Effects of Ojeoksangamibang Extract on the Recovery of Liver Function in CCl4-exposed Rats

(1)

五積散加味方 추출물이 CCl

4

중독 Rat의 간기능 회복에 미치는 영향

이수연⋅박원형*⋅차윤엽*⋅이 은

상지대학교 보건과학대학 제약공학과, 상지대학교 한의과대학 한방재활의학과교실*

Effects of Ojeoksangamibang Extract on the Recovery of Liver Function in CCl4-exposed Rats

Soo-Yeon Lee, M.D., Won-Hyung Park, K.M.D.*, Yun-Yeop Cha, K.M.D.*, Eun Lee, Ph.D.

Department of Pharmaceutical Engineering of Health Sciences, Sangji University, Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Sangji University*

RECEIVED June 25, 2013 REVISED July 16, 2013 ACCEPTED July 18, 2013

CORRESPONDING TO Yun-Yeop Cha, Department of Korean Rehabilitation Medicine, College of Korean Medicine, Sangji University, 80, Sangjidae-gil, Wonju 220-717, Korea

TEL (033) 741-9261 FAX (033) 732-2124 E-mail [email protected]

Objectives The objective of present study was to investigate the effect of Ojeoksanga- mibang (Wǔjīsǎnjiāwèifāng) extract on recovery of liver function in carbontetrachloride (CCl4)-exposed rat.

Methods Male rats weighing 230±7.21 g fed experimental diet for 1 week and 28 rats were divided into 4 groups. Each of 7 rats was devided into a control group and experimental groups. We fed a control group of rats a basal diet and administered normal saline (100 mg/kg, 1 time/1 day) for 3 weeks. And we fed each experimental group of rats basal diet and administered an extract of Ojeoksangamibang extracts (100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 1 time/1 day) for 3 weeks. We measured lipid of plasma and liver, concentration of proinflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-10). Statistical analysis was done by one-way analysis of variance (ANOVA) and Duncan's multiple range test with significance level at p＜0.05.

Results Plasma a-fetoprotein (AFP) and total protein concentration showed a tendency to decrease in Ojeoksangamibang extract-treated groups. However, plasma albumin concentration showed no significant differences in all treatment groups. Activity of plasma Aspartate aminotransferase (AST) and Alanine aminotransferase (ALT) in the Ojeoksanga- mibang extract-treated groups, increased addition amount of Ojeoksangamibang extracts tended to decline. Alkaline phosphatase (ALP), lactate dehydrogenase (LDH) and γ-glu- tamyl transferase (γ-GT) activities showed a tendency to decrease in Ojeoksangamibang extract-treated groups, increased addition amount of Ojeoksangamibang extracts tended to decline. Concentration of plasma triglyceride and total cholesterol showed a lower value than that of control group. The liver IL-1β, IL-6 and TNF-α concentration were decreased, and IL-10 was increased in Ojeoksangamibang extract groups, compared to control group. Plasma IL-1β, IL-6 and TNF-α concentration were decreased, and IL-10 was increased in Ojeoksangamibang extract groups, compared to control group.

Conclusions This study suggested that Ojeoksangamibang may alleviate liver inflammatory reaction induced by liver toxicity. (J Korean Med Rehab 2013;23(3):45-53)

Key words Ojeoksangamibang extract, Liver function, A-fetoprotein, AST, ALT, Cytokines

(2)

Ingredients Basal diet (%)

Casein 20.0

α-Corn starch 35.5

Sucrose 11.0

Lard 4.0

Corn oil 1.0

Mineral mix* 3.5

Vitamin mix^† 1.0

Cellurose powder 23.7

DL-methione 0.3

*g/kg diet: CaCO3, 29.29; CaHPO4ㆍ2H2O, 0.43; KH2PO4, 34.30; NaCl, 25.06; MgSO4ㆍ7H2O, 9.98; Feric citrate hexahy- drate, 0.623; CuSO4ㆍ5H2O, 0.516; MnSO4ㆍH2O, 0.121;

ZnCl2, 0.02; KI, 0.005; (NH4)6 MO7O24ㆍ4H2O, 0.0025.

†mg/kg diet: Thiamine-HCl, 12; Riboflavin, 40; Pyridoxin- Hcl, 8; Vitamin-B12, 0.005; Ascorbic acid, 300; D-biotin, 0.2;

Menadione, 52; Folic acid, 2; D-calcium pantothenate, 50;

P-aminobenzoic acid, 50; Nicotinic acid, 60; Choline chloride, 2,000 (IU/kg diet); Rethinyl acetate, 5,000 (IU/kg diet);

Cholecalciferol, 250 (IU/kg diet).

Table I. Composition of Experimental Diet

서론»»»

최근 청장년층에서 간질환의 발병률이 높아져 간질환 의 예방과 치료에 대한 관심이 고조되고 있다. 간질환으 로 인한 간기능의 이상은 영양소 대사에 문제를 일으켜 여러 종류의 복합적 임상증후를 나타낸다¹⁾.

따라서 손상된 간세포의 부활, 인체의 면역기능 및 간 기능을 증진시켜 간질환을 치료하려는 연구가 진행되고 있으며, 특히 천연물이나 생약을 이용한 연구가 많이 수 행되어^2,3), 간질환의 치료와 예방을 위해 천연물응용에 대 한 인식이 높아졌다.

