LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 전나무 잎 추출물의 항산화 및 항염증 효과
최영주1․박미화1․김윤세2․정경임1
1신라대학교 의생명과학대학 식품영양학과
2(주)인산가
Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects of Abies holophylla Leaf Extract in LPS-Induced RAW 264.7 Cells
Young Ju Choi1, Mi Hwa Park1, Yoon Se Kim2, and Kyung Im Jung1
1Department of Food and Nutrition, College of Medical Life Sciences, Silla University
2Insanga Co., Ltd.
ABSTRACT Abies holophylla is an evergreen and coniferous tree that is widely distributed in Russia, China, and Korea. This study investigated the antioxidant, antidiabetic, and anti-inflammatory effects of Abies holophylla leaf ethanol extract (AHLE). The total polyphenol content of the AHLE was 188.09 mg tannic acid equivalent/mg.
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical scavenging activity of AHLE were remarkably increased in a dose-dependent manner (P<0.05), and was about 89.63% at 1 mg/mL concentration. Superoxide dismutase activity of AHLE was 95.61% at 1 mg/mL concentration. α-Glucosidase inhibitory activity of AHLE was 51.79% at 1 mg/mL concentration and was increased in a dose-dependent manner. Nitrite scavenging activity of AHLE was 84.73%, 66.31%, and 42.40%
at pH of 1.2, 3.0, and 6.0 at 1 mg/mL concentration, respectively. The reactive oxygen species level was examined using lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. The ROS level of cells was reduced by 15.94% with AHLE at 50 µg/mL, as compared with the LPS-treated group. The anti-inflammatory effects were examined using LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Nitric oxide production was reduced 31.10% by the addition of AHLE at 50 µg/mL.
AHLE reduced the protein expression of inducible nitric oxide synthase in a dose-dependent manner (P<0.05). From these results, we conclude that Abies holophylla leaf may be a highly valuable natural product owing to its high quality functional components, as well as its antioxidant, antidiabetic, and anti-inflammatory effects.
Key words: Abies holophylla leaf, antioxidant, α-glucosidase inhibition, anti-inflammatory, functional material
Received 24 February 2020; Accepted 25 May 2020
Corresponding author: Kyung Im Jung, Department of Food and Nutrition, College of Medical Life Science, Silla University, Busan 46958, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-51-999-7618
Author information: Young Ju Choi (Professor), Mi Hwa Park (Professor), Kyung Im Jung (Professor)
서 론
전나무(Abies holophylla Maxim)는 중국, 러시아, 한국 등에 서식하는 소나뭇과 전나무속의 상록침엽수종으로(Kim 등, 2016b; Xia 등, 2012) 잣나무와 소나무 곁에서 자라기 때문에 ‘측백’이라 불리고, 나무 자체의 수피에 흰빛이 띠기 에 ‘백송’이라고도 불린다(Lee 등, 2006). 전나무의 주성분 은 catechin(Lee 등, 2006) 및 lignans(Kim 등, 2013) 등으 로 보고되어 있다. 이러한 전나무속의 추출물들은 혈관과 폐, 류마티스 질환, 소화불량, 복통, 감기 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있기에 민간요법으로 이용되고 있으며(Kim
등, 2013; Yesilada 등, 1995), 항염, 항궤양, 항진균, 항박 테리아 효과가 있는 것으로 보고되어 있다(Singh 등, 1998;
Richardson 등, 1992). 천연물에 대한 관심이 높아짐에 따 라 천연물로부터 기능성 물질을 탐색하기 위한 연구가 활발 하게 진행되고 있으며, 또한 수목의 잎과 목재 등의 추출물 중에서 생리활성이 뛰어난 성분들을 이용하여 기능성 물질 로서의 활용 방안에 대해서도 연구가 이루어지고 있다(Lee 등, 2006). 지금까지 수목의 기능적 및 약리적 이용은 대부 분 활엽수에 대한 것으로 침엽수인 전나무 잎의 생리활성에 대한 연구는 거의 없는 실정이다(Lee 등, 2006).
Superoxide radical, hydrogen peroxide, peroxyl rad- ical, hydroxyl radical 등과 같은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 생체 내 정상세포의 생화학 반응 이나 화학물질 및 환경오염에 노출되어 생성된다(Lee 등, 2017). ROS는 단백질 분해, 세포막 손상 등을 유발하여 세 포 손상을 가져오는데, 이는 염증반응과도 연결되어 있기에 염증반응이 유도되어 파킨슨병, 알츠하이머, 관절염, 당뇨
병, 심장병 등 많은 질환의 원인이 될 뿐만 아니라 DNA의 손상으로 인한 발암 과정과도 관련이 있다고 보고되어 있다 (Valko 등, 2007). 면역기능과 염증반응을 조절하며 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 대식세포는 체내에 들어온 이물 질을 세포 독성물질을 분비하여 암세포나 이종 세포를 파괴 하는 생체 내의 면역세포로 lipopolysaccharide(LPS)에 의 해 활성화되어 nitric oxide(NO), ROS, cytokine 등을 생산 하고 방출하게 된다(Kroncke 등, 1998; Gross와 Wolin, 1995; Oshima와 Bartsch, 1994; Woo 등, 2018). 대식세포 의 감염 초기에는 LPS가 숙주 방어에 중추적인 역할을 하지 만(Woo 등, 2018), 과도한 자극은 cyclooxygenase-2 (COX-2)와 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 등의 단백질을 발현시켜 과량의 NO를 생성함으로써 염증을 일으 키게 되는데(Cho, 2017; Silswal 등, 2005) 염증 반응이 지 속되면 심각한 질병으로 이어지게 된다(Kim과 Lee, 2015;
Lee 등, 2017).
따라서 본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 항산화 활성과 항당뇨 및 항염증 효과의 정도를 알아보고 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다. 먼저 항산화 활성 은 총 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능, superoxide dismutase(SOD) 활성 및 RAW 264.7 세포에 대한 ROS 소거 활성을 측정하였고 항당뇨 효과는 α-glucosidase 억 제 효과를 측정하였으며, 항염증 효과는 아질산염 소거능과 RAW 264.7 세포에 대한 NO 및 iNOS 억제 효과를 측정하 였다.
