Uncertainty Evaluation for Determination of Methamphetamine and Amphetamine Enantiomers in Urine

DOI 10.17480/psk.2019.63.6.374

소변 시료 중 메스암페타민 및 암페타민 광학이성질체 농도 측정 결과의 불확도 평가

김진영^#·심영은·고범준

대검찰청 디엔에이·화학분석과

Uncertainty Evaluation for Determination of Methamphetamine and Amphetamine Enantiomers in Urine

Jin Young Kim^#, Yeong Eun Sim, and Beom Jun Ko

Forensic Genetics & Chemistry Division, Supreme Prosecutors’ Office

(Received October 22, 2019; Revised November 21, 2019; Accepted December 12, 2019)

Abstract The objective of this study was to assess the measurement uncertainty for determination of methamphetamine and amphetamine enantiomers in urine sample by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The deuterium-labeled compounds were prepared for use as internal standards to quantify the analytes. Urine sample (200 µl) was diluted with pure water before the solid phase extraction (SPE). The sample was extracted and purified using Oasis HLB SPE cartridge followed by chromatographic separation on a vancomycin-based chiral column (150 mm×2.1 mm, 5 µm). The mass spectrometric analysis were performed in multiple reactions monitoring (MRM) selecting three precursor/

fragment ion pairs for each analyte. The potential sources that contribute uncertainty to the final result were evaluated. The major contributing factors impacting the combined standard uncertainty were calibration curve and repeatability, while the preparation of standard solution and sample dilution were minor factors. Relative expanded uncertainty of the measured analyte concentration was within 8.5% in a forensic urine sample.

Keywords Measurement uncertainty, urine analysis, enantiomer, methamphetamine, amphetamine, LC-MS/MS

서 론(Introduction)

메스암페타민(methamphetamine, MA)은 흥분 및 환각 효과가 있는 향정신성의약품으로 국내에서 가장 많이 남용되는 마약이 다.

MA 는 다른 합성마약에 비해 상대적으로 원료물질을 쉽게 구할 수 있어 일부 유기합성 관련 지식이 있는 마약사범이 원 료물질이 함유된 약재나 의약품 등을 이용해 MA 합성을 시도 한 사례가 있기도 하다.

MA 남용 실태를 살펴보면 국내 뿐 아니라 전 세계적으로 증가 추세를 나타내고 있다. 이는 온라인 사회관계망이나 국제우편 등을 통해 유입이 수월해졌을 뿐 아 니라 다른 마약류에 비해 상대적으로 비용이 저렴하고 구입이 쉬워 대체용 마약으로도 빠르게 확산되고 있기 때문이다.

이 러한 MA 남용 증가는 국내외 여러 나라에서 심각한 사회 문제

로 자리 잡고 있다.

암페타민(amphetamine, AP)은 그 자체가 마약으로 남용될 뿐 아니라, MA를 복용했을 때 체내에서 생성되는 주요 대사체 중 하나이기도 하다.

AP 역시 국내에서 마약류로 등록되어 있고 의약품으로 판매되지 않고 있으나, 외국에서는 주의력결핍과잉 행동장애 (ADHD) 치료제로 처방되어 사용되고 있어 ‘공부 잘 하는 약’(smart drug)으로 오용되기까지 한다.

MA 와 AP는 페닐에틸아민계 화합물로 광학이성질체(enantiomer), d-와 l-MA 그리고 d-와 l-AP로 존재한다. MA의 경우 두 개의 광학이성질체 중 주로 d-MA가 남용된다고 알려져 있다.

국내 의 경우도 마찬가지로 d-MA이 주로 남용되고 있으며, 극히 드 물게 라세믹 (d,l) 형태의 MA가 남용된 사례가 보고되어 있다.

d-와 l-MA 모두 흥분 및 환각 작용을 일으키지만, l-MA는 d- MA에 비해 흥분 효과가 좀 더 오래 지속되고 환각 효과는 상 대적으로 짧은 것으로 알려져 있다.

국내와 달리, 미국 등 일부 국가에서는 l-MA가 포함된 약물이 일반의약품으로 등록되 어 코막힘완화제(nasal decongestant)로 사용되기도 한다.

