Methyl Jasmonate 유도체(J-7)에 의한 인체간암세포의 Apoptosis 유발에서 ERK 및 JNK 역할

126 책임저자：최영현, 󰂕 614-052, 부산시 진구 양정동 산 45번지

동의대학교 한의과대학 생화학교실 Tel: 051-850-7413, Fax: 051-853-4036 E-mail: [email protected]

접수일：2011년 5월 3일, 1차 수정일：2011년 5월 9일, 2차 수정일：2011년 5월 16일, 게재승인일：2011년 5월 24일

Correspondence to：Yung Hyun Choi

Department of Biochemistry, Dongeui University College of Oriental Medicine, San 45, Yangjung-dong, Busanjin-gu, Busan 614-052, Korea Tel: ＋82-51-850-7413, Fax: ＋82-51-853-4036

E-mail: [email protected]

Methyl Jasmonate 유도체(J-7)에 의한 인체간암세포의 Apoptosis 유발에서 ERK 및 JNK 역할

동의대학교 한의과대학 생화학교실, 한의학연구소, 대학원 바이오물질제어학과 및 블루바이오소재개발센터

박 철ㆍ최영현

Induction of Apoptosis by J-7, a Methyl Jasmonate Derivative, in Human Hepatocarcinoma Hep3B Cells through Activation of the ERK and JNK

Cheol Park and Yung Hyun Choi

Department of Biochemistry, College of Oriental Medicine and Research Institute of Oriental Medicine, Department of Biomaterial Control, Graduate School and Blue-Bio Industry Regional Innovation Center,

Dongeui University, Busan 614-015, Korea

In the present study, it was investigated that the effects of mitogen-activated protein kinases (MAPK) signal pathway on the apoptosis induction of Hep3B human hepatocarcinoma cells by a synthetic methyl jasmonate derivative (methyl 5-chloro-4,5-didehydrojasmonate, J-7). We found that treatment of Hep3B cells with J-7 markedly increased phospholylation of extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) and c-Jun N-terminal kinase (JNK), and pretreatment an ERK-specific inhibitor, PD98059, and a JNK-specific inhibitor, SP600125, showed increased anti-proliferative action and apoptosis by J-7. The synergistic increased apoptotic events in Hep3B cells caused by blocking the ERK and JNK pathways were associated an up-regulation of death receptor 5 (DR5) and a decrease of Bid, X-linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) and cIAP-1 expression. Additionally, our results also indicated that the increased apoptosis by co-administration of PD98059 and SP600125 with J-7 in Hep3B cells was connected with the down-regulation of pro-caspases (-3, -8 and -9). Taken together, these findings suggest that apoptotic cell death by J-7 in Hep3B cells are associated with the activation of the ERK and JNK pathways. (Cancer Prev Res 16, 126-133, 2011)

Key Words: J-7, Hep3B, Apoptosis, ERK, JNK

서 론

간암은 전 세계적으로 가장 흔하게 나타나는 악성종 양 중 하나로서 모든 암 중에서 네 번째로 사망률이 높 을 뿐만 아니라 매년 500,000에서 1,000,000명 정도의 환 자가 새롭게 발생하는 것으로 알려져 있다.

일반적으

로 간암은 hepatitis B virus, hepatitis C virus 및 Aflatoxin B1

등에 의하여 유발되는 것으로 알려져 있다.

현재 간암

의 치료를 위해서는 외과적 절제술, 방사선요법 및 화학

요법 등이 사용되고 있으며 이들 중 외과적인 절제술이

가강 최상의 치료방법으로 알려져 있지만 간암이 어느

정도 진행이 되었을 경우에는 완전한 치료가 어려우며

재발의 확률도 매우 높은 것으로 보고되고 있을 뿐 만

아니라 화학요법을 위하여 사용되고 있는 화학요법제재 의 경우에도 여러 가지 부작용이 나타나고 있는 실정이 다.

또한 최근 간암의 진단 및 치료에 있어서 여러 가지 새로운 방법들이 제시되고 있지만 대부분의 간암환자들 은 진단 후 1년 이내에 사망하는 것으로 알려져 있다.