五積散은 ｢太平惠民和劑局方ㆍ傷寒門｣⁴⁾에서 처음 서 술된 처방으로 蒼朮, 麻黃, 陳皮, 厚朴, 桔梗, 枳殼, 當歸, 乾薑, 白芍藥, 白茯苓, 川芎, 白芷, 半夏, 肉桂, 甘草, 生薑 으로 구성되어 있으며, 주로 祛痰, 袪瘀血之劑로 많이 사 용한다. 최근 임상에서 비만환자 등에게 五積散加味方으 로 祛痰, 消食, 利氣, 利水하는 薏苡仁, 蘿葍子, 木通, 澤瀉, 車前子, 靑皮 등을 加味하여 사용하던 중 간기능 개선 등의 효과가 있는 례가 있어 일차적으로 본 실험을 하게 되었다.

五積散 효능에 대한 이전의 연구 결과에서는 자궁근종 세포의 사멸 및 apoptosis의 촉진과 五積散 농도에 비례 한 사멸세포수의 증가가 보고되었으며⁵⁾, 해열, 진통, 소염 에 있어서는 아스피린과 유사한 효과가 관찰되었고^6-8), 신 장질환에 있어서는 백서 세뇨관의 재흡수기능과 신사구 체 여과율의 촉진^9,10) 등이 보고되었다. 상기의 연구를 통 해서 간질환을 비롯한 생체 내 염증반응에 五積散加味方 이 긍정적으로 작용할 것으로 판단되었기에, CCl4로 간중 독을 유도한 쥐에게 五積散加味方 추출물을 급여한 후 혈 액 내 간기능에 관계하는 생물학적 수치들과 전염증성 cytokine의 생산량을 확인하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 시험 동물 및 시험군

평균체중이 230±7.21 g의 Sprague-Dawley계 쥐 수컷 28두를 1주일간 시험식이에 적응시킨 후, 평균체중이 유

사하게 대조군(생리식염수 100 mg/kg), 처리1군(五積散加味方 추출액 100 mg/kg), 처리2군(五積散加味方 추출 액 200 mg/kg) 및 처리3군(五積散加味方 추출액 300 mg/kg)으로 나누어, 처리군당 7두씩 임의로 배치하였다.

본 실험은 실험동물윤리에 관한 규정을 준수하였다.

2. 식이 및 물

식이 및 물은 시험기간 3주 동안 자유롭게 먹게 하였 다(Table I).

3. 사염화탄소 처리

시험 개시기에 Conc. CCl4와 올리브 오일을 1:3으로 희석한 용액을 2.5 mg/kg 수준으로 격일로 3회 존대를 이용하여 경구 투여하여 간장중독을 유도했다.

4. 五積散加味方 추출물 및 급여방법

시중에서 구입한 五積散加味方 (Table II) 500 g을 적 량으로 나누어 수조 상에서 냉각수 환류 하에서 5시간씩 3회 추출하고, 여과, 감압, 농축하여 EtOH 추출물 97 g을 만들어, 냉동실에 보관, 공시했다. 급여는 매일 오후 3시

(3)

Herb

medicine Scientific name Amount

(g)

蒼朮 Atractylodes japonica 8.0

麻黃 Ephedra sinica 4.0

陳皮 Citrus unshiu Markovich 4.0

厚朴 Machilus thunbergii 3.0

桔梗 Platycodon grandiflorum 3.0

枳殼 Ponicirus trifoliata Rafin 3.0

當歸 Angelica gigas Nakai 3.0

乾薑 Zingiber officinale Roscoe 3.0

白灼藥 Paeonia lactiflora 3.0

白茯苓 Poria cocos Wolf 3.0

川芎 Cnidium officinale 2.8

白芷 Angelica dahurica Benthamet Hooker 2.8

半夏 Pinellia ternata 2.8

肉桂 Cinnamomum cassia Blume 2.8

甘草 Glycyrrhiza uralensis 2.4

生薑 Zingiber officinale 3.0

薏苡仁 Coicis Semen 8.0

蘿葍子 Raphani Semen 4.0

木通 Akebiae Caulis 4.0

澤瀉 Alismatis Rhizoma 4.0

車前子 Plantaginis Semen 4.0

靑皮 Citri Reticulatae viride Pericarpium 4.0

Total amount 85.6

Table II. The Prescription of Ojeoksangamibang

경에 존대를 이용하여 4주간 경구 투여했다. 대조군은 동 일한 방법으로 생리식염수를 투여했다.

5. 혈액 및 간장 채취

혈액채취는 시험 종료 12시간 전에 급여사료를 중단, 절식한 상태에서 약 5~6 ml의 혈액을 심장천자법에 의해 채혈, 공시했다. 간장채취는 혈액채취가 끝난 직후 적출 했다.

6. 혈액분석

혈청 AFP (α-Fetoprotein), Total protein, Albumin, ALP (Alkaline phosphatase), AST (Asparate Aminotrans- ferase), ALT (Alanine Aminotransferase), γ-GT (γ-Glu- tamyl transferase), Triglyceride, Total cholesterol, LDH (Lactate Dehydrogenase)의 활성측정은 혈액자동분석기 (Boeheringer Manheim, 독일)에 의해 측정했다.

7. Cytokine 정량

혈장 Cytokine 정량용 시료는 채혈직후, 혈장을 분리하 여 -80ôC에 냉동 보관하였다. 간장 Cytokine정량용 시료 는 1 g의 간장을 채취하여 5 ml의 phosphate buffered saline (PBS, PH 7.4, containing a protease inhibitors cocktail)과 함께 혼합하여 얼음위에서 분쇄(homogen- ized)하였다. 분쇄혼합물을 4ôC, 15,000 rpm 15분간 원심 분리한 후, 상층부를 0.45μm 필터로 여과하고, 다시 원 심분리해서 상층부를 -80ôC에 냉동 보관했다.