MA 와 AP의 전구물질 (precursor) 중 하나인 셀레길린(selegiline)의 경우 국내외 모두 의약품으로 판매되고 있고 이 약물은 체내 대사과

#

Corresponding author

Jin Young Kim, Forensic Genetics & Chemistry Division, Supreme Prosecutors’ Office, 157 Banpo-daero, Seocho-gu, Seoul 06590, Korea

Tel: +82-2-535-4173, Fax: +82-2-535-4175

E-mail: [email protected]

정을 거쳐 l-MA과 l-AP가 생성된다.

따라서 이들 성분의 검 출결과가 MA 불법 투약에 의한 것인지 아니면 처방에 의한 것 인지 여부를 명확히 구분하기 위해서는 MA과 AP 광학이성질 체 분리분석을 통해 판별이 가능한 것으로 보인다.

소변 시료 중 MA 및 AP 광학이성질체 분리분석을 위해 기 체크로마토그래피(GC), 액체크로마토그래피(HPLC), 기체크로마 토그래피-질량분석기(GC-MS), 모세관전기영동장치(CE), 액체크 로마토그래피-질량분석기(LC-MS)를 이용한 다양한 분석법이 개 발되었다.

본 연구에서는 생체시료 중 상대적으로 높은 극 성을 띤 물질 분석에 유용하고 유도체화 과정을 포함할 필요가 없어 시료 전처리 시간 단축이 가능한 LC-MS를 이용하여 분석 법을 개발하였고, 이 방법으로 시료를 분석하였다. MA 및 AP 광학이성질체의 분리를 위해 단백질 기반 키랄 정지상이 충진 된 분리관을 사용하였다. 전처리 방법으로 소변 시료 내 기질효 과를 효과적으로 제거하고 정제된 추출물을 얻기 위해 고체상 추출법(solid phase extraction)을 사용하였다.

유효성이 확인된 분석 방법을 이용하여 정성정량 분석하는 경 우에도 표준물질, 전처리 과정, 기기분석 과정 등에 포함한 오 차에 의하여 측정결과의 차이가 발생하게 된다. 특히 마약 감정 의 경우 위음성 (false-negative) 또는 위양성(false-positive)이 발 생되지 않도록 성분을 확인하는 정성분석과 그 함량을 측정하 는 정량분석 결과의 신뢰도가 매우 중요하다.

이렇게 산출된 측정값을 합리적으로 추정한 결과의 분산 상태를 측정불확도 (measurement uncertainty)라고 하고 이는 측정결과의 신뢰도를 나타내기 위한 정량적 표현으로 사용한다.

본 연구에서는 소변 중 d-MA, l-MA, d-AP 및 l-AP의 농도 측정과정에서 산출된 결과에 대한 신뢰도를 표시하기 위해 불 확도를 계산하였다. 우선 분석 과정에서 측정결과에 영향을 줄 수 있는 요인을 찾아내어 측정 모델(measurand)을 설정하고, 측 정값으로부터 표준불확도, 상대표준불확도, 합성표준불확도 및 확장불확도를 구하였다. 또한 d-와 l- 광학이성체의 농도 측정 결과를 독립표본 t-test 및 Welch’s t-test를 통해 MA 및 AP의 두 이성질체 그룹 간 차이가 있는지 계산하였고, 그 원인이 불확도 인자에서 기인한 것인지 여부도 확인하였다.

실험 방법(Experimental Methods)

시약

표준용액 및 내부표준용액 제조에 사용된 표준물질 d-MA, l- MA, d-AP, l-AP는 1 m

용량의 갈색 앰플에 1 mg/m

농도로, 내 부표준물질 d,l-MA-d

, d,l-AP-d

, d,l-MA-d

, d,l-AP-d

1 m

용량 의 갈색 앰플에 0.1 mg/ml 농도로 제조된 제품을 모두 Cerilliant 사(Austin, TX, USA)에서 구입하였다. 분석에 사용된 용매는 HPLC-grade 메탄올로 J. T. Baker/Avantor사(Center Valley, PA, USA) 에서 구입하였으며, 증류수는 Milli-Q water purification sys- tem 을 통과한 3차 탈이온수를 사용하였다. 수소이온 농도 조절 을 위해 acetic acid (HPLC grade)와 ammonia (puriss pa plus,

≥25% in water)는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)에서 구 입하여 사용하였다. MA 및 AP 표준용액은 메탄올로 순차적으 로 희석하여 각각 100, 10, 1 µg/ml 농도로 제조하였고, 내부표 준용액은 0.5 µg/ml 농도로 희석하였으며, 사용 전까지 −20

C에 서 냉장 보관하였다.

