Purification and Characterization of the N-terminally Truncated DNA Polymerase from Thermus thermophilus HJ6

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Thermus thermophilus HJ6 유래 N-말단 결실 DNA Polymerase의 정제 및 특성

전숭종^1,2,3*·서민호¹

1동의대학교 생명공학과, ²동의대학교 바이오물질제어학과, ³동의대학교 블루바이오 RIC

Purification and Characterization of the N-terminally Truncated DNA Polymerase from Thermus thermophilus HJ6. Jeon, Sung-Jong^1,2,3* and Min-Ho Seo¹. ¹Department of Biotechnology & Bioengineering, Dong-Eui University, Busan 614-714, Korea, ²Department of Biomaterial Control, Dong-Eui University, Busan 614-714, Korea, ³Blue-Bio Industry RIC, Dong-Eui University, Busan 614-714, Korea − The gene encoding N- terminally truncated Tod polymerase (∆Tod polymerase) from Thermus thermophilus HJ6 was expressed in Escherichia coli under the control of the lambda pR and pL tandem promoters on the expression vector pJLA503. The N-terminal domain (250 amino acids) of Tod polymerase was removed without significant effect on enzyme activity and stability, while no 5'→3' exonuclease activity was detected. The ∆Tod polymerase was verified to possess very efficient reverse transcriptase (RT) activity in the presence of MgCl₂. The cDNA can also be amplified in the polymerase chain reaction (PCR) with this mutant enzyme. The ∆Tod polymerase was exhibited higher activity than the Taq polymerase in a one-step RT-PCR.

Key words: DNA polymerase, RT-PCR, Thermus thermophilus, PCR, exonuclease

서 론

RNA 분자의 분석과 검출에 대한 표준 방법에는 in situ hybridization, northern, dot, slot blot analysis, S1 nuclease analysis 및 RNase protection assay 등이 있다. 그러나 이들 방법은 많은 양의 RNA를 필요로 하거나 분석 방법상에 어 려움이 있기 때문에 활용 면에서 제한을 받을 수 있다. 이들 문제의 해결방안으로 DNA를 증폭하는 PCR 기술은 avian myeloblastosis virus reverse transcriptase(RTase) 또는 moloney murine leukemia virus(M-MLV) RTase과 같은 역 전사효소의 등장과 더불어 RNA를 주형으로 DNA를 증폭하 는 Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT- PCR) 기술로 발전하였다[4, 7]. RT-PCR 기술은 유전자 발 현의 검출[7], 증폭된 RNA 서열 분석[13], 유전병과 감염원 의 진단[5] 등에 활용되고 있다.

역전사 반응에서는 안정한 2차 RNA 구조에서의 cDNA 합성과 primer 신장의 특이성을 향상시키기 위해 고온에서 의 RT 반응이 요구되었고 이런 이유로 내열성 역전사 효소 의 필요성이 인식 되었다[1]. PCR의 출현 후 Taq poly- merase의 역전사 활성을 이용하여 mRNA로부터 한번에 PCR까지 수행하는 방법이 보고되었다[12]. 그러나 증폭에는 다량(1~5 µg)의 RNA가 필요하기 때문에 실용적이지 않았

다. 그 후 Tth polymerase과 같은 강한 역전사 활성이 있는 효소가 발견되어 one-step RT-PCR이 실용화되었다[9]. Tth polymerase는 금속이온 Mn²⁺가 존재하면 강한 역전사활성 을 나타내기 때문에 MnCl2존재 하에서 역전사 반응을 실 시하고, EGTA로 킬레이트한 후 MgCl2를 첨가해 PCR을 실 시하는 방법이 이용되고 있다[9]. 최근, 우리들은 새로운 고 온균 Thermus thermophilus HJ6 균주를 분리하고 이 균주 의 DNA polymerase(Tod polymerase) 유전자의 클로닝 및 대장균에서의 발현에 대해 보고한 바 있다[10]. Tod polymerase 유전자는 5'→3' exonuclease domain과 5'→3' polymerase domain을 포함하는 834개의 아미노산으로 구성된다.

DNA polymerase는 dNTP가 없는 상태에서 선상 DNA 단 편과 함께 존재하면 단편을 분해하는 exonuclease 활성을 나 타내기 때문에 PCR 반응에 있어서는 불리한 반응이다.