Cytokine (IL-1β, TNF-α, IL-6 및 IL-10)정량은 시판 kit (Biosource International, USA)를 이용했다. TNF-α 의 최적 측정농도는 0.7 pg/ml이며, 다른 Cytokine들은 3~8 pg/ml이다. 간장 Cytokine량은 5 ml의 PBS에 생 간 장 1 g을 혼합한 조정액으로 측정하였으며, pg/mg 단위 로 나타내었다.

8. 통계처리

실험결과는 SPSS 17.0 version을 이용하여 one-way ANOVA검정을 수행하였으며, 각 처리군간의 유의성 검정 은 Duncan's multiple range test에 의해 p＜0.05 수준에 서 실시했다.

결과»»»

1. Plasma a-fetoprotein (AFP), Total protein 및 Albumin의 농도

AFP의 농도는 전 처리 군에서 3.17 ng/ml에서 4.09 ng/ml의 변동범위를 보여주었으며, 대조군보다 五積散加味方 추출물 처리군들이 낮은 값을 나타내었다. Total protein 농도는 대조군과 비교하여 五積散加味方 처리군 들이 낮은 수치를 나타내었으며, 五積散加味方 추출물 첨 가량이 증가함에 따라 하락하는 경향을 보였다. Albumin 의 농도는 대조군과 五積散加味方 추출물 처리군 간에 유 의한 차이를 나타내지 않았다(Table III).

(4)

Treatment AFP (ng/ml) Total protein (g/dl) Albumin (g/dl)

I 4.09±0.42^‡ 6.95±0.47^† 3.47±0.25^NS

II 3.17±0.39^† 6.72±0.41^† 3.83±0.59^NS

III 2.88±0.41*^† 5.81±0.35* 3.96±0.52^NS

IV 2.31±0.22* 5.29±0.37* 3.91±0.631^NS

NS: Not significantly different (p＞0.05), I: Control group (CCl4), II: CCl4+100 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group, III: CCl4+200 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group, IV: CCl4+300 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group.

*, ^†, ^‡: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05).

Table III. Effects of Ojeoksangamibang Extract on Plasma AFP, Total Protein and Albumin Concentration in Rat Injured CCl4

Solution

Treatment AST (U/L) ALT (U/L)

I 201.44±23.57^‡ 187.39±19.54^†

II 151.39±17.28^† 172.83±17.69^†

III 133.27±21.93*^† 124.11±22.94*

IV 115.64±19.68* 121.72±21.65*

I: Control group (CCl4), II: CCl4+100 mg/kg Ojeoksangami- bang ext. group, III: CCl4+200 mg/kg Ojeoksangamibang ext.

group, IV: CCl4+ 300 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group.

Table IV. Effects of Ojeoksangamibang Extract on Plasma AST and ALT in Rat Injured CCl4 Solution

Treatment ALP (U/L) γ-GT (U/L) LDH (U/L)

I 291.72±23.59^† 2.83±0.21^† 1,854.39±52.18^†

II 274.38±19.57^† 2.56±0.23*^† 1,539.23±36.47*

III 227.41±15.28* 2.47±0.25*^† 1,427.31±31.46*

IV 211.53±19.57* 2.23±0.17* 1,392.58±32.17*

I: Control group (CCl4), II: CCl4+100 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group, III: CCl4+200 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group, IV:

CCl4+300 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group.

*, ^†: Means in the column row with different superscripts are significantly different (p＜0.05).

Table V. Effects of Ojeoksangamibang Extract on Plasma ALP, γ-GT and LDH in Rat Injured CCl4 Solution

Treatment Total cholesterol (mg/dl) Triglyceride (mg/dl)

I 93.51±5.47^† 121.73±6.88^†

II 85.65±4.94*^† 108.35±5.15*

III 81.96±5.27* 93.27±6.11*

IV 82.73±4.09* 91.53±5.47*

I: Control group (CCl4), II: CCl4+100 mg/kg Ojeoksangami- bang ext. group, III: CCl4+200 mg/kg Ojeoksangamibang ext.

group, IV: CCl4+300 mg/kg Ojeoksangamibang ext. group.

*, ^†: Means in the same column with different superscripts are significantly different (p＜0.05).

Table VI. Effects of Ojeoksangamibang Extract on Plasmid Cholesterol and Triglyceride Concentration in Rat Injured CCl4

Solution

2. AST, ALT의 효소 활성

AST의 활성치는 대조군보다 五積散加味方 추출물 처리 군에서 현저하게 낮은 수치를 나타내었으며, 五積散加味方 추출물 첨가량이 증가함에 따라 하락하는 경향을 보였 다. ALT의 활성치는 대조군과 五積散加味方 추출물 100 mg 처리군은 상호간에 유의한 차이를 나타내지 않았으 나, 五積散加味方 추출물 200 mg 및 300 mg 처리군은 대조군보다 현저하게 하락하였다(Table IV).

3. ALP, γ-GT 및 LDH의 생물학적 수치

ALP는 五積散加味方 처리군들이 대조군보다 낮은 수치 를 보였고, γ-GT는 처리군 간에 유의한 차이를 나타내 지 않았다. LDH의 효소활성치는 CCl4 처리에 의해 상당 한 수준으로 그 활성치가 증가하였으나, 五積散加味方 처 리군들은 대조군보다 낮은 수치를 나타내었다(Table V).

