끄라차이담 발효물의 항산화 활성과 Tyrosinase 및 Elastase 저해활성 최미현

(1)

끄라차이담 발효물의 항산화 활성과 Tyrosinase 및 Elastase 저해활성

최미현․김경희․육홍선 충남대학교 식품영양학과

Antioxidant Activity of Fermented Kaempferia parviflora and Inhibitory Action against Tyrosinase and Elastase

Mi-Hyun Choi, Kyoung-Hee Kim, and Hong-Sun Yook Department of Food and Nutrition, Chungnam National University

ABSTRACT In this study, we measured the total phenol and flavonoid contents, radical scavenging activity, and tyrosinase and elastase inhibitory activity of Kaempferia parviflora fermented with various useful microorganisms (BS:

Bacillus subtilis, LP: Lactobacillus plantarum, LC: Lactobacillus casei, CU: Candida utilis, Y1: Saccharomyces cer- evisiae strain CHY1011, Y2: S. cerevisiae strain ZP541) to investigate the potential for future use of K. parviflora as an industrial raw material in health functional foods and cosmetics. The yield of freeze-dried powder of K. parviflora fermented by BS, LP, LC, CU, Y1, and Y2 was 56.41%, 48.28%, 48.75%, 47.12%, 41.32%, and 39.93%, respectively.

The total phenol contents were 13.88∼33.29 gallic acid equivalents mg/g, with the highest content being found in the group fermented by BS. The flavonoid contents showed the highest value in the control group (8.55 catechin hydrate (CE) mg/g), but the group fermented by BS had higher total flavonoid content (7.08 CE mg/g) than those of the other groups. The control group and the group fermented by BS had IC50 values of 0.68 mg/mL and 0.56 mg/mL based on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid) radical scavenging activities of 1.14 mg/mL and 1.46 mg/mL, respectively. The FRAP value (1 mg/mL) was highest in the control group (1.13 mM). Evaluation of the tyrosinase inhibition activity revealed values of 29.29 to 47.00% at 5 mg/mL, with the group fermented by CU having the highest value. At the same concentration, elastase inhibition activity was significantly higher, with the group fermented by BS having the highest value. The total phenol content showed a significant correlation with DPPH radical scavenging activity and elastase inhibition activity.

Moreover, the total flavonoid content was highly positively correlated with DPPH and ABTS radical scavenging activity and FRAP. Therefore, fermentation of K. parviflora using various microorganisms increases its antioxidant activity and inhibition of tyrosinase and elastase, so it can be developed for use in functional foods and cosmetics.

Key words: Kaempferia parviflora, antioxidant, fermentation, tyrosinase, elastase

Received 3 September 2018; Accepted 19 October 2018 Corresponding author: Hong-Sun Yook, Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea E-mail: [email protected], Phone: +82-42-821-6840

서 론

끄라차이담(Kaempferia parviflora Wall. ex Baker)은

‘검은 생강’이라고 알려진 생강과(Zingiberaceae)의 초본 식물로서 동남아시아, 태국, 라오스에서 생육한다(1,2). 끄 라차이담은 태국의 인삼으로 알려져 있으며(3), 요리에 흔히 쓰이지는 않지만 오래전부터 건강증진, 자극 및 활성화제로 서, 또는 알레르기, 발기부전, 천식, 설사, 위장 장애 및 곰팡 이 감염을 치료하는 등의 민간요법으로 사용되어 왔다(2).

끄라차이담의 주요 성분으로서 폴리페놀(polyphenol)은 식물의 광합성 과정에서 생성되는 것으로 활성산소로부터 자신을 보호할 수 있는 효소와 이차 대사산물로서 free rad-

ical을 수용할 수 있는 phenolic hydroxyl기를 여러 개 가지 고 있는 물질이다. 폴리페놀은 거대한 분자들과 결합하여 활성산소종을 제거한다고 알려져 있다(4-6). 또한 최근 과 학적 증거 및 인간 임상 시험에서 매일 폴리페놀을 섭취하는 것은 알레르기 증상을 호전시킬 수 있다고 밝혀지기도 하였 다(7).