기기 및 분석 조건

표준용액 제조를 위해 독일 Brand사의 부피플라스크(10 ml)와 독일 Eppendorf사의 100 µl 및 1000 µl 용량의 피펫(pipette)을 사 용하였다.

분석에 사용된 액체크로마토그래프는 탈기장치(vacuum degasser), 이차펌프(binary pump), 자동시료주입기 및 분리관 오븐으로 구 성된 Agilent 1260 Infinity HPLC (Santa Clara, CA, USA)를 사용하였다. 광학이성질체 분리를 위해 Supelco Astec Chirobiotic V2 column (2.1 mm×150 mm, 5 µm)을 사용하였다. 이동상은 0.02% 수산화암모늄(ammonium hydroxide), 0.1% 아세트산(acetic acid), 10% 증류수와 90% 메탄올의 혼합용매를 사용하였고, 이 동상의 유속은 150 µl/min으로 설정하여 20 min 동안 등용매 용 리(isocratic elution)하였다. 액체크로마토그래프와 연결된 질량분 석기는 전자분무이온화(electrospray ionization) 장치가 인터페이 스로 장착된 SCIEX QTrap 4500 triple-quadrupole mass spec- trometer (AB Sciex, Foster city, CA, USA)를 사용하였다. 전자 분무이온화 장치는 양이온 방식으로 설정하였고, 공급되는 가스 의 양은 nebulizing gas 50, curtain gas 20, turbo ion spray heater gas 50 이었다. 이때 turbo-gas의 온도는 600

C, 이온화 전 압은 5500 V로 설정하였다. 정량분석을 위해 MRM (multiple reaction monitoring) 방식을 사용하였으며, 모 이온(precursor ion) 의 조각화(fragmentation)를 위해 충돌기체(collision gas)로 질소 가스를 사용하였다. 분석물질(analyte)의 정량을 위해 모 이온과 모 이온으로부터 생성된 특징적인 product ion을 선정하여 하나 의 쌍으로 모니터링 하였다. 분석물질과 내부표준물질의 정량 MRM 이온쌍으로 d-와 l-MA는 m/z 150→91, d-와 l-AP은 m/z 136→91, d,l-MA-d

는 m/z 155→92 그리고 d,l-AP-d

는 m/z 141→93으로 설정하였다.

시료 전처리

피펫을 사용하여 소변 200 µl를 취한 후 증류수 2 ml와 d,l-AP- d

와 d,l-MA-d

가 포함된 0.5 µg/ml 농도의 내부표준물질 50 µl을 시험관(12 mm×100 mm)에 넣고 혼합하였다. 시료 적재(loading) 에 앞서 자동 고체상 추출 장치에 장착된 Oasis HLB (Waters, Milford, MC, USA) 카트리지(60 mg, 3 ml)를 메탄올 3 ml와 증 류수 3 ml를 순차적으로 흘려줘 카트리지를 활성화하였다. 활성 화된 카트리지에 7 ml/min 유속으로 시료를 흘려준 다음, 15 ml/

min 유속으로 탈이온수 2 ml를 흘려 세척한 후, 질소 가스로 2

분 간 건조시켰다. 용리액으로 메탄올 3 ml를 3 ml/min 유속으로

흘려주어 분석물질을 추출하였다. 이후 용리된 시료 중 5 µl를

LC-MS/MS 에 주입하여 분석하였다.

검량선 작성

정량 범위는 소변 중 검출되는 MA 및 AP의 농도를 감안하 여 설정하였고, 소변 중 농도는 25, 50, 125, 250, 500, 1000 ng/

ml가 되도록 검량선(calibration curve)을 작성하였다. 상기 전처 리 방법에 따라 시료를 처리하고 얻은 MRM 크로마토그램으로 부터 피크의 머무름 시간과 면적을 확인하였으며, 내부표준물질 의 피크 면적에 대한 분석물질의 피크 면적 비로 검량선을 작 성하였다. 이때 적용된 가중계수(w

) 는 1/x

이었다.

QC 시료의 정밀도

분석물질의 표준용액을 정량범위 내에 저·중·고 농도(75, 250, 750 ng/ml)에 해당되는 시료를 앞에서 설정한 전처리 방법 에 따라 처리하여 분석한 후, 측정된 농도 값으로부터 정밀도를 산출하였다. 정밀도 측정은 3일간 반복(n=5)하여 측정하였다.

측정 모델

소변 중 d-MA, l-MA, d-AP, l-AP 농도 측정 과정은 시료 희 석, 시료 전처리 과정 및 LC-MS/MS를 이용한 기기분석 과정으 로 이루어진다.