따라서 간암을 치료하는데 있어서 보다 더 효과적인 활 성을 지닌 물질을 발굴하고 이들에 의한 항암활성의 기 전을 밝히는 것이 중요할 것이다.

생체 내에서 흔히 관찰되는 apoptosis는 개체의 발생단 계나 DNA 손상, 바이러스 감염 등에 의한 유전적 조절 하에서 일어나는 정교한 개체의 생존을 위한 방어기전 으로 알려져 있으며, 종양의 자연 치유나 항암제에 의해 암세포의 죽음이 유발될 때 많이 관찰되므로 항암제의 항종양기전 연구에 있어서 많은 연구자들의 관심을 받 고 있다.

이러한 apoptosis는 mitochondria 비의존적이며 apoptotic ligand가 Fas, tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-receptor 1 (TRAIL-R1, DR4), TRAIL-R2 (DR5) 등과 같은 death receptor와 결합함 으로서 유발되는 extrinsic pathway와 mitochondria 의존적 이며 여러 가지 외부 자극에 의하여 mitochondrial mem- brane permeability (MMP, Δψm)의 변화가 유발되어 mi- tochondria 내에 존재하는 여러 종류의 apoptotic molecule 들이 세포질로 방출됨으로서 시작되는 intrinsic pathway 에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있다.

한편 ser- ine/threonine protein kinases로서 세포의 성장, 분화, 증식, 사멸 및 스트레스 반응 등과 같은 여러 가지 세포 반응 을 조절하는 것으로 알려져 있는 mitogen-activating pro- tein kinases (MAPKs)는 특히 apoptosis 유발에 관여하는 signal pathway로서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려 져 있다.

MAPKs는 extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38-MAPK로 구성되어 있으며, JNK 및 p38-MAPK는 proinflammatory cytokines, UV irradiation, heat, osmotic shock, hydrogen per- oxide 및 DNA 손상 등에 의하여 활성화되어 성장억제 또는 apoptosis 유발에 관여하는 반면에, ERK의 경우는 growth factors, cytokines 및 phorbol esters 등과 같은 mito- genic stimuli에 의하여 활성화되어 세포의 성장 및 분화 에 관여하는 것으로 알려져 있다.

하지만 최근 연구 에 따르면 세포가 처한 환경 변화에 따라 ERK, JNK 및 p38-MAPK 모두 성장 억제 및 apoptosis 유발과 세포의 성 장 및 분화에 각기 다르게 관여할 수 있다고 보고되고 있다.

Cis-jasmone, jasmonic acid 및 methyl jasmonate 등을 포함 하는 jasmonate family는 식물계에 흔히 존재하는 fatty-

acid-derived cyclopentanone으로서 식물의 세포 내 신호전 달 기전을 조절하며 외부 자극에 대하여 방어 작용을 하 는 것으로 알려져 있다.

Jasmonate는 lipoxygenase path- way를 통하여 α-linolenic acid로부터 합성되는데 먼저 li- nolenic acid가 lipoxygenase에 의하여 13-hydroperoxylinolenic acid로 변형이 유발되고 난 다음 jasmonic acid는 methyl jasmonate로 전환된다.

최근 연구에 따르면 methyl jasmonate는 melanoma, lymphoma 및 leukemia 등과 같은 여 러 종류의 인체 암세포에서 항암활성을 가지는 것으로 보고되고 있다.

또한 methyl jasmonate는 약제내성을 가진 세포의 활성 증가, metastatic melanoma에서의 세포 독성 효과 및 lymphoma-bearing mice의 수명 증가 등과 같 은 많은 약리학 및 생물학적 활성을 가지는 것으로 알려 져 있어 암치료에 있어서 새로운 물질로서 많은 관심을 받고 있다.