폴리페놀류의 일종인 플라보노이드(flavonoid)는 끄라차 이담에 methoxyflavone 유도체로 존재한다(8). 끄라차이 담에서 분리된 methoxyflavone으로써 5,7,4’-trimethoxyflavone, 5,7,3’,4’-tetramethoxyflavone은 항원충작용을, 3,5,7,4’-tetramethoxyflavone은 항진균작용을 나타내며 (3), 5,7-dimethoxyflavone은 혈관 확장 효과가 있다고 보 고된 바 있다(9). 이외에도 끄라차이담에 대한 연구로는 항 염증 효과(10), 항위궤양 효과(11), 피부 미백 및 주름 개선 (12,13) 등이 있다.

한편 발효는 가장 오래된 역사를 가진 생물학의 기술로 산

(2)

업전반에 걸친 기술개발이 현재에도 이루어지고 있으며, 특 히 식품에서의 기술개발이 주류를 이루고 있다(14). 식물 추출물 발효식품은 건강식품에 속하는 제품유형으로서 식 품공전에 등재되어 있으며 일반적으로 여러 가지 식물성원 료에 당을 첨가하거나 유산균 등의 미생물을 첨가하여 일정 기간 발효시켜 제조한다. 현대인들이 많이 접하게 되는 가공 식품은 제조과정에서 효소들이 파괴되기 쉽고, 식품첨가물 이나 화학성분들도 효소기능을 약화시키게 되므로 현대인 의 식생활은 효소가 많이 부족해지기 쉽다. 식물체에는 여러 가지 효소가 함유되어 있고 식품 추출액을 발효시키면 많은 효소들이 활성화되어 여러 가지 생화학 반응을 일으킴으로 써 식물체의 영양성분이 소화, 흡수되기 쉬운 형태로 변환될 수 있으며, 효소작용으로 생성된 성분들에 의해 새로운 생리 조절기능을 발현할 수 있다. 또한 효소 자체를 섭취함으로써 체내에서 신진대사 기능을 촉진하게 된다(15).

이와 같이 끄라차이담은 현재까지 많은 연구가 진행되어 왔으나 대부분이 원물 자체를 유기용매 또는 열수 추출한 것을 시료로 사용한 것이 대부분이며 발효한 것에 대한 연구 는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 많은 생리기능성 을 가진 끄라차이담을 여러 유용 미생물을 이용하여 발효시 키고 미생물별 발효물의 항산화 활성 변화와 tyrosinase 및 elastase 저해활성을 조사하여 향후 건강기능식품 및 화장 품 등과 같은 산업원료 소재로서의 이용 가능성을 탐색하고 자 하였다.

재료 및 방법

실험재료

끄라차이담은 태국 현지에서 재배, 수확하여 세척하고 자 연 상태에서 25일 동안 건조한 후 껍질을 제거하고 분쇄한 것을 얻어 -50°C에 보관하며 실험에 사용하였다. 끄라차이 담 발효물의 제조는 100 mL의 DW에 2 g의 glucose와 0.5 g의 peptone을 넣고 섞은 것을 121°C에서 15분간 가압 고 온 멸균하여 실온에서 식힌 다음 미리 활성화시킨 6종의 발 효 균주를 각각 1 mL씩 넣은 후 끄라차이담 분말 10 g을 넣고 Bacillus(B.) subtilis, Candida(C.) utilis, Saccharo- myces(S.) cerevisiae는 30°C, Lactobacillus(L.) plantarum, Lactobacillus(L.) casei는 37°C에서 24시간 동안 배 양하였다. 그 후 배양액을 여과지(No. 4, Whatman, Maid- stone, UK)로 여과시킨 후 그 여액을 121°C에서 15분 동안 가압 고온 멸균시켰다. 멸균된 배양액을 -75°C의 deep freezer에 12시간 두었다가 동결건조 한 후 실험에 사용하 였다. 끄라차이담의 무발효 대조군은 끄라차이담 분말 10 g당 10배량(w/v)의 증류수로 24시간 동안 3회 추출한 후 여과지(Whatman No. 4)로 여과하고 동결건조 하여 얻은 추출물(이하 무발효군)을 사용하였다. 각 시료는 50% 에탄 올에 용해하여 실험에 사용하였다.