소변 시료 중 분석물질 농도 측정과 연관된 불확도 요소는 분 석에 사용된 ‘표준물질의 순도 및 표준용액 제조’ 시 발생하는 불확도, ‘시료 희석’ 과정에서 발생하는 불확도, 일정 기간을 두 고 반복적으로 측정이 이루어질 때 발생되는 재현성, 분석 결과 로부터 농도 계산을 하기 위해 ‘검량선’ 작성 시 발생되는 불확

도의 4가지 요인을 추출하였다. 소변 시료로부터 분석물질의 농 도 산출에 영향을 미치는 불확도 요인에 대한 측정량을 표현하 면 다음과 같다.

(1)

관계식 (1)의 C

는 분석물질의 농도, m

는 분석물질의 양, V 는 시료의 부피, f

는 표준용액 제조 과정에서 발생하는 오차 요 소, f

는 희석 과정에서 발생하는 오차 요소, f

는 재현성 측정 시 발생되는 오차, f

는 검량선 작성에서 발생되는 오차에 대한 요소를 나타낸 것이다. 본 연구에서는 관계식 (1)에서 표현한 4 가지 불확도 요인을 주요 특성 요인으로 선정하여 평가하였다 (Fig. 1).

결과 및 고찰(Results and Discussion)

측정 결과의 불확도 평가는 측정량과 입력량 사이의 수학적 관계식인 측정 모델의 설정, 표준불확도 산출, 합성표준불확도 및 확장불확도 계산의 단계로 나누어진다. 관계식에 포함된 개 별 요인의 불확도 요소로부터 표준불확도를 산출하고, 불확도 전파의 법칙을 적용하여 합성표준불확도를 계산하였으며, 여기 에 신뢰 수준 95%에 해당하는 포함인자(k)를 곱하여 확장불확 도를 구하였다.

C

m

--- V

= × f

× f

× f

× f

Fig. 1. Cause and effect diagram

표준용액 제조 과정의 불확도

표준물질(reference material) 제조와 관련된 불확도(u(S))는 일 반적으로 개별 인자가 갖는 불확도 중 가장 큰 값과 가깝게 된 다. 보관표준물질(1 mg/ml)의 95% 신뢰구간(k=2)에서 성적서에 표시된 불확도는 0.006 mg/ml (d-MA), 0.006 mg/ml (l-MA), 0.007 mg/ml (d-AP), 0.006 mg/ml (l-AP)로 표준불확도(u(R))와 상대표 준불확도(u

(S))는 다음과 같다.

u(R)=0.003 mg/ml (d-MA), 0.0030 mg/ml (l-MA), u(R)=0.0035 mg/ml (d-AP), 0.0030 mg/ml (l-AP)

u

(R)= =0.0030 (d-MA), 0.0030 (l-MA), 0.0035 (d-AP), u

(R)=0.0030 (l-AP) (C

=1.0 mg/ml)

표준용액 제조는 필요에 따라 보관표준용액을 희석 제조하여 사용한다. 제조과정 상 불확도는 희석 과정에서 발생되는 요인 과 부피플라스크 및 피펫 사용 시 불확도 발생 요인이 포함된 다. 희석에 사용된 부피플라스크에 의한 발생 요인은 부피플라 스크 자체가 갖는 불확도, 온도 변화에 따른 부피플라스크 부피 변화에 의한 불확도의 2가지 요소를 고려하였다. 부피플라스크 자체의 불확도는 교정성적서로부터 95% 신뢰구간(k=2)에서 불 확도는 0.013 ml로 표준불확도(u(V

)) 는 0.0065 ml이었다. 메탄 올에 대한 부피 팽창계수가 0.00149 ml/

C이고 실험실 내 온도 조건이 (20±10)

C이므로 온도 변화에 따른 표준불확도(u(T

)) 는 다음과 같다.

u(T

)= =0.008603 ml

불확도 전파의 법칙에 따라 부피플라스크(10 ml)를 이용한 부 피 측정에서의 합성표준불확도(u

(V

)) 와 상대표준불확도(u

(V

)) 를 구하면 다음과 같다.

u(V

)= =0.009196 ml

u

(V

)= =0.0009196 (V

=10 ml)

요인별 표준편차의 자유도는 관계식(2)의 Welch-Satterthwaite equation 을 활용하여 유효자유도(ν

) 를 구할 수 있으며, 이때의 유효자유도는 ∞이었다.

