생약재 추출 조성물의 항산화 및 간 보호 활성 조아로

생약재 추출 조성물의 항산화 및 간 보호 활성

조아로․김동규․강재란․강민정․신정혜 (재)남해마늘연구소

Antioxidant and Liver Protecting Activity of Combined Extracts of Medicinal Herbs

A-Ro Cho, Dong-Gyu Kim, Jae-Ran Kang, Min-Jung Kang, and Jung-Hye Shin Namhae Garlic Research Institute

ABSTRACT This study investigated the anti-oxidative and hepato-protective activities of extracts from six kinds of medicinal herbs (Acer tegmentosum Maxim., Artemisia argyi H., Puerariae lobata Ohwi, Taraxacum officinale, Curcuma longa L., Hovenia dulcis fruits). Further, these six herbs were selected according to a literature review, and their compositions were also investigated. Based on the results of the total phenolic compound contents, the anti-oxi- dative activity [1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) radi- cal scavenging activity, and ferric-reducing antioxidant power (FRAP)], and the NO and reactive oxygen species in- hibitory activity of the water and 30% ethanol extracts of each sample, four species were selected (except H. dulcis fruit and C. longa L.). All four of the selected species had higher activity than that of the H. dulcis and C. longa L.. Eleven kinds of compositions were then prepared (samples A to K that had different composition ratios of the four selected herbs). The contents of total phenolic compounds were highest at 72.88 mg/g in G and lowest at 59.44 mg/g in K. The anti-oxidative activities of the B, F, G, and I compositions were analyzed, and these four compositions had relatively high levels of total phenolic compounds. The DPPH radical scavenging activity of G was 77.32% at the concentration of 500 μg/mL, and that of FRAP was the highest at 623.23 μM at the same concentration, and the activity of β-carotene decoloring inhibition was also highest at 80.97%. The AST and ALT activities of the composi- tions within the concentration range of 100∼500 μg/mL were significantly different from those of the positive control.

Key words: herbal medicines, antioxidative activity, extract composition, AST, ALT

Received 18 July 2019; Accepted 11 October 2019

Corresponding author: Jung-Hye Shin, Namhae Garlic Research Institute, Namhae, Gyeongnam 52430, Korea

E-mail: [email protected], Phone: +82-55-860-8947

서 론

간은 알코올, 약물, 화학물질 및 여러 가지 환경오염 물질 등이 유입되면 생체대사를 통해 이들을 이물질로 인식하여 체외로 배설시킴으로써 무독화하려는 방어체계를 가동시 키는 주요 기관이다(Ha 등, 2005). 정상적인 간 기능의 유지 는 영양소의 대사, 글리코겐과 지용성 비타민의 저장, 혈액 에서의 노폐물과 독성물 제거, 혈액응고 인자의 합성, 혈액 량 조절 등의 체내 저장과 항상성 유지를 위한 중심 활동이 되지만 지방 함량이 높은 음식이나 알코올의 과다섭취, 바이 러스에 의한 감염, 약물, 흡연, 공해물질 등 환경적 인자와 정신적 스트레스는 간 기능의 장애를 유발할 수 있고, 이로 인해 인체 방어, 해독 능력이 저하되면 면역체계의 이상을 유발하여 다른 질병의 원인이 되기도 한다(Kim, 2019; Lee 등, 2011). 따라서 다양한 손상의 원인으로부터 체내 주요

장기인 간의 기능을 유지, 보호하기 위한 다양한 연구들이 진행되고 있으며, 천연 약용 자원들은 대표적인 소재로 활용 되고 있다.

간 보호에 이용되는 대표적인 천연 식물 소재로 헛개나무, 갈화, 갈근, 구기자, 벌나무, 민들레, 울금 및 섬애약쑥 등이 알려져 있는데, 갈근(

Pueraria lobata

Acer tegmentosum

Hovenia dulcis

Taraxacum

officinale

Table 1. Composition ratio of medicinal herb extracts for preparation of mixture

Samples (Korean name) Mixing ratio

A B C D E F G H I J K

Acer tegmentosum Maxim. (벌나무) Artemisia argyi H. (섬애약쑥) Pueraria lobata Ohwi (갈근) Taraxacum officinale (민들레)

1 1 1 1

2 1 1 1

1 2 1 1

1 1 2 1

1 1 1 2

2 2 1 1

2 1 2 1

2 1 1 2

1 2 2 1

1 2 1 2

1 1 2 2 용되며 민들레의 리놀산과 콜린성분은 심장병, 고혈압, 간

질환에 효과가 있다(Kim, 1998). 민들레즙은 건강한 성인 남자를 대상으로 알코올 섭취 후 산화적 스트레스 및 숙취에 미치는 효과를 확인한 결과 민들레에 포함되어 있는 유효 물질이 숙취해소와 간 기능 보호 및 항산화 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Noh 등, 2009). 울금(

Curcuma longa

pylori

Artemisia argyi

이러한 천연 식물류는 한방이나 민간에서 생약재로 이용되 며, 단독으로 사용하기보다는 관능의 개선이나 기능성 향상을 위해 조성물로 이용되는 빈도가 높음에도 불구하고 각각의 소재에 대한 연구는 활발하지만 조성물을 대상으로 하는 연 구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 기능성 식품소 재 개발을 위한 기초 연구의 일환으로 문헌 조사를 통해 간 보호 활성이 있는 소재 5종을 선발한 후 기초 생리활성을 분석한 결과를 토대로 소재 간 혼합 비율을 달리한 조성물을 제조하여 항산화 활성과 간 보호 활성을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

실험재료 및 시료의 제조

문헌조사와 한의사의 자문을 통하여 간 보호 활성이 있는 것으로 알려진 갈근, 벌나무, 헛개나무 열매, 민들레, 울금 및 섬애약쑥을 시료로 선정하였다. 각각 선정된 재료는 진주 시내 한약재료상에서 건조된 상태의 것을 구입하여 사용하 였으며, 섬애약쑥은 남해섬애약쑥영농조합법인으로부터 제 공받아 사용하였다.

각각의 재료는 길이 5 cm 내외로 절단한 후 각각의 무게 대비 10배의 물과 30% 주정을 가한 다음 80°C에서 3시간 추출한 것을 여과하였다. 30% 주정 추출물은 회전식진공농 축기(N-1200A, EYELA, Tokyo, Japan)를 이용하여 에탄 올과 용매를 제거하였으며, 물 추출물은 동결건조 하여 분말

화한 것을 시료로 사용하였다.