사용균주

끄라차이담 발효에 사용된 균주로서 B. subtilis KCTC 1022(BS), L. plantarum KCTC 3104(LP), L. casei KCTC 2180(LC), C. utilis KCCM 50342(CU)는 생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea) 및 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microor- ganisms, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, S. cerevisiae 균주들(S. cerevisiae strain CHY1011: Y1, S. cerevisiae strain ZP 541: Y2)은 빵 발효에 이용되는 효모 를 사용하였으며, 18S rRNA 서열의 유사성에 근거하여 가 장 가까운 종을 표시하였다. BS는 nutrient broth에서, LP 및 LC는 Lactobacilli MRS broth에서, CU, Y1, Y2는 YM broth에서 배양하였다. BS, CU, Y1, Y2는 30°C, LP, LC는 37°C에서 24시간 주기로 3회 계대배양 후 600 nm에서 흡 광도 값이 0.4~0.6(1×10⁵ CFU/mL) 범위 안에 들게 하여 발효 균주로 사용하였다.

사용균주에 따른 끄라차이담 발효액의 배양 특성

균주의 성장에 따른 배양액의 pH 변화는 24시간 배양 후 여과지(Whatman No. 4)에 여과한 다음 pH meter(Neomet pH 200L, Istek Co., Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였 다. 혼탁도 측정은 24시간 배양 후 여과된 발효액을 600 nm에서 흡광도를 측정(xMark™ Microplate Absorbance Spectrophotometer, Bio-Rad Laboratories, Inc., Seoul, Korea)하여 미생물의 발효 정도를 확인하였다. 생균수 측정 은 24시간 배양한 끄라차이담 발효액을 여과하여 멸균된 생리식염수에 희석해 측정하였다. 발효 희석액을 충분히 혼 합한 후 plate count agar(PCA) 및 potato dextrose agar (PDA) 배지에 분주한 다음 각각 37°C, 30°C에서 24시간 배양하여 생균수를 측정하였으며, 모든 실험구는 4회 반복 하였다.

총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis의 방법(16)을 사용하여 측정하였다. 시료 10 μL와 Folin-Ciocalteu’s reagent(Sig- ma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 10 μL를 가하여 진 탕하고 3분간 방치한 다음 10% Na2CO3 용액(Duksan Pure Chemical Co., Ltd., Ansan, Korea) 150 μL를 섞어 1시간 후 765 nm에서 흡광도를 측정(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 하였다. 결과값은 표준물질인 gallic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 수율을 적용하여 g중 mg gallic acid(GAE, dry basis)로 표시하였다.

총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등(17)의 방법을 사용 하여 측정하였다. 시료 125 μL와 증류수 500 μL를 넣어 섞은 다음 5% sodium nitrite(NaNO_2,Thermo Fisher Sci- entific Co., Ltd., Waltham, MA, USA) 37.5 μL를 넣어 5분 간 방치하고 10% aluminium chloride(AlCl₃･6H₂O, Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan) 75 μL를 넣고 6분간

(3)