(2)

부피 측정 시 발생하는 피펫의 불확도는 교정성적서로부터 산 출하였다. 성적서 상 피펫(1000 µl)의 불확도는 1.5 µl이었다. 1000 µl 측정 시 피펫(1000 µl)의 표준불확도(u(V

)) 와 상대표준불확

도(u

(V

)) 는 다음과 같다. 이때의 유효자유도는 ∞이었다.

u(V

)=0.75 µl

u

(V

)= =0.00075 (V

=1000 µl)

표준용액 제조과정에서 발생하는 불확도는 표준물질, 부피플 라스크, 피펫에 의한 3가지 요인으로부터 상대표준불확도(u

(S)) 를 산출한 결과는 다음과 같다. 이때 유효자유도는 ∞이었다.

u

(S)=

=0.001309 (d-MA), 0.001309 (l-MA), 0.001309 (d-AP), 0.001309 (l-AP)

여기서 n

은 부피플라스크, n

는 피펫의 사용횟수를 나타낸다.

시료 희석과정의 불확도

소변 시료 분취 및 희석과정에서 발생하는 불확도는 피펫에 의한 인자로부터 발생한다. 부피 측정 시 발생하는 피펫의 불확 도는 교정성적서의 불확도로부터 산출하였고 피펫(100 µl) 성적 서에 표시된 불확도는 0.15 µl이었다. 따라서 피펫(100 µl)의 표 준불확도(u(V

)) 는 0.075 µl이고 100 µl 측정 시 상대표준불확 도는 0.00075, 50 µl 측정 시 상대표준불확도는 0.0015이다. 앞서 구한 피펫(1000 µl)의 상대표준불확도(u

(V

)) 는 0.00075이므로 시료 희석 과정에서 발생되는 상대표준불확도(u

(D))를 구한 결 과는 다음과 같다. 이때 유효자유도는 ∞이었다.

u

(D)

=

=0.001504

여기서 n

은 100 µl 측정 시 피펫(100 µl)의 사용횟수, n

는 1000 µl 측정 시 피펫(1000 µl)의 사용횟수, n

은 50 µl 측정 시 피펫(100 µl)의 사용횟수를 말한다.

측정 모델 재현성에 대한 불확도

측정값에 분포하는 계통 오차는 확률분포에 근거하여 표준불 확도로 표현된다. 특히 측정 결과의 재현성(repeatability)은 기기 분석 및 함유량 측정 시 반드시 확인되어야 할 사항중 하나이 다. 본 연구에서는 3개 농도(75, 250, 750 ng/ml)의 QC 시료 등 분체(n=5)를 이용하여 3회에 걸쳐 정밀도를 반복측정하여 불확 도를 구하였다. 측정값으로부터 아래의 표준불확도(u(R))와 상대 표준불확도(u

(R))를 산출하였다(Table 1). 유효자유도는 관계식 (2)를 활용하여 계산하였으며, 그 값은 34 (d-MA), 33 (l-MA), 33 (d-AP), 32 (l-AP)이었다.

u(R

)= =0.01475 ng/ml (d-MA), 0.01777 ng/

ml (l-MA), 0.1547 ng/ml (d-AP), 0.02055 ng/ml (l-AP) u R ( )

C

---

10 × 0.00148 4 ---

u V (

)

( )

+ ( u T (

) )

u V ( )

V

---

ν

u

u

ν

---

∑

---

=

u V (

) V

---

u

( ) R

( )

+ n

× ( u

( ) V

)

+ n

× ( u

( V

) )

n

⋅ ( u

( V

) )

+ n

⋅ ( u

( V

) )

+ n

⋅ ( u

( V

) )

s

⋅ ( n

– 1 )

( )

∑

n

– 1

( )

--- ∑

u(R

)=0.01130 ng/ml (d-MA), 0.01718 ng/ml (l-MA), 0.01145 ng/ml (d-AP), 0.01513 ng/ml (l-AP)

u(R

)=0.01461 ng/ml (d-MA), 0.01193 ng/ml (l-MA), 0.01210 ng/ml (d-AP), 0.01440 ng/ml (l-AP)

u(R

)= =0.02364 (d-MA), 0.02744 (l-MA),

0.02273 (d-AP), 0.02930 (l-AP)

여기서 s

는 측정일 반복 측정값에 대한 표준편차, n

는 반복 측 정횟수, 는 반복 측정값의 평균을 의미한다.