개별 분석된 식물 추출물의 분석 결과를 활용하여 상대적 으로 활성이 우수한 소재 4종(갈근, 벌나무, 민들레, 섬애약 쑥)을 선발하여 각각의 추출 분말을 Table 1과 같은 비율에 따라 무게비로 혼합한 조성물 11종에 3차 증류수를 가하여 해당 농도로 만들어 실험에 사용하였다.

추출수율 및 가용성 고형분 함량

추출수율은 추출물을 여과한 후 용매를 모두 제거한 다음 잔여물의 무게를 시료의 무게로 나눈 값을 백분율(%)로 나 타내었다.

가용성 고형분은 추출 후 여과한 시료액을 일정량 취하여 자동굴절당도계(PR-201α, Atago, Tokyo, Japan)로 3회 반복 측정하였다.

총 페놀화합물 및 플라보노이드의 함량

총 페놀화합물의 함량은 페놀성 물질인 phosphomolyb- dic acid와 반응하여 청색을 나타내는 원리로 Folin-Denis 방법(Gutfinger, 1958)을 이용하였다. 시료액 2 mL에 Folin- Ciocalteu 시약(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 1 mL를 넣고 3분 후 10% Na₂CO₃(Daejung, Siheung, Ko- rea) 용액 1 mL씩을 가한 다음 혼합하여 실온의 암실에서 1시간 정치한 후 분광광도계(Libra S 35, Biochrom, Cam- bridge, UK)로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물 질로 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 총 페놀화 합물의 함량을 계산하였다.

플라보노이드 함량 분석은 시료액 1 mL에 10% alumi- num nitrate 0.1 mL, 1 M potassium acetate 0.1 mL 및 ethanol 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합한 후 실온의 암실에 서 40분간 반응시켜 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표 준물질은 quercetin(Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 시료 와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 검량선으로부터 플라보 노이드 함량을 산출하였다.

DPPH 라디칼 소거 활성

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거 활 성은 DPPH에 대한 전자공여 활성으로 나타낸 것으로 시료 의 항산화 활성이 높을수록 보라색의 시약이 탈색되는 원리 를 이용한 것이다. 에탄올로 1.5×10^-4 M 농도가 되도록 조 절한 DPPH 용액 100 μL와 시료 100 μL를 혼합한 후 실온

에서 20분간 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 525 nm 에서 흡광도를 측정하여 시료 무첨가구에 대한 시료 첨가구 의 흡광도비로 계산하여 %로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거 활성

7 mM 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sul- fonate)(ABTS) 용액에 potassium persulfate를 2.4 mM이 되도록 용해시킨 후 암실에서 12~16시간 동안 반응시킨 다 음 415 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 희석하였 다. 이 용액 100 μL에 농도별 생약재 추출액을 100 μL 가하 여 실온에서 5분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정 하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 시료 첨가구와 무첨가구 의 흡광도 비로 나타내었다.

환원력(ferric-reducing antioxidant power, FRAP)

Linoleic acid 반응계에서 탈색방지 효과

Linoleic acid 반응계에서 탈색방지 활성 측정은 β-car- otene 10 mg을 chloroform 10 mL에 용해시킨 후 linoleic acid 40 mg 및 tween-40 400 mg을 혼합하고 40°C에서 감압 농축(N-1200A, EYELA)하여 chloroform을 제거하 였다. 잔류 emulsion에 100 mL의 3차 증류수를 가하여 기 질액으로 사용하였다. 농도별 시료액 50 μL를 기질액 200 μL와 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조 구는 시료 대신 증류수를 사용하였다. 결과 값은 계산식 [1

－(시료구 감소율/대조구 감소율)]×100을 사용하여 표기 하였다.

대식세포와 간암세포 증식에 대한 세포 독성 측정

을 이용하여 측정하였다.

Raw 264.7 세포에서 NO 생성 억제 활성 평가

세포로부터 생성되는 NO의 양은 Giustarini 등(2008)의 방법을 응용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO^2-를 Griess reagent로 측정하였다. Griess reagent는 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 NO의 농도와 일치하기 때문에 아조염의 농도로부터 NO 생성 정도를 확 인할 수 있다. 다양한 농도의 시료(100, 150, 200, 400 μg/

mL)를 각 well에 처리한 다음, 30분 후에 LPS 1 μg/mL를 처리하여 37°C, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양한 후 세포 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액 중 100 μL를 취 해 Griess reagent 100 μL와 혼합하여 상온에서 10분간 반 응시킨 후 microplate reader(Epoch, BioTek, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

NO 생성 억제 활성은 LPS 단독 처리군 대비 시료 처리군의 NO 생성량을 비교하여 상대적인 값으로 나타내었다.

세포 내 활성산소종 소거 활성

세포 내 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 소 거 활성은 intracellular ROS assay kit(Cell Biolabs, Arions, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 96-well black plate에 5×10⁴ cells/well의 Raw 264.7 cell을 분주한 후 배양하여 세포를 well에 부착시켜 serum free DMEM 배지 로 교환하였다. 세포를 24시간 배양한 후 각 시료를 농도별 로 처리하여 37°C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다.

PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 다음 1×dichloro-dihydro- fluorescein diacetate(DCFH-DA)를 배지에 100 μL 첨가 하여 37°C, 5% CO2에서 1시간 배양한 후 다시 PBS로 3회 씻어냈다. Lysis buffer 100 μL를 첨가하여 혼합한 후 fluo- rescence microplate reader(VICTOR3™ Multilabel Plate Reader, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Shel- ton, CT, USA)를 이용하여 excitation 485 nm, emission 535 nm에서 형광을 측정하여 LPS 단독 처리군과 시료 처리 군에 대한 ROS 생성을 비교하여 상대적인 값으로 나타내었 다.