방치한 다음 1 M NaOH(Samchun Pure Chemical Co., Ltd., Paeongtaek, Korea) 250 μL를 가하여 11분 후 510 nm에서 흡광도를 측정(Bio-Rad Laboratories, Inc.)하였 다. 표준물질로 catechin hydrate(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하여 검량선을 작성한 후 수율을 적용하여 g중 mg catechin hydrate(CE, dry basis)로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Blois(18)의 방법을 참고하여 측 정하였다. 일정 농도로 제조한 시료 용액 100 μL에 0.2 mM 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma-Aldrich Co.) 용액 100 μL를 가하여 섞은 후 암실에서 30분간 방치 한 다음 517 nm에서 흡광도(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 를 측정하였다. 이때 대조군으로써 시료 대신 시료를 녹인 용매인 50% 에탄올(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)을 사용하였으며 반응한 결과값을 50% 감소시키는 시료의 농 도를 IC₅₀값(mg/mL)으로 나타내었다. 양성대조구로 기존 의 항산화제인 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다. DPPH 라디칼 소거능은 아래의 식에 의해 산출하였다.

DPPH scavenging

activity (%) ＝

(

^1－absorbance of sample

)

^×100

absorbance of control

ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능의 측정은 Pellegrini 등(19)의 방법 에 따라 측정하였다. ABTS solution은 7 mM ABTS(2,2’- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), Sig- ma-Aldrich Co.)와 140 mM K2S2O8(Samchun Pure Chem- ical Co., Ltd.)을 섞어 암실에서 12~16시간 동안 방치한 후, 이를 absolute ethanol(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)과 1:88 비율로 섞어 734 nm에서 흡광도(Bio-Rad Laboratories, Inc.) 값이 0.7±0.02가 되도록 조절하여 제 조하였다. 일정 농도로 제조한 시료 50 μL에 ABTS solution 1 mL를 가한 다음 30초간 진탕하고 2.5분간 암반응시 켜 734 nm에서 흡광도(Bio-Rad Laboratories, Inc.)를 측 정하였으며, 이때 대조군으로써 시료 대신 시료를 녹인 용매 인 50% 에탄올(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)을 사 용하였으며 반응한 결과값을 50% 감소시키는 시료의 농도 를 IC₅₀값(mg/mL)으로 나타내었다. 양성대조구로 기존의 항산화제인 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용하여 비교하였다. ABTS 라디칼 소거능은 아래 의 식에 의해 산출하였다.

ABTS scavenging

activity (%) ＝

(

^1－absorbance of sample

)

^×100

absorbance of control

FRAP 측정

Ferric reducing antioxidant potential(FRAP) 측정 방 법은 Benzie와 Strain(20)의 방법을 참고하여 측정하였다.

FRAP reagent는 acetate buffer(300 mM, pH 3.6)와 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-tri- azine(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.), 20 mM FeCl3･6H2O (Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 각각 10:1:1(v/v/v) 의 비율로 섞은 후 37^oC의 incubator에서 10분간 반응시켜 제조하였다. 1 mg/mL의 농도로 녹인 시료 10 μL에 증류수 30 μL와 FRAP reagent 300 μL를 넣고 37^oC에서 10분간 암반응시킨 후 593 nm에서 흡광도를 측정(Bio-Rad Lab- oratories, Inc.)하였다. 양성대조군으로 0.1 mg/mL 농도의 ascorbic acid(Samchun Pure Chemical Co., Ltd.)를 사용 하여 비교하였으며, FRAP 활성은 0.03125, 0.0625, 0.125, 0.25 및 0.5 mM의 농도로 반복하여 작성한 FeSO₄의 검량 식에 대입하여 환산하였다.

Tyrosinase 저해능 측정

Tyrosinase 저해능은 Flurkey(21)의 방법을 참고하여 측정하였다. 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 6.8) 에 용해시킨 효소액(mushroom tyrosinase, 100 unit/mL, Sigma-Aldrich Co.) 25 μL와 기질인 10 mM L-DOPA(di- hydroxyphenylalanine, Sigma-Aldrich Co.) 50 μL, 0.1 M potassium phosphate buffer 125 μL를 혼합한 후 시료 50 μL를 첨가하여 37^oC의 incubator에서 15분간 반응시킨 다음 475 nm에서 흡광도를 측정(Bio-Rad Laboratories, Inc.)하였다. Tyrosinase 저해능은 다음의 환산식에 의하여 계산되었으며 tyrosinase 효소의 작용 저해 효과를 나타내 는 대표적인 물질인 kojic acid(Sigma-Aldrich Co.)를 양성 대조군으로 사용하여 비교하였다.