(5)

Treatment IL-1β (pg/mg) IL-6 (pg/mg) TNF-α (pg/mg) IL-10 (pg/mg)

I 31.57±4.89^‡ 15.71±1.15^‡ 2.11±0.47^NS 1.68±0.47^NS

II 27.32±4.52^†‡ 9.64±0.97^† 1.71±0.59^NS 1.77±0.39^NS

III 21.55±3.81*^† 7.12±0.83* 1.65±0.35^NS 1.93±0.38^NS

IV 18.75±3.29* 7.27±0.91* 1.53±0.41^NS 1.95±0.31^NS

Table VII. Effects of Ojeoksangamibang Extract on Liver Cytokines Concentration in CCl4-exposed Rats

Treatment IL-1β (pg/mg) IL-6 (pg/mg) TNF-α (pg/mg) IL-10 (pg/mg)

I 291.57±21.75^‡ 672.39±58.53^† 803.27±79.38^† 82.15±7.15*

II 247.35±22.53^† 571.48±63.15*^† 621.35±49.33* 93.69±9.87*

III 185.49±27.31* 488.78±51.45* 639.71±56.28* 87.47±8.11*

IV 192.57±31.55* 517.44±72.19* 571.49±51.23* 118.57±8.19^†

Table VIII. Effects of Ojeoksangamibang Extract on Plasma Cytokines Concentration in CCl4-exposed Rats

4. Total Cholesterol량과 Triglyceride량

본 실험의 결과에서 Cholesterol과 Triglyceride 농도가 五積散加味方 처리군들이 대조군보다 낮게 나타났다(Table VI).

5. Liver cytokine

간 IL-1β 및 IL-6 농도(Table VII)는 五積散加味方 추 출물 처리군들이 대조군보다 낮은 값을 나타내어, 五積散加味方 추출물에 의해 간 염증상태가 개선되었음을 알 수 있다. CCl4 처리 후 간장 TNF-α 농도는 대조군과 五積散加味方 추출물 처리군들 간에 유의한 차이를 나태내지 않았으며, 간 IL-10은 높은 경향을 나타냈으나, 유의성은 없었다(Table VII).

6. Plasma cytokine

본 연구에서 Plasma IL-1β, IL-6 및 TNF-α농도 모두 가 五積散加味方 추출물처리군들에서 대조군보다 낮은 수 치를 보였다. Plasma IL-10 농도는 대조군보다 五積散加味方 추출물 처리군 들이 유의하게 높은 값을 나타내었다.

고찰»»»

五積散加味方의 간기능 회복효과를 알아보기 위하여 CCl4로 간손상을 유도한 흰쥐에게 五積散加味方 추출물을 급여한 후 간장기능에 관여하는 혈액 내 생물학적 수치와 cytokine 농도를 처리군 간에 비교, 검토하였다.

먼저, 각 처리군 별 AFP, Total protein 및 Albumin의 농도를 알아보았다.

AFP의 농도는 전 처리군에서 3.17 ng/ml에서 4.09 ng/ml의 변동범위를 보여주었으며, 대조군보다 五積散加味方 추출물 처리군들이 낮은 값을 나타내었다. Total protein 농도는 대조군과 비교하여 五積散加味方 처리군들이 낮은 수치를 나타내었으며, 그 중 200 mg/kg과 300 mg/kg 농도에서는 유의성 있게 낮았다.

AFP는 간암지표로 가장 널리 사용이 되며¹¹⁾, 간염ㆍ간 경변증 등으로 간세포가 파괴되어 재생할 경우에도 AFP 값이 상승한다¹²⁾. Total protein은 혈액중의 모든 단백질 의 총칭으로 혈청 단백의 대부분은 간장에서 합성되고 파 괴되며, 신장에서 비슷한 양으로 배설이 이루어지므로 항 상 일정치를 유지하게 된다. 그러므로 혈청 단백의 양은 간과 신장의 건강 유무의 지표가 될 수 있고, 따라서 혈 장 AFP농도 및 Total protein량의 증가는 간조직의 염증

(6)

유발이나 이상을 의미한다¹³⁾. 본 연구의 결과에서 五積散加味方 추출물 처리군에서 AFP농도 및 Total protein량의 감소는 五積散加味方 추출물이 손상된 간세포의 회복에 긍정적인 영향을 준 것으로 판단된다.

Albumin은 혈청단백의 50~70%를 차지하며 체내 단백 질대사 이상의 좋은 지표가 되며, 교질 삼투압 유지 및 생체 내 화합물과 약제를 수송하는 기능을 하고 CCl4 투 여 이후 total protein과 albumin이 유의하게 감소하는 것 으로 알려져 있다¹⁴⁾. 본 연구에서 Albumin의 농도는 대 조군과 五積散加味方 추출물 처리군 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다. 이는 간에서 생산되는 Albumin이 간세 포의 회복이 다소 진전되어도 간기능이 완전히 복구되지 않아 Albumin생산이 정상으로 회복되지 않았을 것으로 판단된다^15-18).

AST의 활성치는 대조군보다 五積散加味方 추출물 처리 군에서 현저하게 낮은 수치를 나타내었으며, 五積散加味方 추출물 첨가량이 증가함에 따라 하락하는 경향을 보였 다. ALT의 활성치는 대조군과 五積散加味方 추출물 100 mg 처리군은 상호간에 유의한 차이를 나타내지 않았으 나, 五積散加味方 추출물 200 mg 및 300 mg 처리군은 대조군보다 현저하게 하락하였다.