재료 및 방법
실험재료 및 시료 제조
본 연구에 사용한 전나무 잎은 지리산(경상남도 함양)에서 채취하여 건조한 것으로 인산가(Insanga Co., Ltd., Gyeong- nam, Korea)에서 제공받아 후드믹서(FM-681C, HANIL Electric, Seoul, Korea)로 분쇄하여 시료로 사용하였다. 전 나무 잎의 생리활성 측정을 위해 전나무 잎 분말 50 g에 80% 에탄올 500 mL를 가하여 상온에서 24시간 동안 추출 하였다. 추출물은 Whatman No. 2 filter paper(Whatman International Ltd., Maidstone, England)로 여과하여 ro- tary evaporator(EYELA N-1000, Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 다음 동결 건조하여 -70°C에서 보관하며 사용하였다. 전나무 잎 에탄올 추출물의 수율은 27.23%였 다. 실험에 사용한 모든 시약은 Sigma-Aldrich Co.(St.
Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(Singleton 등, 1999)을 변형시켜 측정하였으며 표준물질로는 tannic acid 를 사용하여 분석하였다. 전나무 잎 추출물을 시험관에 취한 후 증류수를 가하여 2 mL로 정용하고 Folin-Ciocalteu re-
agent 0.3 mL를 가하여 잘 혼합한 다음 3분간 실온에서 반응시켰다. 혼합물에 7.5% Na2CO3 용액 0.4 mL를 가하여 50°C에서 5분간 발색시킨 다음 760 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 전나무 잎 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 mg tannic acid equivalents(TAE)/mL로 나타내었다.
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거능 측정
전나무 잎 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Blois (1958)의 방법을 변형하여 DPPH에 대한 수소 공여 효과를 측정하였다. 96-well plate에 시료와 0.4 mM DPPH 용액 을 1:4의 비율로 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 다음 ELISA reader(Versa Max Microplate Reader, Molecu- lar Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 520 nm에 서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료를 첨 가하지 않은 대조 그룹과의 흡광도 차를 비교하여 자유 라디 칼의 제거 활성을 백분율(%)로 나타내었다.
DPPH radical scavenging activity (%)＝
(
1－ 시료 첨가구의 흡광도)
×100시료 무첨가구의 흡광도
SOD 활성 측정
전나무 잎 에탄올 추출물의 SOD 활성은 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies Inc., Rockville, MD, USA)을 사용하여 manufacturer’s instruction에 기술된 방 법에 따라 측정하였다. 농도별로 희석한 시료 20 μL를 96- well plate에 분주하고 WST working solution 200 μL를 넣고 혼합한 후 enzyme working solution 20 μL를 가하여 37°C에서 20분간 반응시킨 다음 ELISA reader를 이용하 여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 효소 대신 20 μL의 dilution buffer를 넣어 측정하였다. SOD 활성은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었으며 SOD 유사 활성 측정식과 동일한 식을 사용하 였다.
SOD activity
(%) ＝
(
1－ 시료 첨가구의 흡광도)
×100시료 무첨가구의 흡광도
α-Glucosidase 활성 억제 효과 측정
전나무 잎 에탄올 추출물의 α-glucosidase 활성 억제 효 과는 Watanabe 등(1997)의 방법으로 측정하였는데, 이는 다당류가 단당류로 분해되는 경로에서의 억제 효과를 알아 볼 수 있는 방법이다. 효소 용액은 phosphate buffered sal- ine(PBS)에 0.2 g/L NaN3, 2.0 g/L bovine serum albumin 과 함께 효소(0.7 unit/mL)를 용해시켜 만들고, 기질용액은 ρ-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside를 PBS에 5 mM 농 도로 용해하여 만들었다. 효소 용액 0.5 mL에 시료 0.1 mL 를 넣은 후 405 nm에서 흡광도를 측정하고, 반응 전의 흡광 도를 측정한 후 5분간 실온에 방치한 뒤 기질 용액 0.5 mL를
넣고 5분간 반응시킨 다음 흡광도를 측정하였다. Positive control로는 acarbose를 사용하였으며 저해율은 다음의 식 을 사용하여 백분율로 나타내었다.
Inhibitory rate
(%) ＝
(
1－ 시료 첨가구의 흡광도)
×100시료 무첨가구의 흡광도
아질산염 소거능 측정
전나무 잎 에탄올 추출물의 아질산염 소거능은 Gray와 Dugan(1975)의 방법을 변형하여 측정하였다. 아질산염 용 액에 시료 용액을 가한 후 0.1 N HCl(pH 1.2)과 0.2 M 구연 산 완충용액을 사용하여 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 6.0으로 조정하여 사용하였다. 반응물용액은 37°C에서 1시 간 반응시킨 후 Griess 시약을 가하여 15분간 실온에 방치 시킨 다음 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산 염을 구하였다. 아질산염 소거능은 아래의 식에 따라 계산하 였다.
Nitrite scavenging activity (%)＝[1－(A－C)/B]×100 A: 1 mM NaNO2 용액에 추출 시료를 첨가하여 1시간
반응시킨 후의 흡광도 B: NaNO2 용액의 흡광도 C: 시료의 흡광도
세포배양
RAW 264.7 대식세포는 100 units/mL의 penicillin, 100 μg/mL streptomycin과 10%의 fetal bovine serum이 함유 된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)을 사용 하여 37°C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양된 세 포는 2~3일에 한번 refeeding 하면서 배양하였고 세포분화 가 최대에 도달하였을 때 PBS로 세포를 세척한 후 스크래퍼 를 이용하여 세포를 분리한 뒤 원심분리 하여 세포를 모은 다음 세포와 배지를 잘 혼합한 후 계대배양 하여 사용하였다.
Cell viability 측정
세포독성 실험은 mitochondrial dehydrogenase activ- ity의 index를 나타내는 MTT colorimetric reduction as- say를 이용하여 전나무 잎 에탄올 추출물이 세포 생존율에 미치는 영향을 측정하였다. 96-well microtiter plate(SPL Lifesciences, Gyeonggi, Korea)에 RAW 264.7 대식세포 를 1.0×105 cells/well의 농도로 분주하고 분주 24시간 후 전나무 에탄올 추출물이 함유되어 있는 배지를 각각 100 μL씩 넣어 48시간 동안 배양하였다. Plate에 2 mg/mL의 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) 용액을 20 μL씩 첨가하여 4시간 동안 배양 시키고 formazan을 형성시킨 후 조심스럽게 상등액을 제거 하였다. Dimethyl sulfoxide 150 μL를 첨가하여 formazan 을 녹인 다음 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서 흡광 도를 측정하였다.