본 연구에서는 Tod polymerase에서 5'→3' exonuclease 활성을 나타내는 N-말단 영역의 250개 아미노산을 결실시 킨 ∆Tod polymerase를 대장균에서 발현정제하여 그 특성을 분석하고 RT-PCR에의 적용을 시도하였다.

재료 및 방법 균주 및 플라스미드

본 연구에 사용된 Thermus thermophilus HJ6 균주는 일 본의 아리마(Arima) 온천수에서 분리한 것을 사용하였고[10], ATCC medium 697(8 g polypeptone, 4 g yeast extract, 4 g/L NaCl, pH 7.5)을 사용하여 80^oC에서 배양 하였다. 대장

*Corresponding author

Tel: 82-2-51-890-2278, Fax: 82-2-51-890-2632

E-mail: [email protected]

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균 DH5α와 BL21(DE3) codon plus(Novagen, Inc., San Diego, CA, USA)는 각각 클로닝 및 유전자 발현을 위한 균 주로 사용하였다. 플라스미드 pJLA503은 일본 오사카 대학 의 Kanaya연구실에서 분양 받은 것으로 단백질 발현을 위 해 사용하였다.

∆Tod polymerase의 생산 및 정제

Tod polymerase 유전자에서 N 말단의 250 아미노산에 해 당하는 유전자를 결실하기 위하여 Tod polymerase 유전자 가 삽입된 플라스미드 pGEMTOD를 주형으로 Primer 1(5'- GGCTCTCCCATATGCGCACCGACC-3', 밑줄은 Nde I 부 위)과 Primer 2(5'-TGGAATTCCTAACCCTTGGCGGAA- 3', 밑줄은 Eco RI 부위)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 증 폭된 1.75 kb의 DNA 단편은 Nde I과 Eco RI으로 절단한 후 같은 효소로 절단한 pJLA503 벡터에 연결하고 E. coli DH5α에 형질전환 하였다. 클로닝 된 plasmid를 pJTODexo 로 명명하고 E. coli BL21(DE3) codon plus에 다시 형질전 환한 후 2×YTA 배지(tryptone 16 g/L, yeast extract 10g/

L, NaCl 5 g/L, ampicillin 100 µg/mL)에서 30ôC로 20시 간 전배양 하였다. 전배양액의 1%를 새로운 2×YTA 배지에 접종한 후, 흡광도(A600)가 0.6이 되었을 때 42ôC로 온도를 올려 5시간 동안 유도배양 하였다. 배양된 균체는 원심분리 를 통하여 집균하고 buffer A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM dithiothreitol)에 녹인 다음 초음파로 파쇄 하였다. 초음 파 파쇄 후 세포추출물은 80ôC에서 20분간 열처리한 후 원 심분리 하여 상등액을 회수하였다. 상등액은 ÄKTAprime(GE Healthcare)을 이용하여 buffer A로 평형화시킨 HiTrap Heparin column(GE Healthcare)에 로딩한 후 0~1.0 M의 NaCl로 농도구배를 주어 결합된 단백질을 용출하였다. 용출 된 단백질의 정제도는 SDS-PAGE(10% acrylamide gel)를 통하여 확인하였고, 전기영동 밴드는 coomassie 염색으로 확 인하였다.

Exonuclease 활성 측정

5' 말단이 표식된 DNA 기질을 만들기 위하여 PCR 반응 으로 2.5 kb의 Tod polymerase 유전자를 증폭하고 [γ-

32P]ATP와 T4 polynucleotide kinase를 이용하여 5' 말단을 인산화하였다. 3' 말단 표식을 위해서는 pET-21a 플라스미 드를 제한효소 Not I으로 절단하고 [α-³²P]dCTP와 Klenow fragment를 이용하여 돌출말단을 수복하였다. 방사능 표식된 DNA 기질은 50 mM Tris-HCl(pH 8.5), 3 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.001% BSA 및 정제된 ∆Tod polymerase의 반 응 혼합액(50 µL)과 함께 75^oC에서 반응하였다. 반응은 5%

trichloroacetic acid 1 mL을 첨가하여 정지시키고 원심 후 상등액을 회수하여 방사능 활성을 측정하였다[11].

