Flavonoid and Phenol Contents and Antioxidant Effect of Wine By-product Extracts

Flavonoid and Phenol Contents and Antioxidant Effect of Wine By-product Extracts

Jae Yeol Baek and Sun-Young Lim*

Division of Marine Bioscience, Korea Maritime and Ocean University, Busan 49112, Korea Received April 7, 2016 /Revised June 24, 2016 /Accepted July 5, 2016

We investigated the flavonoid and phenol contents and antioxidant effect of wine by-product extract.

Antioxidant effects were measured with 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) and 2.2'-azino-bis(3-eth- ylbenothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical cation (ABTS+) assays. Cellular reactive oxygen species (ROS) were measured with the dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA) assay. The flavonoid and phenol contents of the methanol (MeOH) extract were greater than those of the ace- tone+methylene chloride (A+M) extract. Among fractions, the 85% aqueous methanol (85% aq. MeOH) fraction contained the highest flavonoid contents, while the n-BuOH fraction had more phenol contents. In the DPPH and ABTS assays, the MeOH extract showed a scavenging effect greater than that of the A+M extract (p<0.05). The n-BuOH fraction (0.5 mg/ml concentrations) showed scavenging effects of 72% and 92%, respectively, in the DPPH and ABTS assays (p<0.05). However, the 85% aq.

MeOH fraction showed a 90% scavenging effect in the DPPH assay only. In 120 min ROS production assay, all tested fractions dose-dependently decreased cellular ROS production induced by H

O

in comparison with that produced by exposure to the extract-free control. The MeOH extract showed a higher sinhibitory effect on cellular ROS producing than that of the A+M extract at all concentrations tested. Treatment with the n-BuOH fraction (0.1 mg/ml concentrations) inhibited cellular ROS pro- duction by 60%. These results indicate that the n-BuOH fraction of wine by-product extract inhibited cellular oxidation and may contain valuable bioactive compounds such as flavonoids and phenols.

Key words :

Antioxidant, flavonoids, phenols, reactive oxygen species, wine by-product

*Corresponding author

*Tel : +82-51-410-4757, Fax : +82-51-404-4750

*E-mail : [email protected]

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Journal of Life Science 2016 Vol. 26. No. 8. 948~954 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/JLS.2016.26.8.948

서 론

인간의 노화와 질병의 주요 원인으로 알려진 자유라디칼 (free radical)은 생체 내에서 산화되는 생리기능에 스트레스 를 가하는 현상인 산화스트레스(oxidative stress)를 유발하는 것으로 알려져 있으며[23], 이러한 자유라디칼은 세포막 손상, 단백질 분해, 지질 산화, DNA 변성 등을 초래하여 각종 성인 병을 유발한다[10]. 최근 건강에 대한 관심이 높아짐에 따라 이러한 노화억제와 성인병 예방을 위한 항산화물질에 대한 관심도 함께 높아져 자유라디칼을 방어하는 항산화물질에 대 한 연구가 활발히 이루어지고 있다[13, 27]. 현재 산화스트레 스를 막기 위해 천연항산화제 및 합성항산화제가 사용되고 있는데, 이러한 항산화제는 산소를 제거하거나 흡수하는 것 이 아니라 자유기와 반응함으로써 특정 비타민류와 필수 아 미노산 등의 손실을 최소화 하거나, 유지 제품의 산패를 지연

또는 방지하는 목적으로 사용된다. 합성항산화제로는 BHA (butylated hydroxyanisole), BHT (butylated hydroxytol- uene)등이 있으며, 특히 BHT는 여러 연구 결과 실험동물의 간에서 마이크로솜 효소 활성(microsomal enzyme activity) 을 증가시킨다는 것이 알려지면서, 이들 합성항산화제의 안 전성에 대한 논란이 제기되어 현재는 그 사용량이 법적으로 규제되어 있다[1, 4, 14]. 그에 따라 기능성과 안전성면에서 두 각을 나타내는 식물유래 천연항산화제의 연구가 활발히 진행 되고 있는 추세이다[16, 24, 28].