Intracellular ROS level 측정
산화적 스트레스에 의해 과산화지질을 생성하여 세포 독 성으로 작용할 뿐만 아니라 세포 손상을 유발하는 ROS를 측 정하기 위하여 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate(DCF- DA, Sigma-Aldrich Co.) 형광염료를 이용하였다. DCF- DA는 세포에서 아세틸기를 제거하고 그것이 세포 내의 hy- drogen peroxide와 같은 라디칼에 정량적으로 반응하여 DCF 형광물질로 변화되는 것을 측정하는 원리이다. 세포가 confluence 상태가 되면 96-well plate에 well당 2×104 cells/mL로 seeding 하여 2시간 incubation 한 후 시료를 농 도별로 처리하여 2시간 배양하였다. 이후 1 μg/mL의 LPS를 첨가하여 20시간 배양하여 스트레스를 유발시킨 다음 배양 한 배지를 제거하고, 세포는 PBS로 두 번 세척하였다. 세포에 100 μM의 DCF-DA를 넣어 15분, 다시 60분 동안 실온에서 incubation 한 다음 fluorescence plate reader(TECAN, Mannedorf, Switzerland)로 DCF-DA fluorescence 상승 률을 측정하였다.
Nitric oxide(NO) 생성 측정
NO 소거 활성은 RAW 264.7 세포를 배양 판에 1.0×105 cells/mL의 세포가 되도록 분주하여 LPS 자극 하에 24시간 배양하고, 그 배양 상층액 내의 NO 생성은 Griess 반응으로 세포 상등액에 축적되는 nitrite 양으로 측정하였다. 대조군 으로는 10 μg/mL의 LPS를 처리하여 활성화를 유도한 세포 를 사용하였다. 배양 후 100 μL의 상층액을 취하여 동량의 Griess 시약[1% sulfanilamide(30% acetic acid)와 0.1%
N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride(60%
acetic acid) 혼합액]을 가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하 였다.
iNOS 발현 억제능 측정
전나무 잎 에탄올 추출물의 iNOS 발현 억제능 측정을 위 해 RAW 264.7 세포를 12-well plate에 1×106 cells/well로 seeding 하여 2시간 배양하고 시료를 처리한 후 24시간 뒤 에 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 동안 37°C에서 배양 하였다. iNOS 분석을 위한 단백질 샘플은 RIPA lysis buff- er를 이용하여 분해시킨 후, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리 하여 상층액에 있는 단백질을 회수하였다. 회수한 단백 질은 Bio-Rad Protein Assay(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)로 농도를 측정하여 30 μg으로 농도를 맞춘 후 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 수행하였다. SDS-PAGE 후 nitrocellulose membrane에 transfer 하고 5% skim milk에서 1시간 동안 상온에서 blocking 시켰다. 1차 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) 를 희석하여 4°C에서 overnight 시킨 후 tris buffered sal- ine with Tween-20(TBS-T)로 15분씩 3번 세척하였다.
Table 1. Total polyphenol content of Abies holophylla leaf etha- nol extract
Sample Total polyphenol (mg TAE/g)1) Abies holophylla extract 188.09±11.422)
1)TAE standards for tannic acid equivalents.
2)Results are mean±SD of triplicate data.
a b
c
d a
0 20 40 60 80 100 120
Vit. C 0.1 0.2 0.5 1
Concentration (mg/mL) DPPH radical scavenging . activity (%) .
Fig. 1. 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scaveng- ing activity of Abies holophylla leaf ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 0.1 mg/mL) is used as positive control. Different letters (a-d) within a total sample differ significantly (P<0.05).
2차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 상온에서 1시 간 반응시킨 후 다시 TBS-T로 15분간 3회 세척하였다.
Chemiluminescence detection system(ECL, Bio-Rad Laboratories Inc.)을 처리 후 암실에서 X-ray 필름으로 감 광시켜 단백질 발현량을 확인하였다.
통계처리
실험 결과는 통계 SAS package(Statistical Analysis System, Version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 를 사용하여 각 시료의 평균과 표준편차를 계산하였고 분산 분석(ANOVA)과 Duncan’s multiple range test를 실시하 여 P<0.05 level에서 시료간의 유의차를 검정하였다.
결과 및 고찰
총 폴리페놀 함량
자연계에 널리 분포되어 있는 식물의 2차 대사산물인 페 놀성 화합물은 tannin과 lignan, flavonoid 및 stilbene 등이 있다(Kim, 2008). 페놀성 화합물은 phenolic hydroxyl기와 탈수소 작용을 일으키고 수소원자를 공유하여 라디칼의 안 정화를 유도함으로써 항산화 및 다양한 생리기능을 갖는다 (Lee 등, 2010). 따라서 본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 tannic acid를 표준물질로 사 용하여 측정한 결과(Table 1) 188.09 mg TAE/g으로 나타 났는데, Seong 등(2018)은 오일 성분을 추출한 후 남은 전 나무 잎 부산물 열수(100°C) 및 70% 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 각각 45.70 mg gallic acid equivalent (GAE)/g과 119.95 mg GAE/g으로 보고하였다. 천연 식물 이 항산화제로서의 필수적인 역할을 하는 폴리페놀 함량은 많은 식물에서 밝혀져 있는데(Kim 등, 2016a) 편백나무 잎 열수 추출물은 25.89 mg GAE/g(Kim 등, 2018), 느티나무 잎 열수 추출물과 에틸아세테이트 분획물은 각각 51.62 mg TAE/g과 56.63 mg TAE/g(Jang과 Park, 2016), 노간주나 무 열수 및 70% 에탄올 추출물은 각각 71.3 mg TAE/g과 116.0 mg TAE/g(Kim 등, 2014), 다정큼나무와 참가시나 무 잎 에탄올 추출물은 65.20 mg GAE/g과 85.20 mg GAE/
g(Kim 등, 2016a), 솔순 에탄올 추출물(Cho 등, 2009)은 151 mg TAE/g으로 보고되어 있다. 본 연구 결과 전나무 잎 에탄올 추출물은 노간주나무와 느티나무 및 생리활성이 높은 것으로 알려진 솔순의 총 폴리페놀 함량보다 높은 것으 로 나타났으므로 천연 항산화제로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
DPPH assay
DPPH assay는 항산화 물질과 반응하면 음이온의 라디칼 이 소거되면서 짙은 보라색이 노란색으로 탈색되는 원리로 써 항산화 활성 측정에 많이 사용되는 방법 중 하나이다 (Nam 등, 2015; Bondet 등, 1997). DPPH 라디칼 소거능은 flavonoids와 phenolic acids 및 기타 페놀성 물질에 대한 항산화 지표로써 환원력이 큰 물질일수록 라디칼 소거능이 높은 것으로 알려져 있다(Kang 등, 1995). 본 연구에서 전 나무 잎 에탄올 추출물의 항산화 활성 정도를 확인하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과(Fig. 1) 농도 의존적으 로 증가하였으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도에서의 DPPH 라 디칼 소거능은 89.63%로 높게 나타났는데, Seong 등(2018) 은 전나무 잎 부산물 열수(100°C) 및 70% 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 각각 99.42%와 75.77%로 보고하 였고, Lee 등(2006)은 전나무 잎 70% 아세톤 추출물의 헥 산과 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 수용성 분획물 에 DPPH 라디칼 소거능이 있는 것으로 보고하였다. 식물 잎의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 연구로 Kim 등(2016a)은 다정큼나무와 참가시나무 잎 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도 에서 각각 25.40%와 45.59%로 보고하였고, Jang과 Park (2016)은 느티나무 잎 열수 추출물과 에틸아세테이트 분획물 200 μg/mL 농도에서 각각 72.6%와 87.0%로 보고하였다.