이전 연구 결과에 따르면 synthetic methyl jasmonate de- rivative인 J-7이 인체 간암세포인 Hep3B 세포에서 apopto- sis를 유발한다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 연구에 서는 J-7에 의한 apoptosis 유발에 있어서 MAPK signal pathway가 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 암세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였고, J-7 및 MAPK에 의한 증식억제 현상이 apoptosis에 어떠한 영향 을 미치는지를 유전자 수준에서 조사하여 유전자들의 발현 변화에 대한 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고 하는 바이다.

재료 및 방법

본 실험에 사용된 J-7은 부산대학교 약학대학에서 제

공 받았으며,

DMSO를 이용하여 100 mg/ml의 농도로

만든 다음 초저온 냉동고에 보관하였고 적정 농도로 배

지에 희석하여 처리하였다. 단백질 분석을 위하여 사용

된 ERK, JNK, p38, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad, Bid, DR5,

XIAP, cIAP-1, caspase-3, -8, -9, PARP 및 Actin 항체는

Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구

입하였으며, phospho-ERK, phospho-JNK 및 phospho-p38

항체는 Cell Signaling (Beverly, MA)에서 구입하였다. 또한

immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 horseradish per-

oxidase (HRP)-conjugated anti-mouse 및 anti-rabbit 항체는

Amersham Life Science Corp. (Arlington Heights, IL, USA)에

서 구입하였다.

2. 세포배양

실험에 사용한 인체 간암 세포주인 Hep3B 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받았으며 90%의 RPMI-1640 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL)에 2 mM glutamine, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin (Gibco BRL)이 포함된 성장배지를 사 용하여 5% CO

, 37

C의 조건하에서 배양하였다. 배지는 매 48시간마다 교환해주었고, 세포수의 증식에 따른 과 밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-ethylenedi- amine tetraacetic acid (EDTA, Gibco BRL)를 처리하여 세포 를 부유시킨 다음 적정수의 세포를 분주하여 재배양하 였다.

3. MTT assay에 의한 세포 성장억제 조사

세포 배양용 6 well plate에 Hep3B 세포를 1×10

개/ml로 분주하여 안정화 시킨 다음 PD98059, SP600125 및 J-7을 각각 배지에 희석하여 각 well 당 적정농도로 처리하였 다. 24시간 경과 후 0.5 mg/ml 농도의 tetrazolium bromide salt (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)를 2 ml씩 분주하고 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양시킨 다음 MTT 시약 을 깨끗하게 제거하고 DMSO를 1 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 96 well plate에 200 μl씩 옮겨서 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정은 모두 세 번을 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차를 Microsoft EXCEL program을 사용하여 분석하였다.

4. DAPI staining에 의한 세포핵의 형태 관찰

Apoptosis가 유발되었을 경우 특이적으로 나타나는 핵 의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 PD98059, SP600125 및 J-7이 처리된 세포를 모은 다음 37% formaldehyde 용액 과 PBS를 1：9의 비율로 섞은 fixing solution을 모아진 세 포에 500 μl 첨가하여 충분히 섞은 후, 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 2,000 rpm으로 5분간 원 심 분리하여 fixing solution을 제거하고 PBS 200 μl에 부 유시킨 후 세포가 포함되어 있는 PBS 80 μl를 slide glass 위에 떨어뜨리고 1,000 rpm에서 5분간 cytospin하여 세포 를 slide glass에 부착하였다. 세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2∼3회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100 (Amresco, Solon, OH, USA)을 첨가하여 상온 에서 10분간 고정한 후 2.5 μg/ml 농도의 4',6-diamidino- 2-phenylindole (DAPI, Sigma, St. Luis, MO, USA) 용액을 처

리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처 리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400 배의 배율로 각 농도에 따른 암세포의 핵의 형태 변화를 관찰하였다.

5. Protein extraction 및 western blot analysis에 의 한 단백질 발현의 분석

상기와 동일한 방법으로 처리된 세포에 적당량의 lysis buffer [25 mM Tris-Cl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4

C에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 상층액에 있는 total 단백질을 분리하였다. 상층액 의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 동량의 sample을 sodium dodecyl sulphate (SDS)- polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다. 분리된 단백 질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 처 리하여 비특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하 고 1차 antibody를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4

C에서 over night 시킨 다음 처리된 1차 antibody에 맞는 2차 antibody (PBS-T로 1：1,500으로 희석하여 사용)를 사 용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 Enhanced Chemiluminoesence (ECL) slution (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL, USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현 변화를 분석하였다.