과일은 여러 식물성 자원 중 가장 항산화능력이 뛰어난 천 연자원으로 여러 가지 생리활성 작용을 나타내는 물질로 밝 혀진 페놀성 화합물을 함유하고 있으며[21], 페놀성 화합물에 존재하는 phenolic hydroxyl (OH)기는 단백질 등과 결합하는 성질을 가지고 항산화, 항암 및 항균 효과 등의 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다[7, 10]. 특히, 포도 열매에는 안토 시아닌(anthocyanin), 프로시아니딘(procyanidin), 카테킨 (catechin), 쿼세틴(quercetin), 레스베라트롤(resveratrol) 등 우리 몸에 이로운 폴리페놀 성분이 풍부하게 존재하기 때문 에 국내외에서 성분분석, 항산화, 항암, 항균 활성을 포함한 다양한 생물학적 효능 연구가 이루어지고 있다[2, 17, 29, 31].

이러한 다양한 생리활성을 가진 포도는 세계 과일 생산량 중

약 30%를 차지하며[20], 그 중 약 80%가 포도주 제조에 사용

되고, 이로 인해 약 천만 톤의 포도주 부산물(포도 과피, 씨, 과육, 줄기 포함)이 짧은 수확기 동안 발생한다[24]. 한국의 경우, 2013년 생산량은 약 26만 톤, 2012년 생산량은 27만 8천 톤으로 그 중 약 7천 톤이 가공되었으며, 이에 따라 매년 수천 톤의 포도주 부산물이 발생하고 있는 실정이다[25]. 가공과정 중에 나오는 포도주 부산물은 폴리페놀류, 안토시아닌, 레스 베라트롤 등의 생리활성물질을 높은 수준으로 함유하고 있는 것으로 보고되고 있으며[9, 11, 22], 플라보노이드, 식이섬유, 비타민 A 및 비타민 E 등도 함유하고 있다고 보고되었다[33].

이에 따라 본 연구에서는 포도주 가공 중에 발생하는 포도 주 부산물의 항산화활성 검토를 위해 포도주 부산물을 유기 용매로 추출 및 분획하여 총 플라보노이드 및 페놀 함량을 측정하고 포도주 부산물의 항산화 효과를 알아보고자 한다.

재료 및 방법

재료

본 실험에 사용된 포도주 부산물은 까브스토리(경상북도 영천시)로부터 제공받아 사용하였다. 포도주 부산물을 자연 건조시킨 후, 실험 사용 전까지 -70℃의 deep freezer (NF-400 SF, NIHON FREEZER, Japan)에 냉동 보관하였다.

추출 및 분획

포도주 부산물의 유기용매 추출을 위하여 acetone:methyl- ene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 포도주 부산물이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액은 40℃ 수욕 상에서 rotary vacuum evaporator (N-1000, EYELA, Japan)로 농축하여 acetone/

methylene chloride (A+M) 추출물을 얻었다. A+M 용매로 추 출되지 않은 성분을 methanol (MeOH)로 추출하고자 남은 잔사에 A+M과 동량의 MeOH을 부어 위와 동일한 방법으로 2회 반복한 후 농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 두 용매로 부터 최대로 수득한 추출물을 혼합하여 다시 용매 극성에 따 라 순차적으로 분획하여 n-Hexane, 85% aq. MeOH, n-buta- nol (n-BuOH), water 분획물을 얻었다. 실험에는 각각의 추출 물을 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 세포배지로 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.

총 플라보노이드 함량 측정

시료 중 총 플라보노이드(flavonoid) 함량은 Davis 등[3]의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 포도주 부산물 용 매별 추출물 및 분획물 1 mg을 MeOH 1 ml에 녹여 시험관에 취하고 10 ml의 diethylene glycol을 가하여 잘 혼합한 후 1N NaOH 1 ml 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응 시킨다. 반 응이 끝난 후 UV-visible spectrometer (Helios beta, Thermo electron corporation, USA)를 사용하여 420 nm에서 흡광도

를 측정하였다. 이때 표준물질은 rutin (Sigma Co., USA)을 사용하여 표준곡선에 의해서 총 플라보노이드 함량을 측정하 였다.