검량선에 의한 불확도 평가

검량선 작성 시 발생하는 불확도를 줄이고자 내부표준법과 가 중계수를 적용하여 검량선을 작성하였다.

검량선의 비직선성 은 측정 결과 값의 불확도 요인이 된다. 일반적으로 다점교정에 의한 검량선의 직선성을 알아보기 위해서는 회귀분석을 수행하 여 상관계수(r)를 산출하여 평가할 수 있다. 검량선의 수학적 관 계식은 다음과 같다.

,

여기서 y는 내부표준물질의 피크 면적 (A

) 대비 분석물질의 피 크 면적(A

) 의 비율, a는 y절편, b는 기울기, x는 분석물질의 농 도를 나타낸다.

검량선은 6개 농도(25, 50, 125, 250, 500, 1000 ng/ml)를 1회 분석하여 작성하였다. 검량선과 관련된 변수는 가로축 값의 불 확도가 세로축 값의 불확도보다 작다는 가정을 전제 조건으로

하여 선형 최소제곱법을 적용하였다.

검량선의 상관계수(r)는 직선성을 표현하며, 가중계수(w

) 1/x

에서 상관계수 값은 아래의 식으로 구할 수 있다. 실제 소변 시료의 기기분석 결과를 작성 된 검량선에 대입하여 얻은 d-MA의 농도는 253.0 ng/ml이었고, d-AP의 농도는 77.0 ng/ml이었다. 측정 농도에 대한 표준불확도 (u(C))와 상대표준불확도(u

(C))를 다음 식을 이용하여 계산하였 고, 그 값을 Table 2에 나타내었다. 이때 유효자유도는 5이었다.

r=

u(C)=

( , ,

, ,

a

= ,

b

= )

u R ( ) x

---

x

y = a + b x ⋅ y A

A

---

=

w

∑ ^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ ⋅ x}

^y

^{) –} ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

⁾ ∑ ^{( w}

^{⋅ y}

⁾

w

∑ ^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

^{) – (} ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

^{) )}

^⋅ ∑ ^w

^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ y}

^{) – (} ∑ ^{( w}

^{⋅ y}

^{) )}

---

s

b

--- 1

w

--- 1

n --- ( y

– y

)

b

^⋅ ∑ ( ( w

⋅ x

) n x – ⋅ ( )

) --- + +

w

1 x

---

= S

w

∑ ^{⋅ ( y}

^{– ( a}

^{+ b}

^{⋅ x}

^{) )}

n 2 –

---

=

x

w

⋅ x

( )

∑

--- n

= y

w

⋅ y

( )

∑

--- n

= w

⋅ x

( )

∑ ^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ y}

^{) –} ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

⁾ ∑ ^{( w}

^{⋅ ⋅ x}

^y

⁾

w

∑ ^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

^{) – (} ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

^{) )}

---

w

∑ ^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ ⋅ x}

^y

^{) –} ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

⁾ ∑ ^{( w}

^{⋅ y}

⁾

w

∑ ^⋅ ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

^{) – (} ∑ ^{( w}

^{⋅ x}

^{) )}

--- Table 1. Results of the evaluation of method precision from low, middle and high QC samples

Analyte

Nominal concentration

(ng/ml)

Experiments

Standard uncertainty

(ng/ml)

Relative standard uncertainty

1 2 3

Mean (n=5, ng/ml)

Standard deviation (ng/ml)

Mean (n=5, ng/ml)

Standard deviation (ng/ml)

Mean (n=5, ng/ml)

Standard deviation (ng/ml)

d-MA 75.0 76.6 1.2939 77.3 0.9869 79.9 1.1479 1.1498 0.02364

250.0 245.3 2.4234 246.9 3.8764 251.5 1.6251 2.8012 750.0 728.7 13.3903 739.4 8.6569 750.1 9.7878 10.8019

l-MA 75.0 76.3 1.2151 77.3 1.7703 78.2 1.0213 1.3728 0.02744

250.0 247.2 4.1298 247.1 4.6578 253.4 4.0340 4.2827 750.0 722.0 9.1406 741.3 7.0449 749.2 9.9465 8.7961

d-AP 75.0 75.6 1.3926 75.0 1.1474 76.4 0.9239 1.1704 0.02273

250.0 238.9 1.8948 240.6 3.9850 245.5 1.8715 2.7673 750.0 709.8 7.1398 716.2 8.8760 717.9 9.7266 8.6481

l-AP 75.0 74.7 0.9591 74.6 1.5179 75.3 1.9674 1.5378 0.02930

250.0 237.4 2.9816 236.6 5.1855 243.1 1.8557 3.6159

750.0 719.0 6.3324 713.4 12.1224 723.4 11.5772 10.3454

u

(C)= =0.02852 (d-MA), 0.02041 (d-AP)

