용하여 확인한 결과는 Fig. 1과 같다.
AAM을 50, 100 μg/ml의 농도로 HT-29 세포주에 처리했 을 때 각각 83.8과 69.7%의 낮은 세포독성을 나내었지만, 250 μg/ml의 농도에서는 26.5%로 강력한 세포독성을 나 타내었다(Fig. 1A). 다음으로 AAM이 HT-29 세포주에 대 한 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해 in- verted microscope를 이용하여 무처리한 대조군과의 비교 를 통해 세포의 형태를 관찰하였다. AAM을 50, 100, 250 μg/ml의 농도로 각각 처리한 결과, 무처리한 대조군과 비교하였을 때, 대조군의 세포는 조밀하고, 정상적으로 성장하는데 비해서 AAM이 처리된 세포는 전체적인 세 포의 수가 적을 뿐만 아니라 그 형태가 응축되어 있으며 불규칙적인 형태를 가지면서 세포사멸이 나타난 것이 관찰되었다(Fig. 1B).
또한, 동일한 조건하에 AAM의 세포독성 효과를 확인
하기 위하여 배양액 중 들어있는 LDH (lactate dehy- drogenase)의 방출량을 측정하였다. Fig. 2와 같이 AAM의 농도가 증가할수록 LDH의 방출량은 증가하였으며 250 μg/ml의 농도에서는 51.4%로 나타내었다(Fig. 2). AAM 의 세포독성 효과를 좀 더 정확하게 알아보기 위해 AAM 을 HT-29 세포주에 처리하여 colony formation assay를 실
Fig. 4. Apoptosis effect of AAM in HT-29 cells. (A) Analysis of apoptotic body on HT-29 cells. The cells were treated with various concentrations of AAM for 24 h (a: control, b: 50 μg/
ml, c: 100 μg/ml, d: 250 μg/ml). Fixed cells were stained with Hoechst 33342 (10 μM) and examined by fluorescence microcopy at 400⨉ magnification. The arrow indicates the apoptotic cell. (B) A flow cytometric analysis of HT-29 cells at the indicated concentration of AAM (a: control, b: 50 μg/ml, c: 100 μg/ml, d: 250 μg/ml) for 24 h. The cell cycle distri- bution was determined by a flow cytometric analysis of the DNA content after staining with propidium iodide. Data (mean±S.D. of triplicate determinations) are representatives of at least three independent experiments. *Significant vs. control untreated cells (p＜0.001).
Fig. 3. AAM-induced cell death in HT-29 cells. The cells were exposed to the 50, 100, and 250 μg/ml of AAM for 24 h. After colony formation, the survival rate (mean±S.D. of triplicate determinations) was calculated by setting each of the control survival rates. After 7∼8 days, the formed colonies were fixed with 10% formaldehyde, stained with 0.01% crystal violet, and counted. *Significant vs. control untreated cells (p＜0.001).
시하였다. HT-29 세포주에 AAM을 50, 100, 250 μg/ml의 농도로 처리하여 세포생존율을 확인해본 결과는 Fig. 3 과 같다. AAM 50, 100 μg/ml의 농도에서 30.9, 17.5%의 colony 형성능을 보였으며, 250 μg/ml의 농도에서는 HT- 29 세포주의 colony 형성능을 4% 이하의 수준으로 감소 시키는 AAM의 강력한 세포독성 효과를 확인할 수 있었 다(Fig. 3).
이상의 결과로부터 AAM은 대장암 세포주 HT-29에 대 해서 강력한 세포독성 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
2. HT-29 세포주에 대한 AAM의 apoptosis 유도 효과
Apoptosis는 다세포 생물에서의 programmed cell death를 말하며 세포의 죽음에 관련하여 능동적으로 일어나는 cell death 과정 중 하나이다.24) Apoptosis가 일어나면 세포 는 면역반응을 일으켜, 핵의 condensation 및 DNA가 일정 한 크기로 조각나는 형상이 나타나며, 세포질 속 세포소 기관 및 세포막 등에서의 변화가 발생하여 세포가 사멸 하게 되는 것으로 알려져 있다.25) 일반적으로 암세포들 은 이러한 apoptosis 경로가 불활성화 되어져 무분별하게 증식하는 것을 말한다. 본 논문에서는 AAM이 가지는 세 포독성 효과의 기전연구를 위해 HT-29 세포주의 apo- ptosis 활성 여부를 확인하였다. Apoptosis의 형태학적 특 징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰
하였다(Fig. 4A). 그 결과 대조군에서는 타원형의 온전한 핵 모양을 볼 수 있는 반면 50, 100, 250 μg/ml의 AAM을 처리한 경우의 세포핵은 condensation과 fragmentation으로 인한 apoptotic body가 관찰되어 전형적인 apoptosis 특징 을 나타내었다. Hoechst 염색 결과로부터 AAM의 세포독성 효과가 apoptosis와 관계가 있다는 것을 알 수 있었다.
다음으로 flow cytometry를 이용하여 HT-29 세포주의
세포주기를 분석하였다(Fig. 4B). Apoptotic cell을 나타내 는 Sub-G1기의 세포수는 AAM 처리에 의해 농도 의존적 으로 증가하였으며 250 μg/ml의 농도에서 13% 정도의 apoptotic cell을 확인할 수 있었다. 이 결과는 AAM이 HT- 29 세포주에 대해서 강력하게 apoptosis를 유도하여 항암 활성을 나타낸다는 것을 의미하는 결과라고 할 수 있다.
결 론
본 연구는 애엽(Artemisia argyi) 추출물의 항암 활성 효 과와 작용기전을 확인하기 위한 연구로서 애엽 methanol 추출물(AAM)을 이용하였다. 먼저 인간 유래의 대장암 세포주인 HT-29에 AAM을 농도별로 처리하여 여러 가지 세포생물학적인 assay 방법을 이용하여 세포독성 효과를 확인하였다. 그 결과 농도 의존적으로 강력한 세포독성 효과를 확인할 수 있었다. 또한 HT-29 세포주의 형태학 적 변화를 관찰한 결과에서도 AAM을 처리한 세포들은 control에 비해 세포의 응축 및 형태학적 변화가 두드러 지게 나타났다. 특히, AAM 250 μg/ml의 농도에서는 colony 형성이 안 될 정도의 강력한 항암활성을 나타내었 다. 그리고 AAM의 apoptosis 유도 실험에서 HT-29 세포 주의 apoptotic body와 sub-G1기의 apoptotic cell이 증가하 는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과로부터 애엽은 인간 대장암 치료에 효과 적인 항암 활성 소재로 사용될 수 있는 가능성을 제시하 였다.
감사의 글
이 연구결과물은 2009학년도 경남대학교 학술연구장 려금지원에 의한 것임.
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