AST 및 ALT는 아미노산 대사에 관여하는 전이효소로 서 AST는 주로 심장, 간, 골격 및 신장순으로 많이 분포 되어 있으며 이들 조직들이 파괴되면 손상된 세포로부터 이 효소들이 방출되어 혈액 내 활성치가 높아진다. 일반 적으로 활성도의 상승은 간담도 질환 및 심장질환에서 일 어나고, 특히 급성간염의 경우에 현저하다¹⁹⁾. 또한 세포 장애 정도와 상관성이 높을 뿐만 아니라 다른 혈청 효소 에 비해 민감하게 변화하여 간염 및 간 경변 등 간질환의 지표로 널리 사용되고 있다. ALT는 세포막내 효소로서 절대량은 AST보다 적지만 심장 및 근육에 비해 주로 간 세포 내 존재하는 효소로 간의 활성도가 높아 이들 세포 의 괴사 및 파괴 정도를 반영하는 것²⁰⁾으로 잘 알려져 있 다. 특히 CCl4 처리 등 급성 간 손상 시 혈중 AST 및 ALT 의 활성도가 급격하게 증가하며, 심한 바이러스성 간염 및 독성물질에 의한 간 손상 등과 같이 상당한 간 괴사가 있는 경우에 혈액 중으로 유리되어 높은 활성을 나타내게 된다^21,22).

본 연구에서 五積散加味方 추출물 처리군들에서 간질 환지표 효소들의 활성이 하락하였으며, 이는 CCl4에 의해

손상된 간 조직의 복구에 五積散加味方 추출물이 긍정적 인 영향을 준 것으로 판단된다.

각 처리군 별 ALP, γ-GT 및 LDH의 생물학적 수치에 서 ALP는 五積散加味方 처리군 들이 대조군보다 낮은 수 치를 보였고, γ-GT는 처리군 간에 유의한 차이를 나타 내지 않았다. LDH의 효소 활성치는 CCl4 처리에 의해 상 당한 수준으로 그 활성치가 증가하였으나, 五積散加味方 처리군 들은 대조군보다 낮은 수치를 나타내었다.

ALP는 담관 손상의 지표로서 종양, 간염, 간경화 등의 질환일 경우에 증가 한다²³⁾. 간, 신장, 소장, 뼈, 태반 등 에 비교적 고농도로 존재하여 담즙 정체 시에 담즙으로 배설된다. 그러나 담즙으로의 배설장애나 담관내압 항진 으로 인해 간에서 생성량이 증가하여 혈중유입이 증가 된 다¹⁴⁾. γ-GT는 대부분의 간 질환에서 증가하며, 특히 만 성 알코올성 간 질환에서 현저하게 증가 한다²⁴⁾. 본 연구 에서는 처리군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다.

LDH는 세포내 해당 작용에 관여하는 효소로 간장기능 에 이상이 있을 경우 그 활성치가 증가 한다²⁵⁾. CCl4는 간세포 소포체의 약물대사 효소계에 작용하여 free radi- cal metabolite를 생성시켜 간세포의 손상을 야기하며, 그 결과로 혈청중의 LDH의 활성치가 상승하게 된다²⁶⁾.

본 연구에서는 간 손상으로 증가된 ALP 및 LDH 두 효 소의 활성치가 五積散加味方 처리군들에서 대조군 보다 낮은 수치를 보였다. 이로서 五積散加味方이 손상된 간세 포의 회복에 긍정적인 영향을 준 것으로 판단된다.

그리고 Total Cholesterol 및 Triglyceride량의 변동치를 알아보았는데, 생체 내에서 지질대사에 직접 관여하는 장 기는 간으로 간기능에 이상이 있을 경우 Triglyceride와 Cholesterol의 혈중양이 증가한다. 특히 담도의 이상으로 Bile acid의 배출에 문제가 생길 경우에는 전구물질인 Cholesterol량이 증가 한다¹³⁾. CCl4는 내형질 세망의 불포 화지방산을 산화시켜 과산화지질을 형성하고, 중성지질의 축적을 유도하고²⁷⁾, 사염화탄소에 의한 간 조직의 손상은 간 세포기능을 저하시킴으로써 콜레스테롤과 중성지질의 함량이 증가 한다^28,29).

본 실험의 결과에서 Cholesterol과 Triglyceride 농도가 五積散加味方 처리군들이 대조군보다 낮게 나타났다. 즉, 五積散加味方이 손상된 간장세포의 회복을 유도하여 간 장 내에서의 지질대사를 정상적으로 회복시켜 가고 있음 을 알 수 있다.

(7)

각 처리군 별 간 내 전염증성 Cytokines 농도를 알아 본 바는 다음과 같다. 간은 생체의 염증반응 시에 각종 전염증성 Cytokine들을 생산하는 기관인데³⁰⁾, 본 연구에 서 간 IL-1β 및 IL-6 농도는 五積散加味方 추출물 처리군 들이 대조군보다 낮은 값을 나타내어, 五積散加味方 추출 물에 의해 간 내 염증상태가 개선되었음을 알 수 있다.