결과 및 고찰

1. MAPKs의 발현에 미치는 J-7의 영향

Serine/threonine protein kinases로 알려진 MAPKs는 ERK,

JNK 및 p38-MAPK로 구성되어 있으며, 여러 가지 외부

자극에 의하여 활성화되어 gene expression, mitosis, cell

proliferation 및 apoptosis 등에 관여하면서 생리학적인 항

상성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

최근 연구에

따르면 MAPKs는 세포의 종류 및 자극의 종류에 따라서

세포의 생존 및 apoptosis 유발에 각각 다르게 작용한다고

보고되고 있다.

따라서 본 연구에서는 Hep3B 인체간

암세포에 J-7을 처리하였을 경우 MAPKs의 발현에 어떠

Fig. 1. Expression levels of MAPKs by J-7 treatment in Hep3B human hepatocarcinoma cells. The cells were treated with 50 μM of J-7 for the indicated times. The cells were lysed and then equal amounts of cell lysates (50 μg) were separated on SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies and the proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.

Fig. 2. Effects of with PD98059 and SP600125 on growth inhibition and apoptosis by J-7 treatment in Hep3B human hepatocarcinoma cells. Cells were seeded into 6-well plate at 2×10⁵ cells/ml. And than, PD98059 (50 μM) and SP600125 (10 μM) were used for pretreatment for 1 h before treatment with 50 μM of J-7 (50 μM) for 24 h. (A) The growth inhibition was measured by the metabolic-bye-based MTT assay, respectively. The data shown are means±SD of three independent experiments. (B) Cells grown under the same conditions as (A) were harvested and nuclei stained with DAPI solution were then observed under a fluorescent microscope using a blue filter. ×400.

한 영향을 미치는지를 western blot으로 관찰하였다. Fig.

1에서 나타난 바와 같이 total ERK, JNK 및 p38-MAPK의 경우에는 아무런 변화가 관찰되지 않았지만 phospho- ERK 및 phospho-JNK의 경우에는 처리시간 증가에 따라 서 발현양이 증가되는 것으로 나타났다. 특히 phospho- ERK의 경우에는 J-7 처리 4시간까지는 발현양의 변화가 거의 나타나지 않았지만 8시간부터 발현양의 증가가 나 타나기 시작하여 16시간 처리군에서는 현저하게 증가하 는 것을 관찰할 수 있었으며, phospho-JNK의 경우에는 4 시간부터 발현양의 증가가 나타나기 시작하여 8시간 처 리군에서는 강하게 발현되는 것으로 나타났다. 하지만 phospho-p38-MAPK의 경우에는 J-7 처리에 의한 발현양 의 증가는 거의 나타나지 않은 반면에 16시간부터 현저 한 발현 감소가 관찰되었다. 이상의 결과를 살펴볼 때 J-7이 Hep3B 인체간암세포에서 유발하는 여러 가지 현 상에 있어서 ERK 및 JNK pathway가 중요한 역할을 한다 는 것을 알 수 있었다.

2. ERK 및 JNK pathway가 J-7에 의한 증식억제 및 apoptosis 유발에 미치는 영향

이전 연구 결과에 따르면 J-7이 Hep3B 인체간암세포

에서 증식억제를 유발하였고, 이러한 증식억제 현상은 여러 가지 유전자들의 발현 변화를 통한 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있다는 것이 조사되었다.

따라서 J-7에 의한 증식억제 및 apoptosis 유발에 있어서 ERK 및 JNK pathway가 어떠한 영향을 미치는지를 조사한 결과는 Fig.