Lee 등(2019)은 황칠나무 잎 95% 에탄올 추출물의 IC50는 108.98 μg/mL로 보고하였다. 한편 Kim 등(2006a)은 국내 유통 중인 식용식물 추출물 1,000 ppm 농도에서의 DPPH 라디칼 소거능은 마테(88.9%), 울금(82.2%), 솔잎(66.4%) 의 순으로 활성이 높은 것으로 보고하였다. 본 연구 결과 전나무 잎 추출물은 항산화능을 나타내는 지표로 알려진 총 폴리페놀 함량 및 DPPH 라디칼 소거능이 높은 것으로 나타 났기 때문에 천연 항산화 소재로서의 가치가 높은 것으로 판단된다.
c b
e d a
0 20 40 60 80 100 120 140
Vit. C 0.1 0.2 0.5 1
Concentration (mg/mL)
SOD activity (%) .
Fig. 2. Superoxide dismutase (SOD) activities of Abies hol- ophylla leaf ethanol extract. Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 0.5 mg/mL) is used as positive control.
Different letters (a-e) within a total sample differ significantly (P<0.05).
b c
d
e a
0 10 20 30 40 50 60 70
Acarbose 0.1 0.2 0.5 1
Concentration (mg/mL) α-glucosidase inhibitory . activity (%) .
Fig. 3. Inhibitory effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on α-glucosidase activity. Results are mean±SD of triplicate data.
Acarbose (0.5 mg/mL) is used as positive control. Different let- ters (a-e) within a total sample differ significantly (P<0.05).
SOD assay
인체 내에 존재하는 항산화 효소 중의 하나인 SOD는 su- peroxide radical을 과산화수소(H2O2)와 정상 상태의 산소 로 환원시켜줌으로써 노화 억제 등의 생리기능을 하는 효소 로 알려져 있다(Han 등, 2015; Lee 등, 2010). 체내에서의 노화 및 산화 억제와 관련이 있는 SOD 활성과 SOD 유사 활성을 가진 천연물 소재를 탐색하기 위한 연구(Kim 등, 2006a; Cho 등, 2009; Lee와 Han, 2000)들이 많이 이루어 져 있지만, 전나무 잎의 SOD 활성 측정에 관한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 SOD 활성을 가진 새 로운 천연물 소재를 탐색하고자 전나무 잎 에탄올 추출물의 SOD 활성을 측정한 결과(Fig. 2) 농도 의존적으로 증가하였 으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도에서 95.61%로 높게 나타났 다. 천연물의 SOD 활성 및 유사 활성 측정 연구에서 국내 유통 중인 식용식물 추출물 1,000 ppm 농도에서의 SOD 활성은 솔잎(75.1%), 유근피(74.1%), 히비스커스(73.0%), 마테(71.5%) 순으로 활성이 높았고(Kim 등, 2006a), 솔순 에탄올 추출물 10 mg/mL 농도에서의 SOD 유사 활성은 47.9%로 보고되었다(Cho 등, 2009). 또한 국내산 느릅나무 수피 및 근피를 물과 메탄올, 에탄올 및 부탄올로 추출한 추출물의 SOD 유사 활성을 측정한 결과, 수피는 물 추출물 이 가장 높은 활성을 보였고 근피는 에탄올 및 메탄올 추출 물이 각각 37.2%와 34.0%로 물 및 부탄올 추출물보다 높은 것으로 보고하였다(Lee와 Han, 2000). 본 연구 결과 전나무 잎 추출물은 SOD 활성이 매우 높은 것으로 나타났기 때문에 산화에 의한 장애를 효과적으로 제어할 수 있는 항산화제로 서 가능성이 있는 것으로 생각된다.
α-Glucosidase 활성 억제 효과
당뇨병은 암, 심뇌혈관계 질환과 함께 3대 질병으로 알려 져 있다(Nam 등, 2015). 소장 상피세포의 미세 융모막에 존재하는 가수분해효소인 α-glucosidase는 소장에서 다당
류나 이당류를 포도당으로 분해하는 역할을 한다(Kwon 등, 2014; van de Lear 등, 2005). 식후 혈당 상승을 억제할 수 있는 α-glucosidase 저해제는 α-glucosidase에 경쟁적으 로 결합하여 효소 활성을 저해함으로써 탄수화물의 소화와 흡수를 지연시켜 불필요한 인슐린의 분비 및 급격한 혈당 상승을 억제하게 된다(Lee 등, 2008). 따라서 당뇨병 등의 질병 예방을 위해 α-glucosidase 저해제의 개발이 중요하 지만, 지금까지 개발된 α-glucosidase 저해제는 구토, 설사 및 복부 팽만감 등 다수의 부작용이 있는 것으로 보고되고 있기에(Hanefeld, 1998) α-glucosidase 저해 효과가 있는 천연물 소재 발굴을 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있다 (Lee 등, 2015). 천연물의 α-glucosidase 저해 활성을 측정 한 연구에서 Kim 등(2014)은 노간주나무 열수 및 에탄올 추출물 500 μg/mL 농도에서 각각 48.39%와 78.14%로 보 고하였고, Lee 등(2015)은 동결건조 한 미숙 영귤과 성숙 영귤 메탄올 추출물 200 μg/mL 농도에서 각각 38.2%와 54.9%로 보고하였으며, Lee 등(2014)은 천년초 줄기 에탄 올 추출물 1 mg/mL 농도에서 23.48%로 보고하였다. 또한 Nam 등(2015)은 산사 70% 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도 에서 35.62%로 보고하였으며, Kang 등(2017)은 초석잠 에 탄올 추출물 1 mg/mL 농도에서의 저해활성은 47.47%로 보고하였다. 본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 α- glucosidase 저해활성을 제2형 당뇨병 치료제로 시판되고 있는 acarbose를 positive control로 하여 측정한 결과(Fig.