TNF-α는 LPS shock에 의해 간장의 Kuffer cell로부터 방출되는 전염증성 사이토카인이다³¹⁾. 또한 TNF-α는 단 핵구, Kuffer cell 및 간세포에서 IL-8 생산을 자극하며, 이때 분비되는 IL-8은 간 내 중성구의 침윤과 간장 손상 을 일으키는 간경변의 예후 인자가 되는데^32-34), 본 연구 에서 CCl4 처리 후 간장 TNF-α 농도는 대조군과 五積散加味方 추출물 처리군들 간에 유의한 차이는 없었다. 이 러한 결과는 간에서 생산된 TNF-α가 혈액으로 유출된 후 소량으로 잔류 한 것에 기인한 것으로 생각된다.

항염증성 사이토카인 IL-10은 간이 주요 공급원이며 macrophage, Kupffer cell, T와 B lymphocytes 및 hep- atocytes 등에서 생성된다³⁵⁾. 점막의 Tcell 활성화와 met- alloproteinase, extracellular matrix의 결손을 하향 조절 하여 점막 손상을 억제하고, 활성화된 대식세포나 단핵구 의 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8의 합성을 억제한다^36-38). 본 연구에서 五積散加味方 추출물 처리군 모두가 대조 군보다 높은 경향을 나타내었으며, 이와 같은 결과가 전 염증성 cytokine들의 생산에 영향을 주었을 것으로 생각 된다.

Plasma IL-1β의 농도는 五積散加味方 추출물 처리군 들이 대조군보다 낮은 수치를 나타내었다. IL-1β는 monocyte, macrophage, β-cell, dendritic cell, endothe- lial cell, neutrophil 및 hepatocyte에서 분비되며, TNF-α, IL-2 및 IL-6와 함께 pro-inflammatory cytokine으로서 여 러 면역학적 작용들과 연관되어 있다. 특히 IL-1β는 T-cell의 activity를 활성화한다³⁹⁾. 또한 IL-1β와 TNF-α 는 여러 형태의 실험에서 상호 상가효과를 나타낸다는 것 이 밝혀졌으며, 급성기 염증반응에서 급격히 증가한다⁴⁰⁾ 고 알려져 있다.

IL-6는 T림프구, B림프구, 대식세포 및 섬유아세포 등 의 여러 세포에서 생산되는 Cytokine으로 면역응답, 조혈 계와 신경계세포의 증식과 분화 및 급성 반응 등에 관여

한다. 그러나 과잉 생산은 여러 가지 면역이상, 염증성 질환 및 림프계 종양의 발생과 깊은 관련이 있는 것으로 알려져 있다^41-43).

TNF-α는 대표적인 전염증성 cytokine으로 여러 가지 의 자극에 반응하여 Kuffer cell 및 monocytes와 macro- phage에 의해 방출되는 peptide mediator이며⁴⁴⁾, endo- toxin의 제거효과를 가지는 가장 중요한 mediator로 가정 되었으며⁴⁵⁾, IL-1β와 함께 감염 및 종양 생성 시 나타나 는 면역반응의 inflammatory cytokine으로 작용한다. 그 러나 다량의 TNF-α 발현은 심근 수축력 감소, 혈압강하, 대사 과정의 손상을 유발하기도 한다^46,47). 또한 T cell의 수를 감소시켜 방어체계를 무너뜨리며⁴⁸⁾, 광범위의 pathogenic 상태를 일으키고 간장 내에서 간세포의 사멸 을 일으키는 것으로 알려져 있다³¹⁾.

본 연구에서 Plasma IL-1β, IL-6 및 TNF-α농도 모두 가 五積散加味方 추출물 처리군들에서 대조군보다 낮은 수치를 보였다. 이러한 결과는 五積散加味方 추출물 처리 군 들의 간장 내 염증상태가 대조군보다 완화되었음을 시 사해준다.

Plasma IL-10은 lympocytes와 macrophage에 의해 생 산되는 강력한 pleiotropic anti-inflammatory cytokine이 며, IL-1β나 IL-6 및 TNF-α의 분비를 조절하여 면역 조 절작용에 관여하는 것으로 알려져 있으며^38,49), 전 염증성 cytokine들이 과량 분비되어 IL-10과 균형을 이루지 못할 경우, 숙주의 생존력에 크게 영향을 미친다⁵⁰⁾. 본 연구에 서는 Plasma IL-10 농도가 대조군보다 五積散加味方 추출 물 처리군 들이 유의하게 높은 값을 나타내었다. 이와 같 은 결과는 증가된 IL-10이 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 분비 를 조절하여 염증반응 완화에 영향을 주었을 것으로 생각 된다.

이상의 결과는 五積散加味方이 간 손상 회복에 긍정적 효과를 나타내었다. 하지만 약물 투여의 횟수와 용량 그 리고 기간 등에 대한 다양한 검토가 이루어지지 않았고 동물 실험이라는 한계를 가지고 있다. 다만 五積散 관련 처방의 간 손상 후 회복에 대한 기초 자료로 사용될 수 있을 것으로 판단되며, 향후 더 많은 연구가 필요할 것으 로 판단된다.

(8)

결론»»»

五積散加味方의 간기능 회복효과를 알아보기 위하여 CCl4로 간 손상을 유도한 흰쥐에게 五積散加味方 추출물 을 급여한 후 간장기능에 관여하는 혈액 내 생물학적 수 치와 cytokine 농도를 처리군 간에 비교ㆍ검토한 결과, AFP와 Total protein농도, AST, ALT 및 ALP, γ-GT, LDH의 효소 활성치들은 五積散加味方 추출물 처리군들 이 대조군 보다 낮은 수치를 나타내었으며, 五積散加味方 추출물 첨가량이 증가함에 따라 하락하는 경향을 보였다.