총 페놀 함량 측정

총 페놀(phenol) 화합물 함량은 Folin-Denies법[28]을 응용 하여 측정하였다. 추출물 및 분획물 1 mg을 MeOH 1 ml에 녹이고, 10배 희석한 희석액 2 ml에 2배 희석한 Folin-Ciocal- teu's phenol reagent 2 ml을 첨가하여 혼합한 다음 3분 동안 방치한 후 10% Na

CO

용액 2 ml을 넣고 1시간 동안 반응 시킨다. 반응이 끝난 후 UV-visible spectrometer (Helios be- ta, Thermo electron corporation, USA)를 사용하여 750 nm에 서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질로 tannic acid를 사용 하였으며 시료와 동일한 방법으로 분석 후 얻은 표준곡선으 로부터 총 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.

1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성 시료의 DPPH 라디칼 소거활성[5] 측정을 위해 먼저 각 추 출물 및 분획물을 MeOH로 농도 별로 희석하여 사용하였다.

DPPH 2 mg을 ethanol (EtOH) 15 ml에 녹여 DPPH 원액을 조제하였다. DPPH 용액 1.2 ml에 DMSO 0.5 ml와 EtOH를 3 ml를 혼합하여 DPPH 희석액을 사용하였다. DPPH 희석액 의 흡광도가 0.94∼0.97이 되도록 하여 실험에 사용하였다. 시 료 0.1 ml와 DPPH 희석액 0.9 ml를 섞은 후 10분 후 UV-visi- ble spectrophotometer (Helios beta, Thermo electron corpo- ration, USA)로 518 nm에서 측정하였다. 이때 대조군은 천연 항산화제인 L-ascorbic acid와 합성항산화제인 2,6-Ditertbutyl- 4-methylpheno (BHT)를 사용하였다. 포도주 부산물의 DPPH 라디칼 소거활성은 다음의 식에 따라 계산하였다.

EDA (electron donating ability) (%)=

대조군 흡광도-실험군 흡광도

× 100 대조군의 흡광도

2.2'-azino-bis(3-ethylbenothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt radical cation (ABTS+) 라디 칼 소거활성

포도주 부산물에 대한 ABTS+ 라디칼 소거활성은 Re등의

방법[27]으로 측정하였다. 7 mM의 ABTS+와 2.45 mM의 po-

tassuim persulfate를 첨가하여 radical생성을 위해 암소에서

16시간 방치한 후, 734 nm에서 흡광도가 0.68∼0.72가 되도록

EtOH로 희석하였다. ABTS+ 희석액 0.98 ml와 추출물 및 분

획물 0.02 ml를 혼합하여 암소에서 10분간 방치 후 UV-visi-

ble spectrophotometer 732 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대

조군으로는 천연항산화제인 L-ascorbic acid와 합성항산화제

인 BHT를 사용하였다. 포도주 부산물의 ABTS+ 라디칼 소거

활성은 다음의 식에 따라 계산하였다.

Table 1. Contents of total flavonoid and phenol in solvent ex- tracts and fractions from wine by-product^*

Samples

Total flavonoid contents

(mg/g)

Total phenol contents

(mg/g) A+M extract

MeOH extract n-Hexane fraction 85% aq. MeOH fraction n-BuOH fraction Water fraction

26.4±0.77^e 56.1±1.87^c 20.2±0.12^f 105.1±0.93^a 65.3±0.21^b 34.4±0.12^d

0.4±0.00^e 4.4±0.04^c 0.4±0.01^f 3.6±0.01^a 5.5±0.04^b 2.8±0.01^d

*Values are expressed as mean±SD. Values in the same column with different letters are significantly different at p<0.05 using Turkey’s test.

EDA (electron donating ability) (%) =

대조군 흡광도-실험군 흡광도 대조군의 흡광도 ×100

세포 배양

한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유종세포(HT- 1080)를 분양받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였 다. HT-1080 세포는 100 units/ml의 penicillin-streptomycin (Gibco, USA)과 10% Fetal bovine serum(FBS, Corning cell- gro, USA)가 함유된 RPMI 1640 (Lonza, USA)을 사용하여 37

℃, 5% CO

incubator (MCO-15AC, SANYO Electric Bio- medical Co., Ltd., Japan)에서 배양하면서 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 phos- phate buffered saline (PBS)으로 세척한 뒤 0.05% trypsin- 0.02% EDTA (Gibco, USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심 분리 한 후 집적된 세포에 배지를 넣고 피펫으로 세포가 골고 루 분산되도록 잘 혼합하여 cell culture flask에 10 ml씩 일정 한 수로 분할하여 주입하고, 6~7일마다 계대 배양하면서 실험 에 사용하였다.