ALT와 AST 활성 측정

LPS 처리를 통한 간세포 독성 유도 실험과 같은 방법으로 시료를 처리한 후 배양액을 취해 배양액 중에 유리된 ala- nine transaminase(ALT)와 aspartate transaminase(AST) 효소의 활성을 측정하였다. ALT와 AST의 활성은 각각의 측정용 시액(Asan Pharmaceutical Co., Seoul, Korea)을 구입하여 사용하였다. ALT와 AST 활성은 기질액인 L-as- partic acid와 DL-alanine 1 mL에 배양액 0.2 mL를 가해 잘 혼합한 후 37°C에서 AST는 60분, ALT는 30분간 항온 하였다. 정색시약 1 mL를 가하고 잘 혼합하여 실온에서 20 분간 보관한 후 0.4 N NaOH를 10 mL 첨가하여 10분간

Table 2. Yields and soluble solids of medicinal herb extracts with different extraction solvents

Sample (Korean name) Yields (%) Soluble solids (brix)

Water 30% EtOH Water 30% EtOH

Pueraria lobata Ohwi (갈근) Acer tegmentosum Maxim. (벌나무) Hovenia dulcis fruits (헛개나무 열매) Taraxacum officinale (민들레) Curcuma longa L. (울금) Artemisia argyi H. (섬애약쑥)

12.34 4.29 12.46 16.82 8.21 16.92

18.67 4.93 17.21 21.12 5.39 17.80

3.40±0.00^e 0.63±0.06^a 1.63±0.06^c 1.20±0.10^b 1.60±0.00^c 3.20±0.10^d

14.67±0.06^f 14.27±0.06^c 12.13±0.06^b 11.70±0.00^a 14.50±0.00^e 14.37±0.06^d Each value represents mean±SD (n=3).

Means with different letters (a-f) in the same solvent are significantly different at P<0.05.

Table 3. Total phenolic compounds and total flavonoids contents of medicinal herb extracts with different extraction solvents (mg/g)

Water 30% EtOH Water 30% EtOH

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

71.73±0.13^c 93.17±1.90^e 12.06±0.13^a 29.51±0.60^b 13.45±0.20^a 89.17±0.54^d

79.61±0.56^c 142.19±0.86^e 16.64±0.02^a 40.74±0.32^b 16.73±0.31^a 96.70±0.26^d

16.80±0.61^c 14.92±0.13^b 0.10±0.05^a 14.29±0.41^b 0.06±0.02^a 68.29±0.54^d

19.23±0.16^b 18.21±0.80^b 1.04±0.02^a 35.63±0.89^c 0.93±0.08^a 74.36±0.09^d Each value represents mean±SD (n=3).

Means with different letters (a-e) in the same solvent are significantly different at P<0.05.

정치하고 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. AST 활성은 표준곡선을 이용하여 Karmen unit으로 나타내었다. ALT와 AST의 활성 비교를 위하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 대비한 시료 처리군의 활성을 비교하여 백분율로 나타내었 다.

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복하여 실시하였으며 실험으로 부터 얻은 결과는 PASW statistics 18(IBM Corp., Ar- monk, NY, USA)을 사용하여 분석하였다. 결과치는 실험군 당 평균±표준편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검정은 일 원배치 분산분석(one-way analysis of variance)을 한 후

P

결과 및 고찰

선정된 생약재 시료별 추출수율 및 가용성 고형분 함량

반면 민들레는 물 추출물의 수율은 16.82%인데 반해 30%

주정 추출물의 수율은 21.12%로 시료 중 수율이 가장 높았 고, 추출용매에 따른 수율의 차이도 가장 컸다.

Han 등(2010)은 서양민들레(

Taraxacum officinale

본 연구 결과보다 수율이 더 높았는데 이는 생약재의 추출수 율은 시료 간에 차이가 크고 추출용매와 시료와의 비율, 추 출용매의 종류, 추출온도 및 시간 등 여러 조건에 따라 달라 질 수 있어(Shin 등, 2018) 차이를 보이는 것으로 판단된다.

물 추출물의 가용성 고형분 함량은 0.63~3.40 brix인데 반해 30% 주정 추출물은 11.70~14.67 brix로 최고 10배 이상 차이가 있었다. 물 추출물의 경우 갈근과 섬애약쑥이 각각 3.40과 3.20 brix로 가장 높았으며, 30% 주정 추출물 의 경우 헛개나무 열매와 민들레에서 각각 12.13과 11.70 brix로 여타 시료(14.27~14.67 brix)에 비해 유의적으로 낮 았다.

선정된 생약재 시료별 총 페놀화합물 및 플라보노이드 함량

추출용매를 달리하여 제조한 생약재 6종 추출물 중의 페 놀화합물과 플라보노이드 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같다. 총 페놀화합물의 함량은 시료마다 차이가 있기는 하지 만 물 추출물보다는 30% 주정 추출물에서 그 함량이 더 높 은 경향이었다. 총 페놀화합물의 함량이 가장 낮은 헛개나무 열매 추출물의 경우 물 추출물과 30% 주정 추출물에서 각각 12.06 mg/g과 16.64 mg/g으로 추출용매에 따른 함량의 차 이가 미미하였으나 가장 함량이 높은 벌나무의 경우 물 추출 물에서는 93.17 mg/g, 30% 주정 추출물에서는 142.19 mg/

g으로 약 1.5배 더 높은 함량이었다. 물 추출물에서 총 페놀

Table 4. DPPH radical scavenging activity of medicinal herb extracts with different extraction solvents

250 500 1,000

Water

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

30.68±1.85^aC 71.66±3.34^aF 11.97±2.08^aB 37.62±1.59^aD 1.31±0.85^aA 67.13±0.57^aE

45.34±0.81^bC 74.45±0.23^abF 16.27±0.99^bB 53.29±0.45^bD 2.19±1.34^aA 68.05±0.18^aE

64.95±2.31^cC 74.94±0.32^bE 26.94±3.25^cB 67.57±0.56^cCD 12.19±1.74^bA 68.59±0.46^aD

30% EtOH

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

27.56±2.92^aC 78.44±0.98^bF 19.02±0.54^aB 53.67±2.63^aD 3.17±1.55^aA 70.01±0.06^aE

45.85±3.67^bC 79.78±0.04^bE 28.94±1.79^bB 70.20±0.79^bD 4.14±2.77^aA 70.58±0.22^aD

62.09±0.58^cC 69.40±0.84^aD 56.31±0.61^cB 69.83±3.23^bD 29.15±2.42^bA 69.16±0.53^aD Each value represents mean±SD (n=3).

Means with different small letters (a-c) in the same row are significantly different at P<0.05.

Means with different capital letters (A-F) in the same column are significantly different at P<0.05.

화합물의 함량은 벌나무 추출물에서 가장 높고, 다음으로 섬애약쑥 추출물, 갈근 추출물의 순이었고, 이는 30% 주정 추출물에서도 동일한 경향이었다.

Choi 등(2013)은 1시간 동안 끓인 벌나무 열수 추출물의 총 페놀화합물 함량은 171.93 mg/g이라고 하였으며, 갈근 (Kim 등, 2004)의 경우 2시간 열수 추출물의 페놀화합물 함량은 59.75 mg/g, 헛개나무 열매(Kim 등, 2010)의 열수 추출물은 11.5 mg/g, 주정 추출물은 0.5 mg/g으로 보고되어 있는데, 이러한 결과들은 본 연구 결과와 유사한 범위였다.