Total Cholesterol량과 Triglyceride량 역시 五積散加味方 추출물 처리군들이 대조군 보다 낮은 수치를 보였다.

Albumin농도는 대조군과 처리군 간에 유의한 차이를 나 타내지 않았다. 또한 五積散加味方 추출물은 전염증성 cytokine들로 분류되는 IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생산을 하락시키는 경향을 보였으며, 반면에 IL-10의 생산을 촉 진하는 경향을 보였다.

이상의 결과를 종합해 보면 五積散加味方 추출물은 간 기능 회복에 효과를 나타내는 기능성 물질들이 내재하고 있음을 알 수 있다.

참고문헌»»»

1. Rabson A, Roitt IM, Delves PJ. Really essential medical immunology. Oxford:Blackwell Publishing Ltd. 2005:

1-14.

2. Lee JC, Lee E, Lee YC, Oh H, Yoon HS, Ha TK, Hong EH. Effects of Fructus Foeniculi extract on recovering liver function. Korean J Herbology. 2007;22(4):213-18.

3. 백상철. 말초성 안면마비 환자군의 한약복용이 간기능에 미치는 영향. 원광대학교 석사학위논문. 2011.

4. 陳師文. 太平惠民和劑局方. 서울:경희대학교 출판국. 2006:

27-8.

5. 전미혜, 백승희, 신상우, 이영선. 五積散이 자궁근종세포의 사멸과 Cell Apoptosis에 미치는 영향. 대한한방부인과학 회지. 2003;16(2):45-55.

6. 한대희, 이학인. 五積散 전탕액이 해열 및 진통에 미치는 영향. 대한한의학회지. 1984;5(1):72-86.

7. 박종기, 채우석. 五積散 엑기스 과립의 경구투여와 수침이 동통에 미치는 영향. 대한침구학회지. 1992;9(1):273-91.

8. 문영희, 박영준. 五積散의 소염 진통효과에 관한 연구. 생 약학회지. 1994;25(3):258-63.

9. 손숙영, 조동현, 두호경. 가미소창음자, 가미오적산 및 가

미보중익기탕이 Gentamicin Sulfate로 유발된 白鼠腎損傷 에 미치는 영향. 경희한의대논문집. 1990;13:27-59.

10. 신규원, 이선동, 박해모, 전성진, 변진석. 다용 한약처방 투 여가 흰쥐의 신장기능에 미치는 영향. 대한예방한의학회 지. 2005;9(1):119-33.

11. 김승조, 김병각, 오도연, 손의섭. 암 어떻게 치료할 것인가.

서울:건강신문사. 2003:19.

12. 정용재. 간경화 암 나으려면 바보가 되세요. 서울:건강다이 제스트사. 2004:256.

13. 이삼열. 임상병리해석법. 서울:연세대학교출판부. 1991:61-3.

14. Kim KS, Park JH. Effect of Artemisia iwayomomi water extract on hepatic injury by carbon tetrachloride in rats II, Effect on serum ALP, LAP activities, total protein, bi- lirubin content and liver lycogen content. Kor J Res.

1992;32(3):357-64.

15. Berg B, Johansson BG. Effects on parameters of liver function, plasma lipid oncentration and lipoprotein patterns.

Acta Medica Scandinavica. 1973;194(552):13-8.

16. DeCarli LM, Lieber CS. Fatty liver in the rat after pro- longed intake of ethanol with a nutritionally adequate new liquid diet. J Nutr. 1967;91(3):331-6.

17. Lieber CS. Biochemical and molecular basis of alcohol induced injury to liver and other tissues. N Eng J Med.

1988;319(25):1639-50.

18. Lieber CS, DeCarli LM. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. J Med Prim.

1974;3(3):153-63.

19. Kim SW, Kim HW, Cho SI, Yun YC. Effects of Sayeok- sanhap-pyeongweisan-Gamibang(SPG) on Hepatological Changes in Animals Damared by CCl4. The Journal of Korean Acupuncure & Moxibustion Society. 2007;24(4):

197-207.

20. 고려의학 출판부. 간, 담도 질환. 서울:고려의학. 1989:27.

21. Jeong TC, Kim HJ, Park JI, Ha CS, Park JD, Kim SI, Roh JK. Protective effects of red gineng saponins against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity in Sprague dawley rats. Planta Medica. 1997;63:136-40.

22. Jung ME, Jung CK. Ham SS, Nam SM, Kang IJ, Kim SJ.

Biochemical and histological effects of Phellinus inteus methanol extract on liver lipid metabolism of rats CCl4 and high fat. J Korean Soc Food SCI Nutr. 2001;

30:331-7.

23. Sipes IG, McQueen CA, Gandolifi AJ, McCuskey RS, Earnest DL. Hepatic and gastrointestinal toxicology. In comprehensive Toxicology. Didcot:Pergamon. 1997:251- 71.

24. Simko V, Connell AM, Banks B. Nutritional status in al- coholics without liver disease. Amer J Clin Nutr. 1982;

35(2):197-203.

25. Mezey E. Alcoholic liver disease: roles of alcohol and malnutrition. Am J Clin Nutr. 1980;33(12):2709-81.

26. Kim SY, Kim HP, Lee MK, Byun SJ, Kim SH, Han HM,

(9)

Moon A, Huh M, Kim YC. The effect of betaine on the CCl4-induced hepatoxicity in rats. Yakhak Hoeji. 1993;

37:538-43.