세포 내 활성산소종(reactive oxygen species) 측정 세포 내 활성산소종은 DCFH-DA (2‘,7’-dichlorodihydro- fluorescin diacetate) assay [19]로 측정하였다. DCFH-DA (Sigma, USA)는 세포 내 활성산소종과 반응하여 형광물질 (dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는 형광을 측정함으로써 세포 내의 활 성산소종을 측정할 수 있다. 세포를 96 well cell culture plate 에 분주한 후 24시간 배양하고, PBS로 씻은 후 20 μM DCFH-DA을 각 well에 분주하여 37℃, 5% CO

incubator에 서 20분간 pre-incubation하였다. 각 well에 시료를 처리하여 37℃, 5% CO

incubator에서 1시간 배양한 후, DCFH-DA을 없애고 세포는 다시 PBS로 씻은 후 500 μM H

O

를 처리하여 시간 별로 DCF fluorescence를 excitation 488 nm, emission 530 nm에서 microplate reader (VICTOR3, Perkin Elmer, USA)로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 μM H

O

를 처리를 하 고, blank군은 500 μM H

O

대신 PBS를 처리하여 측정하였 다.

통계분석

실험결과는 Mean±SEM (Standard Error of Mean)으로 나 타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻 은 실험 자료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성을 검증하였다.

결과 및 고찰

포도주 부산물 추출물 및 분획물의 총 플라보노이드 및 페 놀 함량

포도주 부산물의 용매별 추출물 및 분획물들의 총 플라보 노이드 및 총 페놀 함량은 Table 1에 나타내었다. 포도주 부산 물 A+M 및 MeOH 추출물들의 총 플라보노이드 함량은 각각 26.4±0.77 및 56.1±1.87 mg/g으로 MeOH 추출물의 총 플라보 노이드 함량이 높았다. 분획물들 중에서는 85% aq. MeOH 분 획물이 105.1±0.93 mg/g으로 가장 높은 플라보노이드를 함 유하는 것으로 나타났으며, 다음으로 n-BuOH, Water 및 n- Hexane 분획물 순이었다. 각 용매별 추출물 및 분획물의 총 페놀 함량 또한 MeOH 추출물(4.35±0.04 mg/g)이 A+M 추출 물(0.38±0.004 mg/g)보다 높은 페놀을 함유하는 것으로 나타 났으며 분획물들 중에서 n-BuOH 분획물이 5.47±0.04 mg/g 으로 가장 높게 함유하는 것으로 나타났다. 이에 따라 총 플라 보노이드 및 페놀 함량은 MeOH 추출물, 85% aq. MeOH 및

[18]은 포도주 부산물 추출물은 malvidin, catechin, epicate- chin 및 gallic acid를 각각 34.86, 69.53, 50.9 및 18.64 mg/kg 함유하는 것으로 보고하였다. Tournour 등[30]은 포루투갈산 포도주 부산물의 총 페놀함량은 69.3 mg/ GAE g 이었고 주 요 페놀화합물은 synerigni acid와 (+)-catechin 이었다고 보 고하였다. Hwang 등[12]은 포도씨의 품종에 따른 총 페놀 함 량과 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)의 함량을 측정한 결과 총 페놀 함량은 16.71∼28.60 mg/100 g, 프로안토시아니 딘 함량은 18.36∼55.30 mg/100 g을 나타내었다고 보고하였 다.