3) 농도 의존적으로 증가하였으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도 에서 51.79%로 높게 나타났다. 한편 뽕나무 상엽과 상지, 상백피 및 오디 에탄올 추출물의 α-glucosidase 저해 효과 측정에서 IC50는 각각 165.3 μg/mL, 33.8 μg/mL, 28.1 μg/
mL, 257.2 μg/mL로 상백피가 가장 높은 것으로 보고하였 는데, 동의보감에서는 상지와 상백피 추출물로 담근 뽕나무 주나 상지를 볶아서 만든 상지차가 혈당 강하 효과가 있는 것으로 기록되어 있다(Choi 등, 2015). 포도당의 대사 과정 중에 발생되는 활성산소에 의해 조직의 손상이 나타나므로
e c
a
ef c d
f d
b
0 20 40 60 80 100 120
pH 1.2 pH 3.0 pH 6.0
Nitrite scavenging ability (%) .
Vit. C 1 mg/mL Sample 0.5 mg/mL Sample 1 mg/mL
Fig. 4. Nitrite scavenging effects of Abies holophylla leaf etha- nol extract under different pH conditions (pH 1.2, 3.0, 6.0).
Results are mean±SD of triplicate data. Vitamin C (Vit. C, 1 mg/mL) is used as positive control. Different letters (a-f) within a total sample differ significantly (P<0.05).
b a
bc cd
d e
f
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Cell viability (% of control) .
LPS (1 μg/mL) - + + + + + + Sample (μg/mL) - - 12.5 25 50 100 200
Fig. 5. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on cell viability in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were cultured for 24 h with various concentration of PBE in the presence of LPS (10 μg/mL). Cytotoxicity was determined by MTT assay.
Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-f) within a total sample differ significantly (P<0.05).
활성산소를 소거하는 항산화 활성과 α-glucosidase 저해 활성이 동시에 작용할 때 더욱 효과적으로 당뇨병을 관리할 수 있다(Kang 등, 2015). 본 연구 결과 전나무 잎 추출물은 총 폴리페놀 함량과 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD 활성 등 의 항산화 활성과 함께 α-glucosidase 저해 활성이 우수한 것으로 나타났기에 식품 및 의약품 소재 개발을 위한 기초 자료로 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
아질산염 소거능
Nitrosamine을 생성하는 물질인 아질산염은 단백질이나 핵산 또는 세포 내 성분을 알킬화함으로써(Lee 등, 2010;
Han 등, 2015) 매우 낮은 농도의 노출에도 방광암이나 후두 암, 위암 등의 다양한 암을 유발시킬 수 있으므로 환경적인 발암인자로 중요시되고 있다(Han 등, 2015). Nitrosamine 은 식품성분과의 상호반응에 의해 식품 자체 내에서도 생성 되며, 특히 위 내의 pH와 유사한 산성 조건에서 생성이 촉진 된다(Park과 Jang, 2003). 본 연구에서는 0.5 mg/mL 및 1 mg/mL 농도에서 전나무 잎 에탄올 추출물이 아질산염 소 거능에 미치는 영향을 pH 1.2, 3.0, 6.0에서 각각 분석하였 다. 그 결과 pH 1.2, 3.0, 6.0에서의 아질산염 소거능은 0.5 mg/mL에서는 각각 76.07%, 67.60%, 44.22%이며(Fig.
4), 1 mg/mL 농도에서는 각각 84.72%, 66.31%, 42.40%로 pH가 낮을수록 아질산염 소거능이 높아지는 것으로 나타났 다. pH 1.2에서의 아질산염 소거능은 1 mg/mL 농도에서 높은 활성을 보였고(P<0.05), pH 3.0과 6.0에서는 0.5 mg/
mL 농도에서 높은 활성을 보였으나 1 mg/mL 농도와는 유 의적인 차이가 없었다. 본 연구 결과 전나무 잎 에탄올 추출 물은 위 내의 pH 조건과 유사한 pH 1.2에서 활성이 가장 좋은 것을 확인할 수 있었으며, 이는 낮은 pH 조건에서 ni- trosamine의 생성을 보다 효과적으로 억제할 수 있을 것으 로 판단된다. Lee와 Han(2000)은 느릅나무 근피를 물과 메 탄올, 에탄올 및 부탄올로 추출한 추출물 0.5 mg/mL 농도에
서의 아질산염 소거능은 pH가 낮아질수록 높은 소거능을 보이는데, 특히 pH 1.2에서는 물 추출물을 제외한 나머지 군에서 75% 이상의 높은 소거능이 나타난 것으로 보고하였 다. Han 등(2015)은 무수에탄올과 메탄올, 아세톤 및 물 추 출물 1 mg/mL 농도에서의 아질산염 소거능이 pH에 매우 의존적이며 pH가 높을수록 소거능은 감소하는 것으로 보고 하였는데, pH 1.2에서 각각의 추출물들은 각각 87.47%, 86.02%, 81.44%, 89.71%의 소거능이 나타난 것으로 보고 하였다. Yamada 등(1978)은 flavonoid와 polyphenol 화합 물의 종류에 따라 차이가 있지만 페놀성 유도체들이 nitroso 화합물의 생성을 억제하는 것으로 보고하였고, Lee 등(2010) 은 아질산염 소거능 및 nitrosamine의 생성 억제 효과가 페 놀성 화합물에 의한 효과라고 보고하였다. 본 연구 결과 전 나무 잎 추출물의 높은 아질산염 저해 효과는 총 폴리페놀 화합물의 함량과 관계가 있는 것으로 사료된다.
Cell viability
전나무 잎 에탄올 추출물의 세포독성은 MTT 분석을 통 해 측정하였다. 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/
mL 및 200 μg/mL 농도의 시료를 대식세포에 처리하여 세 포 생존율을 측정한 결과 각각의 농도에서 94.33%, 90.33
%, 84.00%, 71.00%, 52.67%로 나타났다(Fig. 5). 이후 진 행된 세포실험은 70% 이상의 세포 생존율을 보인 12.5 μg/
mL와 25 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL의 농도로 진행하 였다.