2에 나타낸 바와 같다. 먼저 Fig. 2A에서와 같이 J-7 단독

처리군의 경우에는 약 50%의 증식 억제 현상이 나타난

반면에 ERK inhibitor인 PD98059 및 JNK inhibitor인

SP600125를 각각 1시간 선처리하여 ERK 및 JNK pathway

를 억제하였을 경우 증식 억제 정도가 약 73.5% 및

Fig. 3. Roles of ERK and JNK pathway on the J-7-induced modulation of Bcl-2 family proteins in Hep3B human hepato- carcinoma cells. The cells grown under the same conditions as Fig. 2 were lysed and then equal amounts of cell lysates (50 μg) were separated on SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were probed with the indicated antibodies and the proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.

Fig. 4. Roles of ERK and JNK pathway on the J-7-induced change of DR5 and IAP family in Hep3B human hepato- carcinoma cells. Cells were pretreated with PD98059 (50 μM) and SP600125 (10 μM) for 1 h before treatment with 50 μM of J-7 (50 μM) for 24 h. The cells were lysed and then equal amounts of cell lysates (50 μg) were separated on SDS- polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose mem- branes. The membranes were probed with the indicated antibodies and the proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.

71.5%로 현저하게 증가되는 것으로 나타났다. 이러한 증 식 억제의 증가 현상이 apoptosis 유발과 어떠한 관계가 있는지를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 통해 핵의 형태 변화를 조사한 결과, Fig. 2B에 나타난 바와 같이 J-7 처 리에 의하여 유발된 염색질 응축현상이 PD98059 및 SP600125 선처리에 의하여 더욱 더 증가하는 것으로 조 사되었다. 이상의 결과로 ERK 및 JNK pathway에 의하여 증가된 증식 억제현상이 apoptosis 유발의 증가와 밀접한 연관이 있다는 것을 알 수 있었다.

3. ERK 및 JNK pathway가 Bcl-2 family의 발현에 미 치는 영향

Mitochondria 외막에 존재하고 있는 Bcl-2 family protein 은 Bcl-2 및 Bcl-XL 등과 같은 세포의 생존에 관여하는 anti-apoptotic protein과 Bax, Bad 및 Bid 등과 같은 세포의 죽음에 관여하는 pro-apoptotic protein으로 구성되어 있으 며, anti-apoptotic protein과 pro-apoptotic protein 사이에 균 형이 깨어지게 되면 mitochondria 기능 이상을 통한 apop- tosis를 유발하는 것으로 알려져 있다.

일반적으로 Bcl-2 family protein은 여러 가지 외부 자극에 의하여 직접 적으로 intrinsic pathway를 통한 apoptosis 유발에 관여하는 것으로 알려져 있지만 Bid의 경우에는 extrinsic pathway에

의하여 활성화된 caspase-8이 Bid의 단편화를 유발하게 되고, 이렇게 형성된 truncated Bid (tBid)는 intrinsic path- way를 통한 apoptosis에 관여한다.

본 연구에서는 J-7에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 Bcl-2 family protein들 의 발현 변화에 ERK 및 JNK pathway가 어떠한 영향을 미치는 지를 확인하였다. Fig. 3에서 나타난 바와 같이 J-7 처리에 의하여 Bcl-2 및 Bid의 발현이 감소되는 것으 로 나타났으며, Bid의 발현 감소는 PD98059 및 SP600125 처리에 의하여 더욱 강하게 나타나는 것으로 조사되었 다. 하지만 Bcl-2의 경우에는 PD98059 및 SP600125 처리 에 따른 발현 감소 현상이 증가하지 않는 것으로 나타났 다. 이상의 결과를 살펴볼 때 ERK 및 JNK pathway에 의 하여 유발되는 apoptosis 증가는 extrinsic pathway의 활성 화와 밀접한 연관이 있는 것으로 생각된다.

4. ERK 및 JNK pathway가 DR5 및 IAP family의 발현 에 미치는 영향

Apoptosis 과정 중 extrinsic pathway에 있어서 중요한 역

할을 하는 DR5는 death receptor ligand인 TRAIL과 결합함

으로서 활성화된 caspase-8에 의하여 하위단계에 있는

caspase-3의 활성화에 직접적으로 관여하거나 Bid의 단편

화를 통한 tBid의 형성을 유발시킴으로서 intrinsic path-

way를 통한 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있

다.