포도주 부산물 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성

포도주 부산물 추출물 및 분획물의 DPPH 라디칼 소거활

성은 활성산소를 제거할 수 있는 능력인 EDA (electron do-

nating ability, %)로 Table 2에 나타내었다. 각 용매별 추출물

Table 2. DPPH radical scavenging effect of solvent extracts and fractions from wine by-product^*

Sample Concentration (mg/ml)

0.05 0.1 0.25 0.5

A+M extract MeOH extract n-Hexane fraction 85% aq. MeOH fraction n-BuOH fraction Water fraction L-ascorbic acid BHT

12.4±0.00^c 26.5±0.01^b 17.0±0.01^bc 22.3±0.01^c 26.1±0.01^b 15.5±0.02^c 90.8±0.00^a 25.5±0.01^b

16.4±0.02^e 42.2±0.02^bc 15.6±0.00^e 29.3±0.01^d 36.4±0.02^bc 22.2±0.01^e 91.4±0.00^a 37.7±0.00^b

18.5±0.01^e 58.4±0.01^bc 16.5±0.01^e 42.5±0.01^d 63.2±0.01^b 41.2±0.01^d 92.0±0.00^a 58.4±0.02^bc

19.2±0.01^d 73.7±0.01^b 17.9±0.01^d 47.8±0.00^c 71.8±0.01^b 49.1±0.02^c 92.3±0.00^a 70.2±0.00^b

*Values are expressed as mean±SD. Values in the same column with different letters are significantly different at p<0.05 using Turkey’s test.

Table 3. ABTS radical scavenging effect of solvent extracts and fractions from wine by product^*

Sample Concentration (mg/ml)

0.05 0.1 0.25 0.5

A+M extract MeOH extract n-Hexane fraction 85% aq. MeOH fraction n-BuOH fraction Water fraction L-ascorbic acid BHT

9.44±0.00^f 69.6±0.01^c 7.34±0.00^f 60.0±0.02^d 90.4±0.00^b 42.5±0.02^e 99.7±0.01^a 57.5±0.00^d

14.0±0.00^f 91.8±0.00^b 10.2±0.00^g 87.7±001^c 92.9±0.00^b 70.2±0.00^e 99.9±0.00^a 80.7±0.00^d

29.6±0.01^d 92.1±0.00^b 21.1±0.01^e 91.0±0.00^b 92.4±0.00^b 72.9±0.01^c 99.9±0.01^a 92.4±0.00^b

46.6±0.01^e 91.4±0.00^bc 30.7±0.00^f 90.3±0.00^c 92.4±0.00^b 85.3±0.01^d 99.7±0.00^a 92.3±0.01^b

*Values are expressed as mean±SD. Values in the same column with different letters are significantly different at p<0.05 using Turkey’s test.

및 분획물을 각각 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도로 대조군 (L-ascorbic acid, BHT)과 비교하였다. 먼저 추출물들과 비교 했을 때 MeOH 추출물은 A+M 추출물과 비교했을 때 활성산 소 소거능이 우수하였다. 이는 앞서 MeOH 추출물의 높은 총 플라보노이드 및 총 페놀 함량과 연관있는 것으로 여겨진다.

분획물들 중 n-BuOH 분획물은 실험한 모든 농도에서 대조군 인 BHT보다 EDA값이 높게 나타났으며, 0.5 mg/ml의 농도 에서 71.8%의 소거능을 나타냄으로써 합성항산화제인 BHT (70.2%)보다 높은 라디칼 소거 효과를 나타내었다. 이 또한

연관되어 있다고 여겨진다. Lazze 등[18]도 포도주 부산물 추 출물의 항산화력을 DPPH법으로 측정한 결과 높은 라디칼 소 거능을 보였다고 보고하였다. Tournour 등[30]은 포도주 부 산물의 총 페놀함량과 항산화력은 높은 상관관계를 보였고 포도주 부산물 추출물은 oxygen radical absorbance capacity (ORAC) 실험에서 55-104%의 저해효과를 나타내었다고 보고 하였다. Park 등[26]은 국내산 포도 캠벨종의 종자 및 과피의 추출조건과 그에 따른 DPPH법에 의한 자유라디칼 소거활성 비교결과 종자의 경우, 50℃ 에탄올 추출물이 RC

=16.8 μg/

ml로, 분획물에서는 ethyl acetate 분획물이 RC

=15.4 μg/ml 로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 과피의 경우, 78℃ EtOH