Tyrosinase inhibition

activity (%) ＝

(

^1－ ^A－B_C

)

^×100

A: Absorbance at 475 nm determined with sample B: Absorbance at 475 nm determined with buffer

instead of enzyme

C: Absorbance at 475 nm determined with buffer instead of sample

Elastase 저해능 측정

Elastase 저해능 측정은 Kraunsoe 등(22)의 방법을 참고 하여 측정하였다. 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0) buffer 350 μL 에 N-succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide(Sigma-Aldrich Co.) 125 μL와 시료 20 μL를 첨가한 후 50 μL/mL elastase (pancreatic from porcine pancreas, PPE, 1.4 units/mg, Sigma-Aldrich Co.) 5 μL를 가하여 37^oC의 incubator에서 20분 동안 반응시킨 다음 410 nm에서 흡광도를 측정(Bio- Rad Laboratories, Inc.)하였다. Elastase 저해 활성은 다음 의 환산식에 의하여 계산되었으며 노화된 피부를 개선해주 는 대표적인 물질인 ascorbic acid(Samchun Pure Chem- ical Co., Ltd.)를 양성대조군으로 사용하여 비교하였다.

(4)

Table 1. The yield of fermented K. parviflora by various micro- organism

Microorganism¹⁾ Yield (%) Control

BS LP LC CU Y1 Y2

49.21±2.13^b2)3) 56.41±1.85^a 48.28±2.90^b 48.75±1.85^b 47.12±2.01^b 41.32±1.76^c 39.93±2.01^c

1)BS: B. subtilis, LP: L. plantarum, LC: L. casei, CU: C. utilis, Y1: S. cerevisiae strain CHY1011, Y2: S. cerevisiae strain ZP541.

2)Mean±SD (n=4).

3)Different letters within a column differ significantly (P<0.05).

Table 2. pH value, turbidity, and viable cell count in the broth of K. parviflora fermented by microorganism

Microorganism¹⁾ pH Turbidity²⁾ Viable cell count (log CFU/mL) BS

LP LC CU Y1 Y2

5.89±0.01^a3)4) 3.74±0.01^d 4.58±0.00^c 5.35±0.00^b 3.72±0.01^e 3.70±0.01^f

2.98±0.07^a 1.74±0.01^d 1.47±0.02^e 2.56±0.11^b 2.48±0.04^b 2.32±0.03^c

7.81±0.09^c 6.45±0.13^d 6.23±0.15ê 6.18±0.07ê 8.75±0.06â 8.25±0.14^b

1)BS: B. subtilis, LP: L. plantarum, LC: L. casei, CU: C. utilis, Y1: S. cerevisiae strain CHY1011, Y2: S. cerevisiae strain ZP541.

2)Turbidity measurement based on OD600 in the broth of K. parviflora fermented by microorganism.

3)Mean±SD (n=4).

Elastase inhibition

activity (%) ＝

(

^1－ ^A－B_C

)

^×100

A: Absorbance at 410 nm determined with sample B: Absorbance at 410 nm determined with buffer

instead of enzyme

C: Absorbance at 410 nm determined with buffer instead of sample

통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 실시한 후 그 평균값으로 나타 내었으며, 얻어진 결과는 SPSS 24.0(Statistical Package for Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사 용하여 분산분석을 실시하였다. 유의성 검정은 다중검정범 위(Duncan’s multiple range test)를 이용하여 P<0.05 수 준에서 유의차 검정을 실시하였으며, 요인 간의 상관관계는 Pearson 상관계수(Pearson correlation coefficient)로 조 사하였다.