한편 IAP family는 caspases의 ubiquitination 및 deg-

radation을 조절하는 RING finger domain과 protein-protein

Fig. 5. Roles of ERK and JNK pathway on the J-7-induced change of caspases and PARP in Hep3B human hepato- carcinoma cells. The cells were lysed and then equal amounts of cell lysates (50 μg) were separated on SDS-polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The mem- branes were probed with the indicated antibodies and the proteins were visualized using an ECL detection system. Actin was used as an internal control.

interaction 기능을 하는 caspase-recruitment domain (CARD) 을 가지고 있으며 caspases-3, -7 및 -9과 직접적으로 결합 하여 caspases의 활성을 억제함으로서 apoptosis를 억제하 는 것으로 알려져 있다. 따라서 IAP family의 발현 억제는 caspases의 활성을 억제하지 못함으로서 apoptosis가 유발 되는데 중요한 역할을 하게 된다.

본 연구에서는 ERK 및 JNK pathway 억제에 의한 apoptosis 증가 현상에 있어서 death receptor군에 속하는 DR5와 IAP family가 관 여하는지를 조사하였다. Fig. 4에서 나타난 바와 같이 PD98059 및 SP600125를 처리하였을 경우 J-7에 의하여 증가된 DR5의 발현이 현저하게 증가되는 것으로 나타났 으며, IAP family 중 XIAP 및 cIAP-1의 발현은 현저하게 J-7 단독 처리군에 비하여 현저하게 감소되는 것으로 조 사되었다. 이상의 결과로서 ERK 및 JNK pathway는 DR5 발현의 조절을 통하여 extrinsic pathway의 더욱 활성화시 킴으로서 J-7에 의한 apoptosis를 증가시킬 뿐만 아니라 IAP family의 발현을 현저하게 감소시킴으로서 caspases 활성화 억제 정도의 증가를 통한 apoptosis 유발의 증가에 도 관여하는 것으로 생각된다.

5. ERK 및 JNK pathway가 caspases 및 PARP의 발현 에 미치는 영향

Cystein-containing aspartate-specific protease family인 cas- pases는 세포가 정상적으로 성장 및 생존할 때 핵과 mi- tochondria의 외막에 불활성 상태인 proenzyme 형태로 존

재하고 있지만 여러 가지 자극에 의하여 활성화되어 표 적 단백질들의 분해를 통한 apoptosis를 유발하는 것으로 알려져 있다.

이러한 caspases는 extrinsic pathway에 관여 하는 caspase-8 및 intrinsic pathway에 관여하는 caspase-9 등 과 같은 initiator caspases와 하위 단계에서 직접적으로 apoptosis에 관여하는 caspase-3와 같은 effector caspases로 구분되어 지는데 다양한 자극에 의하여 활성화된 ini- tiator caspases가 effector caspases를 활성화시킴으로서 세포 의 성장 및 생존에 중요한 역할을 하는 PARP 및 β-cate- nin 등과 같은 여러 종류의 기질 단백질들은 분해함으로 서 apoptosis를 유발하므로 apoptosis 유발에 있어서 cas- pases의 활성화가 매우 중요하다고 생각되어 진다.

따 라서 본 연구에서는 J-7에 의하여 유발되는 apoptosis에 있어서 여러 종류의 caspases 중 apoptosis 유발에 직접적 으로 관여하는 것으로 알려진 caspase-3, -8 및 -9의 발현 변화와 ERK 및 JNK와의 관계를 조사하였다. Fig. 5에서 나타난 바와 같이 J-7 처리에 의하여 caspase-3, -8 및 -9의 발현 감소와 PARP의 단편화 현상이 관찰되었으며, 이러 한 변화는 PD98059 및 SP600125 처리에 의하여 증가되 는 것으로 나타났다. 이상의 결과를 살펴볼 때 J-7 처리 에 의한 apoptosis 유발에 있어서 ERK 및 JNK pathway를 억제함으로서 나타나는 상승효과는 caspases의 활성화 및 기질단백질의 단편화를 더욱 강하게 유발함으로서 나타 나는 것으로 생각된다.