추출물이 RC

=2437.5 μg/ml, 분획물에서는 n-BuOH 분획물 이 RC

=698.4 μg/ml로 가장 높은 활성을 나타내었고, 자유 라디칼 소거활성에서는 종자 에탄올 추출물이 과피 에탄올 추출물보다 145배 이상의 높은 활성을 나타내었다고 보고하 였다. Hwang 등[12]은 포도씨의 품종에 따른 총 페놀 함량과 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)의 함량을 측정하고, 항 산화 활성간의 상관성을 비교한 결과 Ferric reducing/anti- oxidant power(FRAP)와 DPPH에 의한 항산화 활성 간의 상 관성은 모두 0.92 이상이었으며, 총 페놀 함량과 DPPH 라디 칼 소거활성 사이의 상관성(0.98)이 가장 높았다고 보고하였 다. 본 연구결과에서는 총 플라보노이드 함량은 85% aq.

MeOH 분획물에서 높았으나 DPPH 소거활성은 낮았으며 오 히려 n-BuOH 분획물에 의한 소거활성이 높았으므로 DPPH 라디칼 소거활성은 총 페놀 함량과 상관성이 높은 것으로 여 겨진다.

포도주 부산물 추출물 및 분획물의 ABTS+ 라디칼 소거활성

포도주 부산물 추출물 및 분획물의 ABTS+ 라디칼 소거활

성도 DPPH 라디칼 소거활성과 마찬가지로 전자공여능인

EDA로 Table 3에 나타내었다. 각 용매별 추출물 및 분획물을

각각 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mg/ml의 농도로 대조군(L-ascorbic

Fig. 1. Inhibitory effect of acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extracts from wine by-product on levels of reactive oxygen species in HT-1080 human fibrosarcoma cells.

Fig. 2. Inhibitory effect of fractions from wine by-product extracts on levels of reactive oxygen species in HT-1080 human fi- brosarcoma cells.

acid, BHT)과 비교하였다. MeOH 추출물과 n-BuOH 분획물 은 합성항산화제인 BHT와 비교하여 0.25 및 0.5 mg/ml농도 에서 BHT 경우, 92.4 및 92.3%이며, MeOH 추출물은 92.1 및 91.4%의 소거능을 나타내었으며 n-BuOH 분획물은 각각 92.4

%로 대조군과 유사한 값을 나타내었다. 반면, 그 이하의 농도 에서는 MeOH 추출물과 n-BuOH 분획물이 BHT와 비교하여 더 높은 EDA값을 나타내었다. Jara-Palacios등[15]은 포도종 별 백포도주 부산물 추출물의 항산화력을 ABTS법으로 측정 한 결과 총 플라보노이드와 총 페놀 함량이 높은 포도종 유래 백포도주 부산물 추출물의 라디칼 소거능이 높음을 확인하였 고 보고하였다.

포도주 부산물 추출물 및 분획물의 세포 내 활성산소종 (reactive oxygen species) 생성 억제효과

포도주 부산물의 A+M 및 MeOH 추출물을 0.05 및 0.1 mg/ml의 농도로 인체 섬유육종세포(HT-1080)에 처리하여 세포 내 활성 산소종을 측정한 결과 두 추출물들 모두 측정시 간 120분이 지남에 따라 높은 세포 내 활성산소종 억제효과를 나타내었다. MeOH 추출물의 경우 A+M 추출물과 비교 하였 을 때 세포 내 활성산소종을 상대적으로 크게 억제하였으며 특히 MeOH 추출물 0.1 mg/ml 농도에서는 대조군과 비교하 여 64%의 억제효과를 나타내었다(Fig. 1). 포도주 부산물 추 출물을 n-Hexane, 85% aq. MeOH, n-BuOH, Water로 다시 추출하여 얻은 분획물을 0.05 및 0.1 mg/ml의 농도로 처리하 였을 때, 두 농도에서 모두 30분 동안 세포 내 활성산소종 억 제율이 비슷하였지만, 60분 이후에서는 n-BuOH, n-Hexane, 85% aq. MeOH, water분획물 순으로 세포 내 활성산소종 억 제율이 높게 나타났다. 이들 중 가장 높은 세포 내 활성산소종 억제효과를 나타낸 n-BuOH 분획물의 경우 60%의 억제율을 보였다(Fig. 2). Lazz 등[18]은 Caco-2세포를 이용하여 포도주 부산물 추출물에 의한 항산화 효과를 측정한 결과tert-bu- tylhydroperoxide (TBHH)로 유도된 ROS를 농도의존적으로 저해했다고 보고하였다. Wang 등[32]도 Caco-2 세포에서 포 도주 부산물 페놀추출물을 20시간 전 처리한 후 TBHH로 유 도된 ROS 생성을 측정한 결과 세포 내 ROS 과생성을 억제하 였고 환원glutathione (GSH) 생성을 증가시킴을 확인하여 포 도주부산물 페놀추출물이 산화적 스트레스로부터 세포를 보 호하였다고 보고하였다. 또한 Choi [6]등은 동물실험에서 포 도씨 공급은 혈청 지질산화물 생성을 감소시켰고 catalase 및 glutathione-S-transferase 활성을 상승시켰다고 보고하였다.