결과 및 고찰

끄라차이담 발효물의 수율

6종의 단일 균주를 이용하여 발효시킨 끄라차이담 발효 물의 수율은 Table 1에 나타내었다. BS 발효물이 56.41±

1.85%로 유의적으로 높게 나타났고 그다음으로 무발효군 (49.21±2.13%), LC(48.75±1.85%), LP(48.28±2.90%), CU(47.12±2.01%) 순으로 높았으나 유의적 차이를 보이지 않았다. 그다음으로 Y1(41.32±1.76%), Y2(39.93±2.01%) 가 유의적으로 가장 낮은 수율을 나타내었다. 이는 Kim 등 (23)의 6종의 단일균주 및 혼합균주를 이용하여 발효시킨 포도박 발효물에 대한 연구에서 대조군보다 발효물의 수율 이 증가하였다는 결과와 일부 다르게 나타났으나 발효물 중 BS의 수율이 가장 높았다는 결과와는 일치하였다.

사용균주에 따른 끄라차이담 발효액의 배양성 결과 여러 유용 미생물로 발효시킨 끄라차이담의 발효 정도를 확인하기 위하여 24시간 동안 발효시킨 끄라차이담 발효액

의 배양성 결과는 Table 2에 나타내었다. pH는 미생물이 생강의 유기물을 분해하고 대사산물을 축적하는 발효과정 을 통해 유기산의 축적이 이루어지면서 감소하게 된다(24).

발효하지 않은 배지의 pH 값은 6.33±0.00인 반면(data not shown), 발효한 배지에서는 3.70~5.89로 발효에 의해 pH 가 낮아져 모든 실험군에서 모두 발효가 일어났음을 확인하 였다. 이 중 BS 균주를 이용한 발효군에서 5.89±0.01로 가 장 높은 pH 값을 보였으며 CU(5.35±0.00), LC(4.58±0.00), LP(3.74±0.01), Y1(3.72±0.01), Y2(3.70±0.01)의 순서 로 높아 효모로 발효한 경우 다른 균주들에 비해 pH가 비교 적 낮은 것을 확인하였다. Lee(25)의 연구에서 방풍통성산 탕약을 pH 6.0으로 일정하게 조정한 후 여러 균주별 pH의 변화를 조사한 결과 BS 균주가 pH 5.96으로 배양 후 pH의 변화가 거의 없었다고 하였으며, Kim 등(14)은 보통 BS를 이용한 발효의 경우 pH 변화가 적다고 보고하여 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다.

미생물이 일정한 배수로 증가하는 활동은 흡광도 측정 (OD600)에 의해 부유된 미생물의 양을 측정함으로써 판단할 수 있다(26). 끄라차이담 발효 후 미생물 생장에 의한 혼탁 도 분석 결과 1.47~2.98로 나타났으며, 이는 Kim 등(14)과 Kim 등(23)의 연구에서 인삼꽃과 포도박을 LC로 발효하였 을 때 혼탁도가 가장 낮았다고 보고한 결과와 일치하였다.

끄라차이담 발효액이 미생물 생장에 미치는 영향을 검토

(5)

Table 3. Total phenol and flavonoid contents of fermented K.

parviflora by various microorganism Microorganism¹⁾ Total phenol contents

(GAE mg/g)²⁾ Flavonoid contents (CE mg/g)³⁾ Control

BS LP LC CU Y1 Y2

21.05±0.65^c4)5) 33.29±0.97^a 17.67±0.42^d 18.16±0.69^d 17.66±0.44^d 23.36±1.02^b 13.88±0.62^e

8.55±0.20^a 7.08±0.15^b 3.50±0.02^f 3.51±0.09^f 5.65±0.15^c 4.54±0.09^d 4.20±0.04^e

1)Control: water extract of Kaempferia parviflora, BS: B. sub- tilis, LP: L. plantarum, LC: L. casei, CU: C. utilis, Y1: S. cer- evisiae strain CHY1011, Y2: S. cerevisiae strain ZP541.