Two-step RT-PCR 반응

2단계 역전사 반응은 PrimeScript^TM RT-PCR kit(Takara, Japan)를 사용하여 제조사에서 제시한 방법을 약간 변형하여 수행하였다. 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.1 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂ 또는 MnCl2, oligo dT primer, 5 unit ∆Tod polymerase, plasmid pSPTet3 유래 RNA template의 다양한 양(5~250 ng)을 포함하는 혼합액 (20 µL)을 65ôC에서 5분간 반응한 후, 60ôC에서 30분간 역 전사 반응을 수행하였다. 반응 후 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 0.2 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂, 0.001% BSA, 0.1% Triton X-100, 50 pM F-1 primer (5'-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3'), 50 pM R-1 primer (5'-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3')를 포함하는 PCR 혼합액(80 µL)을 첨가하고 DNA Thermal cycler(Takara, Japan)를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조건은 95ôC, 5분간의 변성단계를 거쳐 94ôC에서 30초, 60ôC에서 30초, 72ôC에서 1분간을 30회 반복 수행하고 72ôC에서 5분 간 마지막 신장반응을 수행하였다. PCR 반응액(5 µL)은 1.5% agarose 전기영동을 통하여 분석하였다. ∆Tod poly- merase의 DNA polymerase 활성은 최 등[3]의 방법에 따라 실시하였고 효소활성의 1 unit은 75ôC에서 10분간 1 pmol 의 DNA를 합성하는 것으로 정의하였다.

One-step RT-PCR 반응

역전사 반응과 PCR 반응을 단일 튜브에서 수행하는 one- step RT-PCR 반응은 다음과 같은 방법으로 실시하였다. 20 mM Tris-HCl(pH 8.8), 0.25 mM dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 2 mM MgCl₂, 0.001% BSA, 0.1% TritonX-100, 50 pM 16s-F primer(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'), 50 pM 16s-R primer(5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'), 10 unit

∆Tod polymerase, E. coli DH5α 유래 total RNA template 의 다양한 양을 포함하는 혼합액(100 µL)을 65^oC에서 5분 간 반응한 후, 60^oC에서 30분간 역전사 반응을 수행하였다.

여기서 16s-F와 16s-R primer는 대장균의 16s rDNA를 증 폭할 수 있는 공통 염기서열을 바탕으로 설계하였다.

Thermal cycler(Takara, Japan)를 사용하여 95ôC, 2분간의 변성단계를 거쳐 94ôC에서 30초, 65ôC에서 30초, 72ôC에서 1분간을 30회 반복 수행하고 72ôC에서 5분간 마지막 신장 반응을 수행하였다. Taq polymerase(Takara, Japan)를 사용 한 RT-PCR 반응은 제조사에서 제공된 buffer, 50 pM 16s- F primer, 50 pM 16s-R primer 및 total RNA를 혼합하고 위 와 동일한 방법으로 반응하였다. RT-PCR 반응액(5 µL)은 1.5% agarose 전기영동을 통하여 분석하였다. 증폭된 DNA 단 편은 densitometry(Gel-Pro Analyzer 3.1, MediaCybernetics, MD, USA)를 사용하여 정량 분석하였다.