플라보노이드 화합물의 함량은 총 페놀화합물의 함량이 높았던 갈근, 벌나무, 섬애약쑥에서 높았으나 총 페놀화합물 에 대한 비율은 시료마다 차이가 있었다. 즉 총 페놀화합물 에 대한 플라보노이드의 함량은 민들레 물 추출물은 약 48%

를 차지하였으며, 30% 주정 추출물은 87%로 여타 시료에 비해 상대적인 플라보노이드의 함량이 높았다. 섬애약쑥은 물 추출물과 30% 주정 추출물 모두 총 페놀화합물의 함량 대비 플라보노이드 화합물의 함량은 약 77%를 점유하고 있 는데 반해 헛개나무 열매와 벌나무의 30% 주정 추출물은 6%와 13% 정도로 페놀화합물 함량 대비 플라보노이드 함 량이 낮았다.

선정된 생약재 시료별 항산화 활성

일반적으로 특정 물질에 대한 항산화 활성을 측정하는 방 법에는 여러 가지가 있으나 그중에서 DPPH 라디칼 소거 활성법은 비교적 간단하면서도 대량으로 측정이 가능한 방 법이다. 전자공여 작용은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 지방질 산화를 억제시키는 척도로 사용되고 있을 뿐만 아니 라 인체 내에서 활성 라디칼에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다(Jung 등, 2004).

농도별 생약재 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가 한 결과는 Table 4와 같다. 물 추출물의 경우 벌나무 추출물 에서 가장 활성이 높아 실험된 가장 낮은 농도인 250 μg/mL

농도에서도 71.66%였고, 다음으로 활성이 높은 섬애약쑥 추출물의 활성은 67.13%로 다음으로 활성이 높은 민들레 추출물(37.62%)에 비해 1.5배 이상 활성이 높았다. 활성이 낮았던 시료들의 경우 시료의 첨가 농도가 증가함에 따라 그 활성도 증가하는 경향을 보였으나 저농도에서도 활성이 높았던 벌나무와 섬애약쑥 추출물은 최고 농도인 1,000 μg/

mL 농도에서 활성이 각각 74.94%와 68.59%로 시료의 농 도에 따른 활성의 차이가 적었다. 이러한 경향은 30% 주정 추출물에서도 동일하였으며, 민들레 추출물의 경우 500 μg/

mL 이상의 농도에서는 활성이 우수한 섬애약쑥 추출물에 비해 활성이 유사하거나 더 높았다.

생약재 추출물의 농도별 ABTS 라디칼 소거 활성을 측정 한 결과는 Table 5와 같다. 낮은 농도인 250 μg/mL에서 물 추출물은 38.48~99.10%, 30% 주정 추출물은 43.78~99.12

%의 활성을 나타내었다. 250 μg/mL 농도에서 벌나무, 민들 레, 섬애약쑥은 물 및 30% 주정 추출물 모두에서 96.16%

이상으로 활성이 높았다. 갈근, 헛개나무 열매, 울금은 시료 의 농도가 증가함에 따라 활성도 증가하여 1,000 μg/mL 농 도에서 활성은 94.00~98.97%의 범위였다. 물 추출물 중에 서는 헛개나무 열매의 활성이 가장 낮았고, 30% 주정 추출 물에서는 갈근의 활성이 가장 낮았다. DPPH 라디칼 소거 활성의 경우 물 추출물에서 벌나무, 섬애약쑥, 민들레, 갈근, 헛개나무 열매, 울금 순으로 높은 활성을 보였지만 ABTS 라디칼 소거 활성은 벌나무, 섬애약쑥, 민들레, 갈근, 울금, 헛개나무 열매 순이었다. 이처럼 DPPH 라디칼 소거 활성과 경향이 상이한 이유는 DPPH의 경우 자유라디칼을 소거하 지만 ABTS는 양이온 라디칼을 소거하는 차이를 가지며, 두 기질과 반응하는 반응물과의 결합 정도가 상이하기 때문으 로 판단된다(Kim 등, 2013).

생약재 용매별 추출물의 농도별 환원력을 측정한 결과는 Table 6과 같다. 250 μg/mL 농도에서 물 추출물의 환원력 은 29.75~611.83 μM의 범위였으며, 30% 주정 추출물의

Table 5. ABTS radical scavenging activity of medicinal herb extracts with different extraction solvents

250 500 1,000

Water

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

88.78±0.30^aC 99.10±0.03^aE 38.48±1.03^aA 96.16±0.15^aD 45.18±2.51^aB 97.43±0.28^aDE

95.54±0.11^bC 99.15±0.14^aE 60.85±0.75^bA 96.95±0.10^abD 70.99±1.17^bB 97.69±0.03^aD

95.70±0.07^bB 99.16±0.02^aE 94.00±0.44^cA 97.40±0.05^bcC 98.40±0.06^cD 98.09±0.01^bD

30% EtOH

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

95.20±0.14^aC 99.12±0.08^aE 57.80±0.21^aB 97.31±0.05^aD 43.78±0.62^aA 97.57±0.05^aD

96.15±0.03^aC 99.34±0.10^aD 89.20±1.77^bB 97.42±0.02^abC 70.37±1.18^bA 97.66±0.14^aC

96.24±0.04^aA 98.99±0.16^aD 98.97±0.03^cD 97.73±0.05^bB 98.63±0.31^cC 98.44±0.07^bC Each value represents mean±SD (n=3).

Means with different small letters (a-c) in the same row are significantly different at P<0.05.

Means with different capital letters (A-E) in the same column are significantly different at P<0.05.

Table 6. FRAP of medicinal herb extracts with different extraction solvents

250 500 1,000

Water

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

234.53±2.64^aD 611.83±3.26^aF 29.75±0.57^aA 99.42±2.18^aC 41.30±0.66^aB 589.41±6.13^aE

416.75±4.46^bD 941.22±3.12^bF 53.67±0.47^bA 163.94±0.97^bC 71.84±1.52^bB 926.45±3.60^cE

670.48±10.56^cD 965.61±4.74^cF 98.32±1.29^cA 274.25±2.30^cC 114.62±1.15^dB 904.14±7.22^bE

30% EtOH

Pueraria lobata Ohwi Acer tegmentosum Maxim.

Hovenia dulcis fruits Taraxacum officinale Curcuma longa L.

Artemisia argyi H.