2)Gallic acid equivalent mg/g.

3)Catechin equivalent mg/g.

4)Mean±SD (n=3).

하기 위해 24시간 발효 후 생균수를 측정한 결과 6.18~8.75 log CFU/mL로 나타났고 Y1이 8.75±0.06 log CFU/mL로 가장 높았으며 이어서 Y2(8.25±0.14 log CFU/mL), BS (7.81±0.09 log CFU/mL), LP(6.45±0.13 log CFU/mL), CU(6.18±0.07 log CFU/mL), LC(6.23±0.15 log CFU/

mL)의 순서로 나타나 다른 균주에 비해 효모로 발효한 경우 균수가 높게 측정되었다. 따라서 균주별로 끄라차이담을 24 시간 배양하여 발효액을 제조한 경우 pH, 흡광도 측정, 생균 수 측정 결과에 의해 끄라차이담 발효가 잘 진행되었음을 확인하였으며, 이중 효모를 사용하여 발효했을 때 사용된 미생물들이 끄라차이담을 효과적으로 이용하여 자기 증식 에 이용하는 것으로 여겨진다.

끄라차이담 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량 끄라차이담 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 측 정한 결과는 Table 3과 같다. 총 페놀 함량은 발효군 및 무발 효군 중에서 BS를 이용한 발효물(33.29±0.97 GAE mg/g) 이 유의적으로 높았다. 그다음으로 Y1(23.36±1.02 GAE mg/g), 무발효군(21.05±0.65 GAE mg/g), LC(18.16±0.69 GAE mg/g), LP(17.67±0.42 GAE mg/g), CU(17.66±0.44 GAE mg/g), Y2(13.88±0.62 GAE mg/g)의 순서로 높은 함량을 보였으며 이 중 LC, LP, CU 발효물은 유의적 차이를 나타내지 않았다. 총 플라보노이드 함량은 무발효군이 가장 높은 값(8.55±0.20 CE mg/g)을 나타내었고 그다음으로 BS(7.08±0.15 CE mg/g), CU(5.65±0.15 CE mg/g), Y1 (4.54±0.09 CE mg/g), Y2(4.20±0.04 CE mg/g), LC (3.51±0.09 CE mg/g), LP(3.50±0.02 CE mg/g)의 순서로 높은 함량을 나타내었으며, 이 중 LC와 LP 발효물은 유의적 차이를 나타내지 않았다. 따라서 끄라차이담 발효 시 BS로 발효한 경우 총 페놀 및 플라보노이드의 함량이 가장 높아지 는 것으로 생각된다.

Lee 등(27)은 B. subtilis 균주를 사용한 탈지대두 grits 발효물의 80% 에탄올 추출물의 항산화 활성을 조사하였다.