RAW 264.7 세포 내 ROS 생성에 대한 전나무 잎 에탄올 추출물의 효과
세포의 생존과 사멸 및 산화-환원 반응 유지에 중요한 역할을 하는 ROS는 세포의 대사 과정에서 생성되는데, 다량 의 ROS는 세포 및 조직에 산화 스트레스로 작용하여 인슐린 저항성 증가 및 급성 염증반응 유도 등 다양한 질환을 일으
d c a b
a
e e
0 50 100 150 200 250
ROS level (%) .
LPS (1 μg/mL) - - + + + + + Sample (μg/mL) - 100 - 12.5 25 50 100
Fig. 6. Effect of Abies holophylla leaf ethanol extract on intra- cellular ROS level in LPS-treated RAW 264.7 cells. Cells (2×
104 cells/well) in 96-well plates were first incubated with and without indicated concentrations of sample for 2 h, and then incubated with LPS (1 μg/mL) for 20 h. Untreated is negative control without LPS treatment. Results are mean±SD of tripli- cate data. Different letters (a-e) within a total sample differ sig- nificantly (P<0.05).
d c b b
a
e e 0 10 20 30 40
NO2- (μM) .
LPS (1 μg/mL) - - + + + + + Sample (μg/mL) - 100 - 12.5 25 50 100
Fig. 7. Effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on NO synthesis in bacterial LPS-stimulated RAW 264.7 cells. NO re- lease was measured using the method of Griess (nitrite). Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-e) within a total sample differ significantly (P<0.05).
킨다(Choi와 Kim, 2014; Yoon 등, 2012). 따라서 경제성을 갖는 천연 소재의 탐색을 위해서 식물의 ROS 생성 억제 효 과에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나, 전나무 잎 추 출물의 ROS 생성 억제 효과에 대한 연구는 거의 없는 실정 이다. 이에 본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 처리 에 따른 RAW 264.7 세포 내의 ROS 생성 정도를 DCF-DA 를 이용하여 fluorescence plate reader로 확인하였다. 그 결과(Fig. 6) 전나무 잎 추출물 농도 의존적으로 ROS 생성 은 감소하였는데(P<0.05), 50 μg/mL 농도에서의 ROS 생성 은 189.45%로 LPS 처리군(225.37%)보다 15.94% 감소하 였다. 본 연구 결과 전나무 잎 에탄올 추출물은 과도하게 생성된 ROS를 감소시킴으로써 산화적 스트레스로부터 세 포를 보호할 수 있는 천연 소재임을 확인할 수 있었다.
NO assay
본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 항염증 활성을 측정하기 위하여 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하고 세포 내의 NO 생성을 유도한 후 시료를 세포에 처리하여 NO 합 성에 미치는 영향을 알아보았다. LPS만을 단독으로 처리한 대조군에서 생성된 NO 농도는 33.12 μM로 LPS 무처리군 (1.59 μM)보다 높게 나타났기에 LPS에 의한 염증반응이 충분히 유도된 것으로 확인하였다. 전나무 잎 추출물 50 μg/
mL 농도에서의 NO 합성은 22.82 μM로 LPS 처리군(33.12 μM)보다 31.10%로 현저하게 감소하였다(Fig. 7). LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 대한 식물 잎의 NO 생성 억제 효과에 관한 연구로 Kim 등(2018)은 편백나무 잎 열수 추출 물 100 μg/mL 농도에서 18.34 μM로 LPS 처리군(28.00 μM)보다 34.5% 감소한 것으로 보고하였고, Kim과 Lee (2015)는 고추나무 잎 메탄올 추출물 100 μg/mL 농도에서 2.6 μM로 LPS 처리군(20 μM)보다 86% 감소한 것으로 보
고하였으며, Cho(2017)는 잣 잎 에탄올 추출물 25 μg/mL 농도에서 LPS 처리군에 비해 46%의 억제 효과가 있는 것으 로 보고하였다. NO는 nitric oxide synthase(NOS)에 의해 생성되는데 NOS는 염증성 인자인 inducible NOS와 neu- ronal NOS 및 endothelial NOS로 분류된다(Cho, 2017).
NOS는 L-arginine을 L-citrulline으로 전환하면서 NO를 생성하는데 일반적으로 NO는 종양 제거와 외부 침입 박테 리아 사멸 등의 역할을 하지만, 병리학적 원인으로 인하여 과도하게 생성되면 염증 유발 및 유전자 변이, 신경 손상, 조직 손상 등을 유발하게 된다(Kim 등, 2006b). 본 연구 결과 전나무 잎 추출물은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 대해 NO 생성 억제 효과가 있는 것으로 나타났기 때문에 염증조절제로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
iNOS 발현 억제 효과
체내 염증발현 효소인 iNOS에 의해 생성되는 NO는 면역 반응에서 중요한 역할을 하지만, 과량의 NO는 만성 염증 질환을 일으키는 주된 요인이 된다(Woo 등, 2018). 즉 LPS 자극으로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS의 감소는 항 염증 효과를 기대할 수 있는데 iNOS는 바이러스 등의 전염 성 병원체에 대해 방어 역할을 수행하며 암과 순환계 질환 및 염증 질환과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다 (Cho, 2017). 본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과를 확인하였으므로 이러한 효과가 iNOS 발 현 억제에서 기인된 것인지를 확인하기 위하여 western blot을 이용하여 염증 유발인자인 iNOS 발현 억제 효과를 housekeeping gene인 β-actin을 positive control로 사용 하여 측정하였다. 그 결과(Fig. 8) LPS에 의해 증가된 iNOS 단백질 발현량은 전나무 잎 에탄올 추출물에 의해 유의적으 로 감소하였는데(P<0.05), 시료 50 μg/mL 농도에서의 iNOS 단백질 발현량은 80.30%로 LPS로 증가한 단백질 발현량 (100%)보다 19.70%의 억제 효과를 보였다. 헛개나무 잎
iNOS
Actin
LPS (1 μg/mL) - - + + + + + Sample (μg/mL) - - - 12.5 25 50 100
c b b
a ab
d 0 d
20 40 60 80 100 120
% of control .
LPS (1 μg/mL) - - + + + + + Sample (μg/mL) - - - 12.5 25 50 100
Fig. 8. Inhibitory effects of Abies holophylla leaf ethanol extract on the protein level of iNOS in RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells were pre-incubated for 2 h, and the cells were stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of Abies holophylla leaf ethanol extracts for 24 h. iNOS protein levels were determined by immunoblotting method. Results are mean±SD of triplicate data. Different letters (a-d) within a total sample differ signifi- cantly (P<0.05).