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결과 및 고찰

∆Tod polymerase의 생산

Tod polymerase 유전자는 Taq DNA polymerase와 유사 하게 2가지 domain으로 구성된다. 첫 번째는 5'→3' exonuclease domain이고 두 번째는 5'→3' polymerase domain 이다. DNA polymerase의 5'→3' exonuclease 활성은 PCR 반응에서 프라이머를 분해하는 등의 저해 요인으로 작용한 다. Taq DNA polymerase의 경우 N-말단의 289 아미노산에 해당하는 유전자를 결실시켜 중합 활성과 안정성에는 큰 영 향을 미치지 않고 5'→3' exonuclease을 성공적으로 제거하 였다[8]. 또한 Tfi DNA polymerase에서도 N-말단의 283 아 미노산을 결실시켜 동일한 효과를 나타낸다고 보고된 바 있 다[2]. 본 연구에서는 Tod polymerase 유전자에서 5'→3' exonuclease 활성에 관여하는 부분(개시코돈에서 750 bp)이 결실된 Tod 유전자를 발현 벡터 pJLA503에 클로닝하고 plasmid pJTODexo로 명명하였다. 효소 생산을 위한 숙주로 는 E. coli BL21(DE3) codon plus 균주를 사용하였다. Tod polymerase 유전자에는 대장균에서 잘 사용되지 않는 rare codon을 다수 가지고 있기 때문에 rare tRNA 합성효소가 보 강된 codon plus 균주를 사용하였다. Plasmid pJTODexo로 E. coli BL21(DE3) codon plus를 형질전환하고 30ôC에서 배양하여 세포성장이 600 nm에서 흡광도가 0.5~0.6에 도달 하였을 때 온도를 42ôC로 올려 단백질의 생산을 유도하였 다. 배양한 세포를 초음파로 파쇄하고 80ôC에서 20분간 열 처리한 후, DNA-binding protein에 친화력을 가지는 HiTrap Heparin column(GE Healthcare)을 이용하여 한 단계로 순수 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 약 66 kDa 부위에서 ∆Tod polymerase의 밴드가 확인되었다 (Fig. 1, lane 3). 이 밴드의 분자량은 N 말단을 제거한 아미 노산 서열에서 계산된 분자량(65,645 Da)과도 잘 일치하였다.

∆Tod polymerase의 exonuclease 활성

DNA polymerase는 dNTP가 없는 상태에서 선상 DNA 단편과 함께 존재하면 DNA 단편을 분해하는 exonuclease 활성을 나타낸다. N-말단 250개의 아미노산을 결실한 ∆Tod polymerase의 경우 5'→3' exonuclease 활성을 나타내지 않 았다(Fig. 2). 반면, 야생형 Tod polymerase[8]의 경우 30분 만에 기질 DNA로부터 87%의 인산기를 제거하는 exonuclease 활성을 나타내었다(Fig. 2). 이 결과는 ∆Tod poly- merase에서 5'→3' exonuclease 활성이 완전히 제거 되었다 는 것을 의미한다. 한편, 야생형과 결실 변이형 Tod poly- merase는 모두 3'→5' exonuclease 활성에 대해서 거의 활성 을 보이지 않았다(data not shown). 이 결과는 Thermus filiformis 유래 DNA polymerase에서 보고한 것과도 일치하 였다[2].

∆Tod polymerase의 RT-PCR 조건

내열성 DNA polymerase의 역전사 반응에 대한 활성은 cDNA 합성에 대해 이온의 종류와 이온강도에 영향을 받는 것으로 조사된 바 있다[6]. 본 실험에서는 ∆Tod polymerase 의 역전사 활성을 조사하기 위하여 각기 다른 양(5~250 ng)

Fig. 1. Purification of ∆Tod polymerase. Lane M, molecular mass marker; lane 1, crude extract induced cells; lane 2, superna- tant of crude extract after heat treatment at 80

^o

C for 20 min; lane 3, Heparin column peak fractions. The gel was stained with coo- massie brilliant blue.

Fig. 2. Comparison of the 5' →3' exonuclease activity of ∆Tod

polymerase with that of Tod polymerase. The 5' →3' exonu-

clease activity of ∆Tod polymerase (

○

) and Tod polymerase (

_●

)

was assayed in the absence of dNTPs. AR-RA, radioactivity of

supernatant solution after reaction; BR-RA, radioactivity of the 5'

end-labeled DNA substrate before reaction.

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의 RNA 주형과 Mg²⁺및 Mn²⁺이온을 반응액에 첨가하여 역전사 반응을 수행하고, 생성된 cDNA를 주형으로 PCR 반 응을 수행하였다. 그 결과 Mg²⁺의 존재 하에서는 5, 20, 50, 250 ng을 주형 RNA로 사용한 반응에서 모두 cDNA 단편 이 강하게 증폭되었지만, Mn²⁺존재 하에서는 모든 반응에 서 매우 약한 cDNA 단편의 증폭이 확인되었다(Fig. 3). 그 러나 본 효소와 98.5%의 상동성을 보이는 Thermus

thermophilus HB8유래의 Tth DNA polymerase[9]는 역전 사 반응에서 MnCl2이 존재할 경우 효율적인 역전사 반응을 수행하여 본 연구의 결과와는 대조적인 모습을 나타내었다.