27. 권미진, 남택정. 매생이가 사염화탄소로 유발된 흰쥐의 간 손상에 미치는 영향. 생명과학회지. 2006;16(5):734-9.

28. Amdur MO, Doull J, Klaassen CD. Toxicology. 4th ed.

New York:Pergamon Press. 1991:338.

29. Hayes AW. Principles and methods of toxicology. New York:Raben Press. 1982:407-45.

30. Kim DH, Yoon SH. Hepatoprotective Effect of Sosiho- tang on CCl4 induced Liver Injury in Rats. J Korean Soc.

Hygienic Sciences. 1998;4(2):1-6.

31. Hamada E, Nishida T, Uchiyama Y, Nakamura J, Isahara K, Kazuo H, Huang TP, Momoi T, Ito T, Matsuda H.

Activation of Kupffer cell and caspases-3 involved in rat hepatocyte apoptosis induced by endotoxin. J Hepatol.

1999;30(5):807-18.

32. Hill DB, Marsano LS, McClain CJ. Increased plasma interleukin-8 concentrations in alcoholic hepatitis. Hepato- logy. 1993;18(3):576-80.

33. Huang YS, Chan CY, Wu JC, Pai CH, Chao Y, Lee SD.

Serum levels of interleukin-8 in alcoholic liver disease:

relationship with disease stage, biochemical parameters and survival. J Hepatol. 1996;24:377-84.

34. Sheron N, Bird G, Koskinas J, Portmann B, Ceska M, Lindley I, Williams R. Circulating and tissue levels of neutrophil chemotaxin interleukin-8 are elevated in se- vere acute alcoholic hepatitis and tissue levels correlate with neutrophil infiltration. Hepatology. 1993;18(1):41-6.

35. Louis H, Le Moine O, Peny MO, Quertinmont E, Fokan D, Goldman M, Devière J. Production and role of interleukin-10 in concanavalin A- induced hepatitis in mice.

Hepatology. 1997;25(6):1382-9.

36. Simpson KJ, Lukacs NW, Colletti L, Strieter RM, Kunkel SL. Cytokines and the liver. J Hepatol. 1997;27(6):1120- 32.

37. Thompson KC, Trowern A, Fowell A, Marathe M, Haycock C, Arthur MJ, Sheron N. Primary rat and mouse hepatic stellate cells express the macrophage. inhibitor cytokine interleukin-10 during the course of activation in vitro. Hepatology. 1998;28(6):1518-24.

38. Pender SL, Breese EJ, Günther U, Howie D, Wathen NC, Schuppan D, MacDonald TT. Suppression of T cell-mediated injury in human gut by interleukin 10: role of matrix metalloproteinases. Gastroenterology. 1998;

115(3):573-83.

39. Delgado AV, McManus AT, Chambers JP. Production of tumor necrosis factor-alpha, interleukin1-beta, interleukin 2, and interleukin 6 by rat leukocyte subpopulations after exposure to substance P. Neuropeptides. 2003;37(6):

355-61.

40. Mathiak G, Grass G, Herzmann T, Luebke T, Zetina CC, Boehm SA, Bohlen H, Neville LF, Hoelscher AH. Cas- pase-1-inhibitor ac-YVAD-cmk reduces LPS-lethality in rats without affecting haematology or cytokine respons- es. Br J Pharmacol. 2000;131(3):383-6.

41. Hibi M, Nakajima K, Hirano T. IL-6 cytokine family and signal transduction: a model of the cytokine system. J Mol Med. 1996;74(1):1-12.

42. Hirano T, Matsuda T, Nakajima K. Signal transduction through gp130 that is shared among the receptors for the interleukin 6 related cytokine subfamily. Stem Cells.

1994;12(3):262-77.

43. Van Snick J. Interleukin-6: an overview. Annu Rev Immunol. 1990;8:253-78.

44. Chamulitrat W, Blazka ME, Jordan SJ, Luster MI, Mason RP. Tumor necrosis factor-α and nitric oxide production in endotoxin-primed rats administered carbon tetrachloride. Life Sci. 1995;57(24):2273-80.

45. Harbrecht BG, Di Silvio M, Demetris AJ, Simmons RL, Billiar TR. Tumor necrosis factor-a regulates in vivo nitric oxide synthesis and induces liver injury during endotoxemia. Hepatol. 1994;20:1055-60.

46. Vilcek J, Lee TH. Tumor necrosis factor. New insights into the molecular mechanisms of its multiple actions. J Biol Chem. 1991;266(12):7313-6.

47. Eigler A, Sinha B, Hartmann G, Endres S. Taming TNF:

Stratrgies to restrain this proinflammatory cytokine.

Immunol Today. 1997;18(10):487-92.

48. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and molecular immunology. 6th ed. Philadelphia:Elsevier saunders.

2007:354.

49. Schotte H, Schlüter B, Willeke P, Mickholz E, Schorat MA, Domschke W, Gaubitz M. Long-term treatment with etanercept significantly reduces the number of pro-inflammatory cytokine secteting peripheral blood mono- nuclear cells in patients with rheumatoid arthritis. Rheu- matology. 2004;43(8):960-4.

50. Clerici M, Ferrario E, Trabattoni D, Viviani S, Bonfganti V, Vanzon DJ. Multiple defects of T helper cell function in newly diagnosed patients with Hodgkin's disease. Eur J Cancer. 1994;30A(10):1464-70.