이상의 결과들로부터 포도주 부산물으로부터 얻어진 추출물

은 MeOH 추출물의 총 플라보노이드 및 페놀 함량이 높게

나타났고 이는 높은 활성산소 소거능과 연관이 있었으며 분

획물들 중에서는 n-BuOH 분획물의 항산화 효과 및 총 플라

보노이드 및 페놀 함량이 높게 나타났다. 따라서 포도 및 포도 씨와 비교했을 때 포도주 부산물의 경우 총 플라보노이드 및 총 페놀 함유량은 다소 낮게 나타났지만 항산화 효과는 지속 되는 것으로 여겨지므로 향후 포도주 부산물의 응용이 기대 되어진다.

감사의 글

본 과제(결과물)은 2013년도 정부(교육부)의 재원으로 한 국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업(NRF-2013 R1A1A2004694)의 연구결과입니다.

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Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends

초록：포도주 부산물의 총 플라보노이드와 총 페놀 함량 및 항산화 효과

백재열․임선영*

(한국해양대학교 해양생명과학부)

포도주 가공 중에 발생하는 포도주 부산물의 항산화 활성 검토를 위해 포도주 부산물을 유기용매로 추출 및 분획하여 총 플라보노이드 및 총 페놀 함량을 측정하고 포도주 부산물의 항산화 효과를 분석하였다. 포도주 부산 물의 분획 및 추출물의 총 플라보노이드의 양을 측정한 결과 MeOH 추출물은 A+M 추출물보다 높은 함량의 총 플라보노이드를 함유하는 것으로 나타났고 분획물들 중에서는 85% aq. MeOH 분획물이 105.1±0.93 mg/g으로 가장 높았으며 총 페놀 함량은 MeOH 추출물과 n-BuOH 분획물에서 높은 함량을 나타내었다. DPPH를 통한 라디 칼 소거활성능을 측정한 결과, 0.5 mg/ml 첨가농도에서 MeOH 추출물은 74%의 소거율을 나타내었으며 분획물 들 중에서는 n-BuOH 분획물이 72%의 소거활성을 나타내었다. 또한 ABTS+를 통한 라디칼 소거활성능을 측정한 결과, 0.5 mg/ml 첨가농도에서 85% aq. MeOH 및 n-BuOH 분획물들은 각각 90% 및 92% 소거활성을 나타내어 동일한 BHT 농도에서 92%인 것과 비교해 보았을 경우 합성항산화제만큼 높은 항산화능을 나타내었다. 세포내 활성 산소종 소거 효과를 나타내는 ROS 실험을 통해 0.1 mg/ml 첨가농도에서 MeOH 추출물과 n-BuOH 분획물 은 각각 64%와 60%의 소거 활성을 나타었다. 이상의 결과를 종합해 보면 포도 및 포도씨와 비교했을 때 포도주 부산물의 경우 총 플라보노이드 및 총 페놀 함유량은 다소 낮았지만 항산화 효과도 지속되는 것으로 여겨지므로 향후 포도주 부산물의 응용이 기대되어진다.

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