여기서 x

는 x축 상의 농도 값, y

는 검량점 상의 면적비, x

는 시료의 분석물질 측정 농도 값, y

는 시료의 분석물질 측정 면 적비, w

는 검량점에 적용된 가중계수 값이며, w

는 시료에 적 용된 가중계수 값이다.

광학이성질체 농도 측정 결과 평가

소변 중 MA 및 AP의 d-와 l-광학이성질체 측정값 사이의 유 의미한 차이가 있는지를 확인하기 위해 본 연구에서는 최저 정 량한계 (LLOQ, 25 ng/ml) 및 저·중·고 3 개 농도(75, 250, 750 ng/ml)의 QC 시료 등분체(n=6) 분석을 통해 얻은 측정값을 비 교하여 산출하였다.

두 그룹 간 평균의 차이 여부를 검정할 때 쓰이는 통계적 방 법으로는 우선 측정값들이 등분산이고 정규분포를 갖는 경우 독 립표본 t-test를 사용하고, 정규분포를 가정하기 어려운 경우 비 모수적 방법인 Wilcoxon rank sum test를 적용한다. 등분산성과 정규성 검정을 위해 Fisher’s F test와 Shapiro-Wilk test를 각각 수행하였고, 최저 정량한계(25 ng/ml)에서 측정한 d-MA와 l-MA 분석 결과를 제외한 모든 농도의 MA와 AP 광학이성질체 그룹 모두에서 등분산성과 정규성이 있음을 확인하였다. 등분산성과 정규성을 전제로 4개의 농도에 해당하는 d-MA와 l-MA 측정값 에 대해 독립표본 t-test를 수행하였고, 정규성은 있으나 등분산 성이 없는 경우 Welch’s t-test를 수행하였다.

그 결과 LLOQ 시료에서 d-와 l-MA 측정값에서만 두 그룹 간 평균의 차이가 있었고 나머지 농도에서는 MA 및 AP 광학이성질체 그룹 간 차 이가 없다는 결과를 얻었다. LLOQ 시료에서 d-MA와 l-MA 사 이의 평균의 차이가 있다는 분석 결과를 얻게 된 요인으로 유 효성 검증 항목 중 LLOQ에서 측정 값의 정확도 및 정밀도 기 준이 20% 이내이면 적합하다고 규정하고 있어 상대적으로 낮 은 LLOQ에서의 평균과 분산으로부터 얻은 결과와 차이가 발생 되는 것으로 판단되었다.

또한 측정불확도 평가를 통해 발생 요인 중 d-와 l-광학이성질체 측정에 있어 그룹 간 차이를 발생 시킬 수 있는 요인으로 표준물질에서 발생되는 불확도를 꼽을 수 있는데 이 요인은 불확도 발생 요소 중 1% 미만의 영향을 미치는 것으로 확인되었다. Fig. 2에 d-MA와 l-MA의 두 그룹 측정값에 대한 등분산성, 정규성, 독립표본 t-test 및 Welch’s t- test 결과를 나타내었다. 본 연구의 측정값에 대한 통계 분석은 R-3.6.1 (www.r-project.org) 프로그램을 사용하여 계산하였다.

확장불확도의 계산

확장불확도를 계산하기 위하여 각각의 불확도 요인들에 대한 상대표준불확도를 Table 3에 정리하였다. 개별 인자의 불확도의 자유도로부터 유효자유도를 구하였다. 개별 요소에 대한 상대표 준불확도를 이용하여 분석물질의 상대합성표준불확도(u

(C))를 계산한 결과 d-MA는 0.04229이었고, d-AP는 0.03098이었다. 아 u C ( )

x

---

Table 2. Regression parameters and standard uncertainties of the calibration curve generated for each analyte Analyte Weighting factor

(w

) y-Intercept (a) Slope (b) Correlation coefficient

(r) Standard uncertainty Relative standard uncertainty

d-MA 1/x

0.02591 0.00726 0.9997 7.2161 0.02852

d-AP 1/x

0.03450 0.01306 0.9998 1.5712 0.02041

Fig. 2. Boxplot and statistical analysis of the quantitative results

for d- and l- enantiomers of MA and AP in LLOQ (25 ng/ml), low

QC (75 ng/m l), middle QC (250 ng/ml), and high QC (750 ng/ml)

samples

Fig. 2. Continued.