메탄올 추출물(Woo 등, 2018)과 고추나무 잎 메탄올 추출 물(Kim과 Lee, 2015), 잣 잎 열수 및 에탄올 추출물은 LPS 의 처리에 의해 증가한 iNOS의 생성을 유의적으로 감소하 였다고 보고되어 있는데(Cho, 2017), iNOS 단백질 발현 억 제는 NO의 생성 억제에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.
본 연구 결과에서 전나무 잎 추출물의 NO 생성 억제능과 iNOS 발현 억제능은 유사한 경향을 보였다. 따라서 전나무 잎 추출물의 NO 생성 억제능은 iNOS 발현 억제에서 기인된 것으로 판단되며 전나무 잎 추출물의 항염증 효과를 확인할 수 있었다.
요 약
본 연구에서는 전나무 잎 에탄올 추출물의 항산화, 항당뇨 및 항염증 효과를 측정하여 기능성 소재로서의 가능성을 확 인하고자 하였다. 전나무 잎 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량을 tannic acid를 표준물질로 사용하여 측정한 결과 188.09 mg TAE/g으로 나타났고 DPPH 라디칼 소거능은 농도 의존적으로 증가하였으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도에 서 89.63%로 높게 나타났다. SOD 활성 또한 농도 의존적으 로 증가하였으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도에서 95.61%로 높게 나타났다. 전나무 잎 에탄올 추출물의 α-glucosidase 저해 활성을 제2형 당뇨병 치료제로 시판되고 있는 acar- bose를 positive control로 하여 측정한 결과 농도 의존적으 로 증가하였으며(P<0.05), 1 mg/mL 농도에서 51.79%로
높게 나타났다. 전나무 잎 에탄올 추출물 1 mg/mL 농도에 서 pH 1.2, 3.0, 6.0에서의 아질산염 소거능은 각각 84.72%, 66.31%, 42.40%로 pH가 낮을수록 아질산염 소거능이 높아 지는 것으로 나타났다(P<0.05). LPS로 유도된 RAW 264.7 세포의 ROS 생성은 전나무 잎 에탄올 추출물 농도 의존적으 로 감소하였는데, 5% 농도에서의 ROS 생성은 189.45%로 LPS 처리군(225.37%)보다 15.94% 감소하였다. LPS로 유 도된 RAW 264.7 세포의 NO 합성은 농도 의존적으로 감소 하였는데(P<0.05), 50 μg/mL 농도에서의 NO 합성은 22.82 μM로 LPS 처리군(33.12 μM)보다 31.10%로 현저하게 감소 하였다. 또한 LPS로 처리한 RAW 264.7 세포에서의 iNOS 단백질 발현량을 측정한 결과 50 μg/mL 농도에서 80.30%
로 LPS 단독 처리구(100%)보다 19.70%의 억제 효과를 보 였다(P<0.05). 이상의 결과에서와 같이 전나무 잎 추출물은 항산화, 항당뇨 및 항염증 효과가 높은 것으로 나타났기 때 문에 기능성 소재로서 산업화를 위한 기초자료를 제공할 것 으로 판단된다.
REFERENCES
Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature. 1958. 181:1199-1200.
Bondet V, Brand-Williams W, Berset C. Kinetics and mecha- nisms of antioxidant activity using the DPPH･ free radical method. LWT. 1997. 30:609-615.
Cho EK, Song HJ, Cho HE, Kim MH, Choi IS, Choi YJ.
Inhibitory effects of ethanol extracts from pine buds (Pinus densiflora) on angiotensin converting enzyme, xanthine oxi- dase and nitric oxide synthesis. J Life Sci. 2009. 19:1629-1636.
Cho YJ. Inhibitory effect of Koreinsis chinensis leaves extract on proinflammatory response in lipopolysaccharide-induced raw 264.7 cells. J Appl Biol Chem. 2017. 60:191-198.
Choi HY, Kim GH. Inhibitory effects of Allium sacculiferum Max. methanol extracts on ROS production and lipid accumu- lation during differentiation of 3T3-L1 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014. 43:822-828.
Choi SW, Lee YJ, Ha SB, Jeon YH, Lee DH. Evaluation of biological activity and analysis of functional constituents from different parts of mulberry (Morus alba L.) tree. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015. 44:823-831.
Gray JI, Dugan LR. Inhibition of N-nitrosamine formation in model food systems. J Food Sci. 1975. 40:981-984.
Gross SS, Wolin MS. Nitric oxide: pathophysiological mecha- nisms. Annu Rev Physiol. 1995. 57:737-769.
Han JH, Moon HK, Chung SK, Kang WW. Comparison of phys- iological activities of radish bud (Raphanus sativus L.) ac- cording to extraction solvent and sprouting period. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015. 44:549-556.
Hanefeld M. The role of acarbose in the treatment of non-in- sulin-dependent diabetes mellitus. J Diabetes Complicat. 1998.
12:228-237.
Jang TW, Park JH. Antioxidant activities and inhibitory effects on oxidative DNA damage of leaf from Zelkova serrata with ethyl acetate fractions and hot water extracts. J Appl Biol Chem. 2016. 59:255-260.
Kang JR, Hwang CR, Sim HJ, Kang MJ, Kang ST, Shin JH.
Biological activities of yellow garlic extract. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015. 44:983-992.
Kang JR, Kang MJ, Shin JH, Park JH, Kim DI, Chung SY, et al. Antioxidant and antidiabetic activities of various solvent extracts from Stachys sieboldii Miq. Korean J Food Preserv.
2017. 24:615-622.
Kang YH, Park YK, Oh SR, Moon KD. Studies on the physio- logical functionality of pine needle and mugwort extracts.
Korean J Food Sci Technol. 1995. 27:978-984.
Kim CS, Kwon OW, Kim SY, Lee KR. Bioactive lignans from the trunk of Abies holophylla. J Nat Prod. 2013. 76:2131-2135.
Kim HR, Park GN, Jung BK, Yoon WJ, Jung YH, Chang KS.
Antioxidative effects of Rhaphiolepis indica and Quercus sal- icina from jeju. J Korean Oil Chem Soc. 2016a. 33:41-50.
Kim JH, Lee JK. Anti-inflammatory effects of Staphylea bu- malda leaves extracts in murine macrophages. Yakhak Hoeji.
2015. 59:251-258.
Kim JH, Lee SO, Do KB, Ji WD, Kim SG, Back YD, et al.
Analysis of the component and immunological efficacy of Chamaecyparis obtusa leaf extract. Korean J Clin Lab Sci.
2018. 50:37-43.
Kim JH, Lee SY, Park JM, Park JH, Kwon OJ, Lee JY.