236.74±6.88^aB 881.06±8.92^aD 40.93±6.66^aA 237.12±3.87^aB 30.64±6.15^aA 637.08±1.38^aC

445.67±2.78^bC 961.21±1.07^cF 94.25±0.48^bB 458.36±6.64^bD 69.28±2.32^bA 928.52±1.09^cE

740.25±1.49^cC 946.81±5.23^bF 182.71±3.05^cB 789.14±11.99^cD 112.28±4.63^cA 884.33±10.56^bE Each value represents mean±SD (n=3).

Means with different small letters (a-c) in the same row are significantly different at P<0.05.

Means with different capital letters (A-F) in the same column are significantly different at P<0.05.

경우 30.64~881.06 μM의 범위였다. 1,000 μg/mL 농도까 지는 농도가 증가함에 따라 활성도 증가하여 물 추출물은 98.32~965.61 μM, 30% 주정 추출물은 112.28~946.81 μM의 범위였으며, 모든 농도에서 벌나무의 활성이 가장 높 았다. 타 시료에 비해 환원력이 높은 벌나무, 섬애약쑥 및 갈근 추출물은 총 페놀화합물의 함량도 유의적으로 높았는 데, 총 폴리페놀 함량과 환원력은 높은 상관관계가 있다는 Sanchez-Gonzalez 등(2005)의 보고로 미루어 볼 때 페놀 화합물이 환원력에 기여하는 것으로 판단된다.

이상의 결과로부터 유효성분인 총 페놀화합물이나 플라 보노이드 화합물의 함량이 높고, 항산화 활성이 우수한 소재 로 갈근, 벌나무, 민들레 및 섬애약쑥을 선정하였다. 물 추출 물에 비해 30% 주정 추출물의 활성이 더 높았으나 그 차이 는 미미하고, 주정의 사용에 따른 경제적인 측면을 고려하여 물 추출물을 사용하는 것이 적합할 것으로 판단되어 이후의 실험은 선정된 갈근, 벌나무, 민들레 및 섬애약쑥 물 추출물

을 대상으로 실시되었다.

선정된 생약재 시료별 NO 및 ROS 생성 저해 활성

1A). 섬애약쑥 추출물의 경우 400 μg/mL부터 20% 이상의 세포 독성이 확인되어 이후 실험은 300 μg/mL 이하의 농도 로 진행하였다.

4종의 물 추출물은 모든 농도에서 LPS 단독 처리군 대비 유의적인 NO 생성 억제 효과가 있었으며, 비교적 저농도인 100 μg/mL에서도 효과가 확인되었다(Fig. 1B). Cho 등 (2015)의 연구에서도 LPS에 의하여 유도된 대식세포의 NO 합성은 벌나무 추출물의 농도가 증가함에 따라 감소하였고, 1.0 mg/mL의 농도에서 NO 합성 억제율은 83.3%로 현저히 감소하여 벌나무 추출물의 항염증 효능이 높은 것으로 보고 되어 있다.

0 20 40 60 80 100 120 140

Cell viability (% of control) .

100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL

*

**

A

Control Pueraria lobata

Ohwi

Taraxacum officinale Acer

tegmentosum Maxim

Artemisia arayi H.

■Only LPS ▨ 100 μg/mL ▦ 200 μg/mL

▤300 μg/mL ▩ 400 μg/mL ▥ 500 μg/mL

0 20 40 60 80 100 120

NO production (% of control) .

100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL

** *** **

******

*** ***

*** ***

*** ***

***

B

Control Pueraria lobata

Ohwi

Taraxacum officinale Acer

tegmentosum Maxim

Artemisia arayi H.

■Only LPS ▨ 100 μg/mL ▦200 μg/mL ▤ 300 μg/mL

0 20 40 60 80 100 120

ROS production (% of control) .

100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL

*

*** ***

** **

*

*

C

Control Pueraria lobata

Ohwi

Taraxacum officinale Acer

tegmentosum Maxim

Artemisia arayi H.

■Only LPS ▨ 100 μg/mL ▦200 μg/mL ▤ 300 μg/mL

*

Fig. 1. Cell viability (A), inhibitory effects of LPS-induced NO

P<0.05

P<0.01,

P<0.001

세포 내 염증유발인자의 자극으로 iNOS 및 COX-2의 발 현이 증가하면 염증인자인 NO의 생성을 유발하며 생성된 NO는 신경독성, 신호전달 및 체내방어 등의 생리적 기능을 수행한다(Choi와 Kim, 2013). 염증반응 부위에서 NO의 과 다발현은 다양한 염증과 자가 면역 질환의 매개물질로 작용 한다(Giustarini 등, 2008). 간경변증 환자에서 일반적으로

NO가 증가하며, 사염화탄소와 같은 염증유도 물질도 간에서 NO 생성량을 증가시키는데 상황버섯 추출물이 과도하게 생 성된 NO를 억제시킴으로써 항염증 효과를 나타내었다고 보 고되어 있다(An 등, 2009). 따라서 NO 생성 억제능이 있는 시료는 염증 유발을 억제함으로써 염증이 진전되어 발생되는 간질환을 효과적으로 예방하는 데 기여할 것으로 사료된다.

Dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)는 세포막을 통 해 확산되며 세포 내 esterase에 의해 가수분해 되어 비형광 성 DCF-H가 되며, 세포 내 ROS가 존재할 경우 매우 빠르게 높은 형광을 띈 DCF로 산화된다(Lee 등, 2005). DCFH-DA 를 이용하여 세포 내 ROS 생성량을 측정함으로써 생약재 4종 물 추출물의 산화적 스트레스 저하 효과를 확인하였다 (Fig. 1C). LPS 단독 처리군 대비 ROS 생성 억제 활성은 벌나무 추출물이 300 μg/mL 농도에서 23.88%로 가장 높았 고, 다음으로 민들레 추출물 순이었다. 갈근은 모든 농도에서 ROS 생성 억제 활성의 유의적인 차이가 발생하지 않았다.

조성물의 총 페놀화합물 함량

혼합 비율을 달리한 생약재 조성물 중의 총 페놀화합물 함량을 분석한 결과는 Table 7과 같다. 총 페놀화합물의 함 량은 59.44~72.88 mg/g의 범위로 시료의 혼합 비율에 따 라 차이가 있었으며, 민들레의 비율이 높은 시료에서 총 페 놀화합물의 함량이 낮은 경향을 보였다. 이는 상기의 단독 시료에서 페놀화합물의 함량을 분석한 결과와 비교해볼 때 페놀화합물 함량이 상대적으로 낮았던 민들레 추출물의 혼 합비율이 높으면 조성물에서도 낮게 정량되어 단독시료의 함량이 직접적으로 영향을 미치기 때문으로 판단된다.