결 론

이전 연구 결과에 따르면 synthetic methyl jasmonate de- rivative인 J-7이 인체 간암세포인 Hep3B 세포에서 ex- trinsic 및 intrinsic pathway를 경유하여 apoptosis를 유발하 는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서는 이러한 apop- tosis 유발에 있어서 MAPK signal pathway가 어떠한 영향 을 미치는지를 확인하였다. 먼저 인체 간암세포인 Hep3B 세포에서 J-7 처리에 의한 MAPKs의 발현 변화를 조사한 결과, phospho-ERK 및 phospho-JNK의 발현이 현 저하게 증가하였다. 또한 ERK 및 JNK pathway를 억제하 였을 경우, J-7에 의한 증식 억제 효과가 증가하였으며, 이러한 증식 억제 효과는 apoptosis 유발의 증가와 밀접한 연관이 있다는 것을 알 수 있었다. ERK 및 JNK pathway 의 억제를 통한 J-7의 apoptosis 유발 상승 효과에 있어서 어떠한 유전자들이 관여하는지를 확인한 결과, Bcl-2 family 중 Bid의 발현 감소, DR5의 발현 증가 및 IAP fam- ily의 발현 감소 현상이 더욱 증가하는 것으로 나타났다.

또한 J-7 처리에 의해 유발되는 caspase-3, -8 및 -9의 발현

감소와 PARP의 단편화 현상이 ERK 및 JNK pathway의 억제에 의하여 더욱 강하게 나타나는 것으로 조사되었 다. 이상의 결과를 살펴볼 때 J-7 단독 처리군과 비교하 여 ERK 및 JNK pathway의 억제를 하였을 경우 나타나는 apoptosis 유발 상승효과는 DR5의 발현증가를 통한 ex- trinsic pathway의 활성을 더욱 증가시킴으로서 유발되는 것으로 생각된다. 본 연구 결과는 J-7의 항암기전에 대한 생화학적 해석 및 이를 활용한 향후 지속적인 연구를 위 한 귀중한 자료가 될 것으로 사료된다.

감사의 글

본 논문은 2011년도 동의대학교 교내연구비(2011AA122) 지원으로 이루어졌음.

참 고 문 헌

1) Lau WY, Lai EC. Hepatocellular carcinoma: current manage- ment and recent advances. Hepatobiliary Pancreat Dis Int 7, 237-257, 2008.

2) Llovet JM, Bruix J. Novel advancements in the management of hepatocellular carcinoma in 2008. J Hepatol 48(1 Suppl), S20-37, 2008.

3) Marotta F, Vangieri B, Cecere A, Gattoni A. The pathogenesis of hepatocellular carcinoma is multifactorial event. Novel immunological treatment in prospect. Clin Ter 155, 187-199, 2004.

4) Olsen SK, Brown RS, Siegel AB. Hepatocellular carcinoma:

review of current treatment with a focus on targeted molecular therapies. Therap Adv Gastroenterol 3, 55-66, 2010.

5) Okada H, Mak TW. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumour cells. Nat Rev Cancer 4, 592-603, 2004.

6) Evans VG. Multiple pathways to apoptosis. Cell Biol Int 17, 461-476, 1993.

7) Fulda S, Debatin KM. Extrinsic versus intrinsic apoptosis pathways in anticancer chemotherapy. Oncogene 25, 4798- 4811, 2006.

8) Gupta S. Molecular signaling in death receptor and mitochon- drial pathways of apoptosis (Review). Int J Oncol 22, 15-20, 2003.

9) Sigoillot FD, Evans DR, Guy HI. Growth-dependent regula- tion of mammalian pyrimidine biosynthesis by the protein kinase A and MAPK signaling cascades. J Biol Chem 277, 15745-15751, 2002.

10) Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signaling cascades. Nature 410, 37-40, 2001.

11) Waskiewicz AJ, Cooper JA. Mitogen and stress response pathways: MAP kinase cascades and phosphatase regulation in mammals and yeast. Curr Opin Cell Biol 7, 798-805, 1995.

12) Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, Davis RJ, Greenberg ME.

Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis. Science 270, 1326-1331, 1995.

13) Park C, Jin CY, Kim GY, Choi IW, Kwon TK, Choi BT, Lee SJ, Lee WH, Choi YH. Induction of apoptosis by esculetin in human leukemia U937 cells through activation of JNK and ERK. Toxicol Appl Pharmacol 227, 219-228, 2008.

14) Dhillon AS, Hagan S, Rath O, Kolch W. MAP kinase signall- ing pathways in cancer. Oncogene 26, 3279-3290, 2007.

15) Mittler R, Lam E. Sacrifice in the face of foes: pathogen- induced programmed cell death in plants. Trends Microbiol 4, 10-15, 1996.

16) Weber H. Fatty acid-derived signals in plants. Trends Plant Sci 7, 217-224, 2002.

17) Dangl JL, Dietrich RA, Richberg MH. Death don't have no mercy: cell death programs in plant-icrobe interactions. Plant Cell 8, 1793-1807, 1996.

18) Kniazhanski T, Jackman A, Heyfets A, Gonen P, Flescher E, Sherman L. Methyl jasmonate induces cell death with mixed characteristics of apoptosis and necrosis in cervical cancer cells.

Cancer Res 271, 34-36, 2008.

19) Rotem R, Fingrut O, Moskovitz J, Flescher E. The anticancer agent methyl jasmonate induces activation of stress-regulated c-Jun N-terminal kinase and p38 protein kinase in human lymphoid cells. Leukemia 17, 2230-2234, 2003.

20) Fingrut O, Flescher E. Plant stress hormones suppress the proliferation and induce apoptosis in human cancer cells.

Leukemia 16, 608-616, 2002.

21) Ofer K, Gold D, Flescher E, Methyl jasmonate induces cell cycle block and cell death in the amitochondriate parasite Trichomonas vaginalis. Int J Parasitol 38, 959-968, 2008.

22) Reischer D, Heyfets A, Shimony S, Nordenberg J, Kashman Y, Flescher E. Effects of natural and novel synthetic jasmo- nates in experimental metastatic melanoma. Br J Pharmacol 150, 738-749, 2007.

23) Park C, Jin CY, Kim GY, Cheong J, Jung JH, Yoo YH, Choi YH. A methyl jasmonate derivative, J-7, induces apoptosis in human hepatocarcinoma Hep3B cells in vitro. Toxicol In Vitro 24, 1920-1926, 2010.

24) Burlacu A. Regulation of apoptosis by Bcl-2 family proteins.

J Cell Mol Med 7, 249-257, 2003.

25) Harris MH, Thompson CB. The role of the Bcl-2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeability.

Cell Death Differ 7, 1182-1191, 2000.

26) Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 94, 481-490, 1998.

27) Kimberley FC, Screaton GR. Following a TRAIL: update on a ligand and its five receptors. Cell Res 14, 359-372, 2004.

28) Wang S, El-Deiry WS. TRAIL and apoptosis induction by TNF-family death receptors. Oncogene 22, 8628-8633, 2003.

29) Deveraux QL, Reed JC. IAP family proteins--suppressors of

apoptosis. Genes Dev 13, 239-252, 1999.

30) Roy N, Deveraux QL, Takahashi R, Salvesen GS, Reed JC.

The c-IAP-1 and c-IAP-2 proteins are direct inhibitors of specific caspases. EMBO J 16, 6914-6925, 1997.

31) Allen RT, Cluck MW, Agrawal DK. Mechanisms controlling cellular suicide: role of Bcl-2 and caspases. Cell Mol Life Sci 54, 427-445, 1998.

32) Chai F, Truong-Tran AQ, Ho LH, Zalewski PD. Regulation of caspase activation and apoptosis by cellular zinc fluxes and zinc deprivation: a review. Immunol Cell Biol 77, 272-278, 1999.

33) Stennicke HR, Salvesen GS. Properties of the caspases. Biochim Biophys Acta 1387, 17-31, 1998.