이것은 Tod polymerase의 N-말단을 제거한 것에 따른 단백 질의 구조적인 변화에 기인할지도 모른다. 이와 같이 기존 의 Tth DNA polymerase는 역전사 반응에서 사용한 MnCl2

를 킬레이트한 후 PCR 반응을 수행해야 하지만, ∆Tod polymerase는 Mg²⁺존재 하에서 역전사 반응과 PCR 반응 을 함께 수행할 수 있기 때문에 one-step RT-PCR 반응에 대 해 매우 실용적일 것으로 생각된다.

∆Tod polymerase의 one-step RT-PCR에 대한 적용 One-step RT-PCR에서는 역전사 반응과 PCR 반응을 같은 tube 내에서 연속해서 실시하기 때문에 조작이 간편하고 sample간에 오염의 위험이 낮다. 한편, 역전사 반응과 PCR 을 각각 최적인 조건으로 실시할 수 없기 때문에, 실험에 따 라 Two-Step RT-PCR 보다 반응 효율이 낮을 수도 있다. 본 실험에서는 Mg²⁺존재 하에서 ∆Tod polymerase가 one-step RT-PCR 반응에 적합한지를 시험하였다. 실험 대상으로 2차 구조를 취하기 쉬운 rRNA를 대상으로 one-step RT-PCR을 실시한 결과, Fig. 4에서와 같이 기존의 Taq polymerase를 사용한 반응에서는 50, 100, 250 ng의 RNA 농도에서만 cDNA가 증폭된 반면, ∆Tod polymerase의 one-step RT- PCR 반응에서는 5, 20, 50, 100, 250 ng의 모든 RNA 농도 에서 cDNA가 증폭하여, 미량의 RNA에서도 높은 효율의 RT-PCR 결과를 나타내었다. 대장균의 total RNA를 주형으 로 사용한 one-step RT-PCR에서는 plasmid를 주형으로 사 용한 two-step RT-PCR 보다 주형의 양이 상대적으로 적기

Fig. 3. Analysis of RT-PCR products for optimal RT-PCR con-

dition. The cDNA synthesis was performed in a 20 µL reaction mixture containing 2 mM MgCl

₂

or MnCl

₂

. The amounts of pSPTet3 cRNA used for cDNA synthesis are indicated at the top.

PCR was performed as described in the Materials and methods section. A 5 µL sample of each mixture was subjected to electro- phoresis on 1.0% agarose gel and stained with ethidium bromide.

Lane M, 100 bp DNA ladder markers.

Fig. 4. Reverse transcription and PCR amplification by either ∆Tod pol or Taq pol. The cDNA synthesis and amplification with

primer pair 16s-F/16s-R and total RNA of E. coli DH5α were performed as described in materials and methods section. ∆Tod polymerase

or Taq polymerase were used for both cDNA synthesis and PCR amplification from 5, 20, 50, 100, 250 ng of RNA. A 5 µL sample of each

mixture was subjected to electrophoresis on 1.0% agarose gel and stained with ethidium bromide. Lane M, λ Hind III markers.

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때문에 DNA 증폭율이 감소하는 결과를 나타냈다(Fig. 3, 4).

One-step RT-PCR은 2차 구조를 취하기 쉬운 rRNA를 sample로 사용하는 경우와 RNA 바이러스 검출 등의 검사 시 오염의 방지가 최우선 되는 경우에 매우 유용하기 때문 에 ∆Tod polymerase는 이와 같은 시료의 RT-PCR 반응에 적용할 수 있을 것으로 생각된다.

요 약

고온균 Thermus thermophilus HJ6 유래의 N-말단 결실 Tod polymerase(∆Tod polymerase)는 온도 감수성 프로모터 (lambda pR and pL)를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하여 대장균에서 발현하였다. N-말단 250개 아미노산이 제거된

∆Tod polymerase는 5'→3' exonuclease 활성은 없어지고 DNA 중합반응의 활성은 그대로 유지되었다. ∆Tod poly- merase는 MgCl2의 존재 하에서 매우 효율적으로 역전사 반 응과 PCR 반응을 수행하였다. 또한 ∆Tod polymerase는 one-step RT-PCR 반응에서 Taq polymerase 보다 높은 cDNA 증폭 효율을 나타내었다.

감사의 글

이 논문은 2009학년도 동의대학교 교내연구비에 의해 연 구 되었음(과제번호 2009AA193).

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