순수 페놀성 물질을 일정 비율로 혼합한 혼합물의 항산화 활성은 각 물질의 항산화 활성에 대한 합과 유사하여 시너지 효과보다는 오히려 첨가 효과라는 보고가 있는데(Heo 등, 2007), 본 연구의 결과도 시너지 효과보다는 첨가 효과로 판단된다.

이후의 항산화 실험은 혼합비율을 달리한 조성물 중 페놀 화합물의 함량이 높은 B, F, G, I 조성물을 대상으로 실시되 었다.

조성물의 항산화 활성

전자공여능은 페놀류 등 식물 추출물의 항산화능을 측정 하는 방법으로 사용하고 있으며 항산화 작용의 지표로 사용 되고 있다. DPPH법은 polyhydroxy 방향족, 방향족 아민류 등 시료에 의한 환원반응을 측정함으로써 전자공여능의 차 이를 측정할 수 있다(Kim 등, 2009).

Table 8은 우수활성 생약재의 혼합비율을 달리한 조성물 의 DPPH 라디칼 소거 활성, 환원력 및 β-carotene linoleic acid system에서 탈색방지 활성을 통해 항산화 활성을 측정 한 결과이다. 가장 낮은 농도인 250 μg/mL 농도에서 DPPH 라디칼 소거 활성은 42.93~52.54%로 F와 G시료가 B와 I에 비해 유의적으로 높았다. 시료의 농도가 증가함에 따라 활성

Table 8. Antioxidant activity of medicinal herb extracts mixture

Items Sample code Concentration (μg/mL)

250 500 1,000

DPPH radical scavenging activity (%)

B F G I

43.34±2.35^aA 52.54±1.39^bA 49.34±2.55^bA 42.93±2.87^aA

75.89±1.87^abB 73.10±1.25^aB 77.32±1.06^bB 73.99±1.74^aB

78.41±0.92^bB 77.26±0.51^aB 79.30±0.31^bB 76.30±0.41^aB

FRAP (FeSO4･7H2O eq μM)

B F G I

271.07±3.01^bA 284.07±4.54^cA 333.73±3.79^dA 245.73±1.61^aA

516.73±3.88^bB 552.40±4.82^cB 623.23±5.92^dB 488.23±4.25^aB

916.40±8.23^aC 914.73±7.69^aC 912.07±4.86^aC 912.07±7.78^aC Discoloration prevent activity

in β-carotene linoleic acid system (%)

B F G I

66.75±1.46^aA 72.91±0.73^cA 75.51±0.16^dA 68.92±0.25^bA

76.74±0.44^bB 77.84±0.95^bB 80.97±0.71^cB 75.00±0.29^aB

85.06±0.66^bcC 83.77±2.15^abC 86.68±0.50^cC 82.36±1.09^aC Each value represents mean±SD (n=3).

Sample code was refer to Table 1.

Means with different small letters (a-d) in the same column are significantly different at P<0.05.

Means with different capital letters (A-C) in the same row are significantly different at P<0.05.

Table 7. Total phenolic compounds contents of medicinal herb

Sample code Total phenolic compounds (mg/g) A

B C D E F G H I J K

66.10±1.00^c 72.16±0.09^ef 68.81±0.35^cd 66.28±0.31^c 60.55±0.47^ab 71.74±0.72^ef 72.88±1.02^f 66.32±0.06^c 71.39±0.86^de 64.59±0.28^b 59.44±0.20^a Each value represents mean±SD (n=3).

Sample code was refer to Table 1.

Means with different letters (a-f) in the same column are sig- nificantly different at P<0.05.

도 증가하여 500 μg/mL 농도에서는 73.10~77.32%의 활 성을 보였으며, 500 μg/mL 이상의 농도에서는 G시료가 여 타 시료보다 활성이 높았다.

우수활성 생약재의 혼합비율을 달리한 조성물의 환원력 은 시료의 첨가 농도에 의존하여 유의적으로 상승하였다.

가장 낮은 농도인 250 μg/mL 농도에서 환원력은 245.73~

333.73 μM의 범위로 G시료에서 가장 높은 활성을 보였으 며, 1,000 μg/mL 농도에서는 912.07~916.40 μM의 범위로 시료 간의 유의적인 차이는 없었다.

250~1,000 μg/mL 농도에서 생약재 조성물의 β-car- otene linoleic acid system계에서 항산화 활성에 미치는 영 향을 분석한 결과 250 μg/mL 농도에서는 G시료에서 75.51%

로 가장 활성이 높았으며, 여타 시료는 66.75~72.91%의 범 위였다. 시료의 농도가 증가함에 따라 활성도 증가하였으며 1,000 μg/mL 농도에서도 G시료가 86.68%로 활성이 가장 우

수하였고, 여타 시료의 활성은 82.36~85.06%의 범위였다.

Hwang 등(2014)은 섬애약쑥 및 발효 섬애약쑥 에탄올 농 도별 추출물의 β-carotene 탈색방지 효과는 250 μg/mL 농 도에서 섬애약쑥 추출물은 32.53~58.94%, 발효 섬애약쑥 추출물은 24.21~28.28%로 보고하였다. 항산화 활성이 좋다 고 알려진 블루베리와 라즈베리 메탄올 추출물의 β-caro- tene 탈색방지 활성은 10 mg/mL 농도에서 각각 53.80%와 36.41%로 보고되어 있는데(Shin 등, 2008), 본 연구의 조성 물들은 이들 추출물에 비해 월등히 활성이 높음을 알 수 있다.

조성물의 간세포에서 AST 및 ALT 활성

간세포 손상을 검사하기 위한 가장 일반적인 방법은 ALT, AST와 같은 효소의 활성도를 검사하는 것인데, 이들 효소의 활성치 증가는 간세포의 장애 정도와 비교적 상관성 과 민감도가 높다(Giannini 등, 2005). ALT는 알라닌의 아 미노기를 α-케토글루타르산에 전달하여 피루브산과 글루탐 산 생성반응을 촉매하는 효소이다(McPherson과 Pincus, 2016). 간･담도계 질환의 진단을 위해 주로 측정되며, AST 는 L-아스파르트산의 아미노기를 α-케토글루타르산으로 전달하여 옥살로아세트산과 L-글루탐산을 생성하는 가역 반응을 촉매하는 효소로 간염, 심근경색 등의 진단에 활용된 다(Min 등, 2015).