Antioxidant activity and inhibition activity against α-amylase and α-glucosidase of Juniperus rigida Sieb extracts. Korean J Food Preserv 2014. 21:396-403.
Kim KB, Yoo KH, Park HY, Jeong JM. Anti-oxidative activities of commercial edible plant extracts distributed in Korea. J Korean Soc Appl Biol Chem. 2006a. 49:328-333.
Kim NK, Kim MH, Yoon CS, Choi SW. Studies on the anti-in- flammatory activity of Paulownia coreana Uyeki leaf extract.
J Soc Cosmet Sci Korea. 2006b. 32:241-247.
Kim SH, Lee SY, Cho SM, Hong CY, Park MJ, Choi IG.
Evaluation on anti-fungal activity and synergy effects of es- sential oil and their constituents from Abies holophylla. J Korean Wood Sci Technol. 2016b. 44:113-123.
Kim TH. Antioxidative and biological activities of Santalum al- bum extracts by extracting methods. Korean J Food Preserv.
2008. 15:456-460.
Kroncke KD, Fehsel K, Kolb-Bachofen V. Inducible nitric oxide synthase in human disease. Clin Exp Immunol. 1998. 113:147- 156.
Kwon YR, Cho SM, Hwang SP, Kwon GM, Kim JW, Youn KS. Antioxidant, physiological activities, and acetylcholines- terase inhibitory activity of Portulaca oleracea extracts with different extraction methods. J Korean Soc Food Sci Nutr.
2014. 43:389-396.
Lee BB, Park SR, Han CS, Han DY, Park EJ, Park HR, et al.
Antioxidant activity and inhibition activity against α-amylase and α-glucosidase of Viola mandshurica extract. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2008. 37:405-409.
Lee CE, Jeong HH, Cho JA, Ly SY. In vitro and in vivo anti-oxi- dative and anti-inflammatory activities of Acer tegmentosum Maxim extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2017. 46:1-9.
Lee CY, Yang MH, Mook JO. Antioxidant and hapatoprotective effects of the ethanol extract of Dendropanax morbifera Leveille on the t-butyl hydroperoxide-induced HepG2 cell damages. Kor J Pharmacogn. 2019. 50:32-36.
Lee HJ, Do JR, Kwon JH, Kim HK. Physiological activities of Cucurbita moschata Duch. extracts with different extraction conditions. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2010. 39:165-171.
Lee JE, Kim JH, Kim MY. Changes in phenolic composition, antioxidant and antidiabetic properties of jeju Citrus sudachi as influenced by maturity. J Life Sci. 2015. 25:1311-1318.
Lee JN, Kim HE, Kim YS. Anti-diabetic and anti-oxidative ef- fects of Opuntia humifusa cladodes. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2014. 43:661-667.
Lee SK, Choi DG, Bae YS. A study on the extractives of domes-
tic major softwood needles (Ⅰ)－Antioxidant activity of the extractives from the needles of Abies koreana Maximowicz and Abies holophylla Wilson. Mokchae Konghak. 2006. 34:
73-83.
Lee YJ, Han JP. Antioxidative activities and nitrite scavenging abilities of extracts from Ulmus devidiana. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2000. 29:893-899.
Nam SM, Kang IJ, Shin MH. Anti-diabetic and anti-oxidative activities of extracts from Crataegus pinnatifida. J East Asian Soc Diet Life. 2015. 25:270-277.
Ohshima H, Bartsch H. Chronic infections and inflammatory processes as cancer risk factors: possible role of nitric oxide in carcinogenesis. Mutat Res. 1994. 305:253-264.
Park YS, Jang HG. Lactic acid fermentation and biological ac- tivities of Rubus coreanus. J Korean Soc Agric Chem Biotechnol. 2003. 46:367-375.
Richardson MD, Peterson JR, Clark AM. Bioactivity screenings of plants selected on the basis of folkloric use or presence of lignans in a family. Phytother Res. 1992. 6:274-278.
Seong ES, Kim SK, Lee JW, Choi SH, Yoo JH, Lim JD, et al. Antioxidant and antibacterial activities of the byproducts of Abies holophylla extract. Korean J Med Crop Sci. 2018.
26:134-140.
Silswal N, Singh AK, Aruna B, Mukhopadhyay S, Ghosh S, Ehteshan NZ. Human resistin stimulates the pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-12 in macrophages by NF-κB-de- pendent pathway. Biochem Biophys Res Commun. 2005. 334:
1092-1101.
Singh RK, Nath G, Goel RK, Bhattacharya SK. Pharmacological actions of Abies pindrow Royle leaf. Indian J Exp Biol. 1998.
36:187-191.
Singleton VL, Orthofer R, Lamuela-Raventos RM. Analysis of to- tal phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. Methods Enzymol. 1999.
299:152-178.
Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. 2007.
39:44-84.
van de Lear FA, Lucassen PL, Akkermans RP, van de Lisdonk EH, Rutten GE, van Weel C. α-Glucosidase inhibitors for pa- tients with type 2 diabetes: Results from a cochrane systematic review and meta-analysis. Diabetes Care. 2005. 28:154-163.
Watanabe J, Kawabata J, Kurihara H, Niki R. Isolation and iden- tification of α-glucosidase inhibitors from Tochu-cha (Eucom- mia ulmoides). Biosci Biotech Biochem. 1997. 61:177-178.
Woo HS, Lee SM, Heo JD, Lee MS, Kim YS, Kim DW. Anti-in- flammatory activity of extracts of Hovenia dulcis on lipopoly- saccharides-stimulated RAW264.7 cells. Korean J Plant Res.
2018. 31:466-477.
Xia JH, Li YL, Li SM, Zhu ZJ, Wu L, Yang XW, et al. Two new compounds from Abies holophylla. Phytochem Lett.
2012. 5:446-449.
Yamada T, Yamamoto M, Tanimura A. Studies on the formation of nitrosamines (Ⅶ): The effects of some polyphenols on ni- trosation of diethylamine. J Food Hyg Soc. 1978. 19:224-227.
Yesilada E, Honda G, Sezik E, Tabata M, Fujita T, Tanaka T, et al. Traditional medicine in Turkey. V. Fork medicine in the inner Taurus Mountains. J Ethnopharmacol. 1995. 46:133- 152.
Yoon BR, Lee YJ, Kim SG, Jang JY, Lee HK, Rhee SK, et al. Antioxidant effect of hot water and ethanol extracts from Cheonnyuncho (Opuntia humifusa) on reactive oxygen spe- cies (ROS) production in 3T3-L1 adipocytes. Korean J Food Preserv. 2012. 19:443-450.