Fig. 2. Continued.

Table 3. Detailed estimation of uncertainty contributions in the results of d-MA and d-AP analysis in urine

Analyte Description

Source of uncertainty Relative com- bined standard

uncertainty (u

(C))

Relative expanded uncertainty

(U

(C)) Standard

solution (u

(S))

Sample dilution (u

(D))

Repeatability (u

(R))

Calibration curve (u

(C))

d-MA Relative standard uncertainty 0.001309 0.001504 0.02364 0.03501 0.04229 0.09658 Effective degrees of freedom (v

) ∞ ∞ 34 5

Degree of contribution (%) 0.1% 0.1% 31.2% 68.5%

d-AP Relative standard uncertainty 0.001309 0.001504 0.02273 0.02095 0.03098 0.06719 Effective degrees of freedom (v

) ∞ ∞ 33 5

Degree of contribution (%) 0.2% 0.2% 53.9% 45.7%

Uncertainty was quantified for a single measurement of urine sample.

Coverage factor k=2 was chosen as it defines a confidence level of 95%

래의 관계식(3)을 이용하여 상대확장불확도(U

(C))를 계산한 결 과 0.09658 (d-MA), 0.06631 (d-AP)이었다.

U

(C)=u

(C)×k (3)

따라서 실제 필로폰 복용자의 소변 중 d-MA와 d-AP 농도 측정 값을 95% 신뢰구간(k=2)에서 불확도를 포함하여 표기하면, d- MA는 (253.0±21.4) ng/ml, d-AP는 (77.0±4.8) ng/ml이다. 이를 농도 측정값에 대한 불확도 산출 값을 백분율로 표시하면 8.5%

(d-MA) 및 6.2% (d-AP)이었다.

결 론(Conclusion)

본 연구에서는 LC-MS/MS을 이용하여 소변 중 MA 및 AP 광학이성질체의 농도를 측정하는 과정 중 발생되는 측정불확도 를 산출하였고, d와 l-MA 및 AP 광학이성질체 농도 측정 결과 를 통계분석을 통해 두 그룹 간 차이가 있는지 여부도 확인하

였다. 실제 소변 시료 분석을 통해 계산한 d-MA와 d-AP의 측 정불확도는 측정값에 대한 백분율로 나타내면 8.46% 이내였고, LLOQ 농도에서 d-MA와 l-MA를 제외하면 두 이성질체 그룹 간 차이는 없었다. 검토된 불확도 요인은 표준용액 제조, 시료 희석, 정밀도 및 검량선의 비직선성의 4가지 요인 중 정밀도와 검량선의 비직선성의 2가지 요인이 불확도에 큰 영향을 미치는 인자임을 확인하였다. 측정 모델의 재현성으로부터의 오차는 검 량범위 내 QC 시료 측정값으로부터 불확도를 계산하는 경우, 보통 가장 큰 불확도를 갖는 저 농도 QC 측정값만을 사용할 것 인지 아니면 저·중·고 모든 농도의 QC 측정값 사용이 적절 한지에 대한 판단에 따라 불확도 값은 달라지므로 이를 고려해 야 한다. 검량선으로부터 발생되는 오차는 분석물질이 시료에 가장 많이 분포하는 농도를 중심으로 정량 농도 범위를 재구성 하고 그 범위를 가능한 줄여 작성하거나 검량선 작성에 사용되 는 농도의 수를 증가시켜 분석함으로써 검량선으로부터 발생되 는 불확도를 감소시킬 수 있을 것으로 판단된다. 다만 마약 감 Fig. 2. Continued.

Fig. 2. Continued.

정의 특성 상 다량의 시료를 빠른 시간 내에 분석해야 하는 상 황과 분석 수행의 경제적인 측면과 시간적 측면이 함께 고려되 어야 한다. 따라서 측정불확도에 영향을 미치는 개별 인자에 대 한 본 연구결과를 바탕으로 분석결과의 신뢰도가 향상되고 측 정불확도 발생 요인이 최소화될 수 있는 분석법 개선 연구를 앞 으로 수행할 예정이다.

Conflict of Interest

모든 저자는 이해 상충을 가지고 있지 않음을 선언한다.

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