4종 생약재의 혼합비율을 달리하여 조성물을 제조하고, 그중 총 페놀화합물의 함량이 높고 항산화 활성이 우수한 조성물을 선발하여 HepG2 세포에서 간 손상 지표로 널리 활용되는 AST 및 ALT 활성을 분석한 결과는 Fig. 2와 같다.

농도별 조성물의 세포생존율을 평가한 결과(Fig. 2A) 실험 된 100~500 μg/mL 농도 범위에서는 세포 독성이 확인되지 않았으므로 이 범위 내에서 시료의 AST 및 ALT 활성을 분석하였다.

AST(Fig. 2B)와 ALT(Fig. 2C) 활성은 LPS 단독 처리군

0 20 40 60 80 100 120 140

Control B F G I

Cell viability (% of control) .

100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL

A

▤300 μg/mL ▩ 400 μg/mL ▥ 500 μg/mL

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Control B F G I

AST activity (Karmen unit) .

100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL

*

**

****

* **

*

* *

* *

****

** *

* *

*

B

▤300 μg/mL ▩ 400 μg/mL ▥ 500 μg/mL

0 5 10 15 20 25 30 35

Control B F G I

ALT activity (Karmen unit) .

100 µg/mL 200 µg/mL 300 µg/mL 400 µg/mL 500 µg/mL

* *

****

*****

*

*

*

** ***

** *

C

▤300 μg/mL ▩ 400 μg/mL ▥ 500 μg/mL

Fig. 2. Viability of HepG2 cells with medicinal herb extracts

P<0.05,

P<0.01,

P<0.001 compared

대비 200 μg/mL 농도에서 모든 조성물의 유의적인 감소 효과가 확인되었으며, 4종 조성물 중 특히 I 조성물이 가장 효과적인 감소 효과를 나타냈다.

대황과 감초의 물 추출물은 단독 사용하였을 때보다 혼합 하였을 때 ALT의 증가를 개선하는 효과가 더 높은데, 이는 여러 간 질환의 위험인자가 되는 산화적 스트레스에 의한 간 조직의 손상 및 이로 인한 염증의 억제를 통한 간 보호 효과라고 보고되어 있다(Lee 등, 2016). 또한 헛개나무 과

병 추출물은 free radical에 의한 간독성과 RNA와 단백질 합성의 저해 및 탄소화물 대사에 이상을 초래하여 나타나는 간독성 두 가지 기전 모두에 대해 간독성 보호 작용을 나타 내며 이러한 효과에는 rhamnose를 주성분으로 하는 다당류 도 기여한다는 보고도 있다(Na 등, 2004). 이와 같은 결과들 로 미루어볼 때 본 연구 결과에서 조성물들의 간 보호 효과 도 페놀화합물과 항산화 활성 이외의 다른 기작들이 같이 관여하는 것으로 추정되는데, 이에 대해서는 추가적인 연구 가 필요할 것으로 생각된다.

요 약

본 연구에서는 문헌조사를 통해 선발된 간 보호 활성이 있는 생약재인 갈근, 벌나무, 헛개나무 열매, 민들레, 울금 및 섬애 약쑥을 시료로 하여 간 기능 개선 식품소재 개발을 위한 기 초 연구의 일환으로 추출 조성물을 제조하고 간 보호 활성을 확인하였다. 생약재들의 총 페놀화합물 함량은 물 추출물이 12.06~93.17 mg/g의 범위로 벌나무에서 함량이 가장 높았 으며, 30% 에탄올 추출물도 같은 경향이었다. 각 시료별 물 과 30% 에탄올 추출물의 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성 및 환원력 측정 결과를 토대로 갈근, 벌나무, 민들레 및 섬애 약쑥 4종을 선발하였다. 선정된 4종 추출물의 NO와 ROS 생성 억제 활성은 벌나무, 민들레, 섬애약쑥, 갈근 추출물 순으로 높았다. 이들의 혼합비율을 달리한 조성물(A~K) 11 종을 제조하여 총 페놀화합물 함량을 분석한 결과 조성물 G에서 72.88 mg/g으로 가장 높은 함량이었고, 조성물 K에 서 59.44 mg/g으로 가장 낮은 함량이었다. 페놀화합물의 함량이 높은 B, F, G, I 조성물을 대상으로 항산화 활성을 평가한 결과 500 μg/mL 농도에서 조성물 G가 DPPH 라디 칼 소거능은 77.32%로 가장 높았으며, 환원력(623.23 μM) 과 β-carotene 탈색방지 활성(80.97%)도 가장 높았다. 4종 생약재의 혼합비율을 달리한 조성물을 100~500 μg/mL 농 도 범위 내에서 AST 및 ALT 활성을 분석한 결과 양성 대조 군과 비교했을 때 유의적으로 감소하였고 조성물 I의 활성이 가장 높았다. 본 연구 결과 페놀화합물의 함량이 유사한 범 위인 생약재 조성물의 항산화 활성과 간 보호 활성은 동일한 경향을 보이지 않았는데, 이는 두 활성에 작용하는 화합물이 서로 상이하기 때문으로 추정되며, 이들 간의 상관관계에 대해서는 향후 보완 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

감사의 글

본 논문은 산업통상자원부 공통기반기술개발사업(과제번호:

R0005511) 수행성과의 일부입니다.

REFERENCES

An CS, Choi SY, Jin HL, Jeon YH, Hur SJ, Kim IH, et al.

Immunomodulatory effects of Phellinus linteus extracts on

liver damage induced by carbon tetrachloride in rats. Korean J Med Crop Sci. 2009. 17:217-222.

Benzie IF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem. 1996. 239:70-76.

Cho EK, Jung KI, Choi YJ. Anti-diabetic, alcohol metabolizing enzyme, and hepatoprotective activity of Acer tegmentosum Maxim. stem extracts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015.

44:1785-1792.

Choi JH, Lee SH, Park YH, Lee SG, Jung YT, Lee IS, et al.

Antioxidant and alcohol degradation activities of extracts from

Acer tegmentosum Maxim.. J Korean Soc Food Sci Nutr.

2013. 42:378-383.

Choi MW, Kim JI. Anti-inflammatory effect of ethyl acetate fraction isolated from Undaria pinnatifida on lipopolysac- charides-stimulated RAW 264.7 cells. Kor J Fish Aquat Sci.

2013. 46:384-392.

Giannini EG, Testa R, Savarino V. Liver enzyme alteration: a guide for clinicians. CMAJ. 2005. 172:367-379.

Giustarini D, Rossi R, Milzani A, Dalle-Donne I. Nitrite and nitrate measurement by Griess reagent in human plasma: eval- uation of interferences and standardization. Methods Enzymol.

2008. 440:361-380.

Gutfinger T. Polyphenols in oilve oils. J Am Oil Chem Soc.

1958. 58:966-968.

Ha BJ, Kim HJ, Lee SH, Ha JM, Lee SH, Lee JH, et al. The hepatoprotective effects of Epimedii herba through the anti- oxidation. J Life Sci. 2005. 15:572-577.

Han EK, Lee JY, Jung EJ, Jin YX, Chung CK. Antioxidative activities of water extracts from different parts of Taraxacum

officinale. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2010. 39:1580-1586.

Heo HJ, Kim YJ, Chung D, Kim DO. Antioxidant capacities of individual and combined phenolics in a model system. Food Chem. 2007. 104:87-92.

Hong BK, Eom SH, Lee CO, Lee JW, Jeong JH, Kim JK, et al. Biological activities and bioactive compounds in the ex- tract of Acer tegmentosum Maxim. stem. Korean J Med Corp Sci. 2007. 15:296-303.

Hwang CR, Seo WT, Bae WY, Kang MJ, Shin JH. Physico- chemical characteristics and biological activities of Artemisia

argyi H.. J Life Sci. 2014. 24:377-385.

Jeong M, Kim S, Do E, Yun J, Kim D, Han K, et al. The effect of herbal mixture on alcohol metabolism in Sprague Dawley rats. Kor J Herbol. 2019. 34:67-74.

Jung SJ, Lee JH, Song HN, Seong NS, Lee SE, Baek NI.

Screening for antioxidant activity of plant medicinal extracts.

J Korean Soc Appl Biol Chem. 2004. 47:135-140.

Kim D, Chae HS, Kim NY, Jang A. Anti-oxidative activity and the protective effect of donkey’s bone and skin extracts on SK-N-SH cells. J Life Sci. 2013. 23:1019-1024.

Kim DG, Kang MJ, Shin JH. Hepatoprotective effects of Sum- aeyaksuk (Artemisia argyi H.) extract on LPS-mediated in- flammatory response. J Life Sci. 2016. 26:1282-1288.

Kim EY, Baik IH, Kim JH, Kim SR, Rhyu MR. Screening of the antioxidant activity of some medicinal plants. Korean J Food Sci Technol. 2004. 36:333-338.

Kim HK. The effects of protecting liver and improving liver function on cabbage extract. JCCT. 2019. 5:389-395.

Kim JY, Yi YS, Lim YH. Biolgical and antifungal activity of herbal plant extracts against Candida species. Kor J Microbi- ol Biotechnol. 2009. 37:42-48.

Kim KH, Chun HJ, Han YS. Screening of antimicrobial activity

of the dandelion (Taraxacum platycarpum) extracts. Korean J Soc Food Sci. 1998. 44:114-118.

Kim SH, Jun DH, Jang MJ, Lee JT, Lee CE, Han J, et al. Study of cosmeceutical activities of Hovenia dulcis var. koreana Nakai extracts. Jour Korean For Soc. 2010. 99:836-842.

Ko BS, Jang JS, Hong SM, Kim DW, Sung SR, Park HR, et al. Effect of new remedies mainly comprised of Hovenia dul-

cis Thunb on alcohol degradation and liver protection in

35:828-834.

Lee EH, Baek SY, Kim KY, Lee SG, Kim SC, Lee HS, et al.

Effect of Rheum undulatum Linne extract and Glycyrriza ur-

alensis fisher extract against arachidonic acid and iron-in-

Lee HJ, Hwang YI, Park E, Choi SU. Antihepatotoxic and anti- genotoxic effects of herb tea composed of Chrysanthemum

morifolium Ramat.. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2011. 40:78-83.

Lee SD, Park HH, Kim DW, Bang BH. Bioactive constituents and utilities of Artemisia sp. as medicinal herb and foodstuff.

Korean J Food Nutr. 2000. 13:490-505.

Lee YH, Ho JN, Dong MS, Park CH, Kim HK, Hong BS, et al. Transfected HepG2 cells for evaluation of catechin effects on alcohol-induced CYP2E1 cytotoxicity. J Microbiol Bio- technol. 2005. 15:1310-1316.

McPherson RA, Pincus MR. Henry’s clinical diagnosis and man- agement by laboratory methods. Elsevier, Amsterdam, Nether- lands. 2016. p 295-296.

Min EY, Kim SH, Hwang IK, Kim KW, Park BM, Lee JS, et al. Influence of elevated temperatures on the physiological response of hemolymph from two species of abalo ne,

Haliotis gigantea and Haliotis discus discus (Reeve, 1846).

Korean J Malacology. 2015. 31:187-194.

Na CS, Chung NC, Yang KH, Kim SH, Chung HS, Dong MS.

Hepatoprotective and blood alcohol lowering effects of fruit peduncle extract of Hovenia dulcis var. Koreana in the in vitro and in vivo animal models. Yakhak Hoeji. 2004. 48:34-40.

Noh KH, Jang JH, Kim JJ, Shin JH, Kim DK, Song YS. Effect of dandelion juice supplementation on alcohol-induced oxida- tive stress and hangover in healthy male college students. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2009. 38:683-693.

Park YS. Antioxidative activities and contents of polyphenolic compound of medicinal herb extracts. J East Asian Soc Diet Life. 2002. 12:23-31.

Sanchez-Gonzalez I, Jimenez-Escrig A, Saura-Calixto F. In vitro antioxidant activity of coffees brewed using different proce- dures (Italian, espresso and filter). Food Chem. 2005. 90:133- 139.

Shin JH, Kang JR, Kang MJ, Shin JH. Physiological activity of five kinds of medicinal plant extracts with various solvents and their composites. J Life Sci. 2018. 28:320-330.

Shin JH, Lee SJ, Seo JK, Cheon EW, Sung NJ. Antioxidant activ- ity of hot-water extract from Yuza (Citrus junos SIEB ex TANAKA) peel. J Life Sci. 2008. 18:1745-1751.

Song HJ, Lee JH, Huh MR. Isolation and structural identification of curcumin derivatives form of Curcuma longa. J Agric Life Sci. 2015. 49:79-88.

Yun IR, Choi YJ, Heo JH, Choi CY, Seoung TJ, Kim YG, et al. Nitrite scavenging activity and protective effect of the

Puerariae Radix and green tea extract on lead acetate and

2010. 33:275-285.