그 결과 발효 전에 비해 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 이 3.8~4.8배로 증가하여 본 연구의 BS 발효물에 대한 총 페놀 함량과는 유사하나 총 플라보노이드 함량과는 반대의 경향을 나타내었다. 이와 달리 Cha 등(28)의 곰팡이 발효 참당귀 연구에 따르면 참당귀 뿌리의 폴리페놀 화합물 함량 은 2.78%였으나 A. oryzae, A. kawachii 및 M. purpureus 균주로 발효시킨 발효 당귀의 폴리페놀 화합물 함량은 각각 2.36, 2.42 및 2.32%로 감소하였으며, 플라보노이드 함량 또한 1.03%에서 발효 후 각각 0.90, 1.04 및 1.18%로 감소 하여 모든 군에서 발효에 의해 이들의 함량이 약간씩 낮아졌 으며 이러한 이유는 페놀성 화합물을 많이 함유하고 있는 식물체 추출물 사용에 의한 세포독성 작용이 추출물의 발효 에 의해 독성 작용이 경감되는 것과 무관하지 않을 것으로 추측된다고 보고하였다. 또한 Yoon 등(29)은 국내 복분자 로부터 분리된 토종효모 S. cerevisiae M-5로 발효한 블루 베리 발효주(BBM; blueberry wine fermented with S. cerevisiae M-5) 및 수입 시판건조효모 Fermivin으로 발 효한 블루베리 발효주(BBF; blueberry wine fermented with Fermivin)에 대한 항산화 활성을 비교하였으며, 그 결 과 총 폴리페놀 함량이 BBF보다 BBM에서 약 1.2배 높았고 총 플라보노이드 함량에서도 BBM이 더 높은 결과를 나타내 어 같은 효모종일지라도 균주에 따라 발효 과정 중에 생성된 알코올에 의해서 항산화 물질의 용출량이 달라진다고 보고 하였다.

끄라차이담 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 측 정한 결과 발효에 의한 식물체 세포독성 작용의 감소와 알코 올의 생성으로 생리활성 물질의 생성량이 균주에 따라 달라 지며 특히 같은 종의 균주일지라도 차이가 존재할 수 있는 것으로 생각된다.

끄라차이담 발효물의 라디칼 소거능

끄라차이담 발효물의 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소 거능을 측정한 결과는 Table 4와 같다. DPPH 라디칼 소거 능을 평가한 결과 BS 발효물이 가장 높았고 다음으로 무발 효군, CU, Y1, LP, LC, Y2 발효물의 순서로 높게 나타났다.

이때 각각의 IC50 값은 0.56±0.01 mg/mL, 0.68±0.03 mg/

mL, 0.87±0.03 mg/mL, 1.38±0.01 mg/mL, 1.72±0.09 mg/mL, 1.84±0.02 mg/mL, 1.95±0.02 mg/mL였으며 모 든 발효군 및 무발효군에서 유의적 차이를 보였다. 이는 Lee 등(27)이 탈지대두의 B. subtilis 발효물에 대해 DPPH 라디 칼 소거능을 측정 결과 발효하지 않은 것보다 RC50값이 더 낮게 나타났다는 결과와 일치하였다. 또한 발효군에서 Y2를 제외한 나머지 발효물의 라디칼 소거능이 본 연구의 총 플라 보노이드 측정 결과와 비슷한 경향성을 나타내어, 플라보노 이드 함량이 증가할수록 DPPH 라디칼 소거능이 증가하는 것으로 생각된다.

ABTS 라디칼 소거능을 평가한 결과 무발효군이 가장 높 았으며 발효물 중에서는 BS, CU, Y1, Y2, LP, LC의 순서로

(6)

Table 4. DPPH and ABTS radical scavenging activity of fer- mented K. parviflora by various microorganism

Microorganism¹⁾

IC50 (mg/mL)²⁾ DPPH radical

scavenging activity ABTS radical scavenging activity Ascorbic acid

Control BS LP LC CU Y1 Y2

0.01±0.00^h3)4) 0.68±0.03^f 0.56±0.01^g 1.72±0.09^c 1.84±0.02^b 0.87±0.03^e 1.38±0.01^d 1.95±0.02^a

0.09±0.00^f 1.14±0.02ê 1.46±0.07^d 3.17±0.14â 3.38±0.11â 1.70±0.21^d 2.16±0.10^c 2.89±0.26^b

1)Control: water extract of K. parviflora, BS: B. subtilis, LP: L.

plantarum, LC: L. casei, CU: C. utilis, Y1: S. cerevisiae strain CHY1011, Y2: S. cerevisiae strain ZP541.

2)Inhibitory activity was expressed as the mean of 50% inhibitory concentration of triplicate determines, obtained by inter- polation of concentration inhibition curve.

3)Mean±SD (n=3).

Table 5. Ferric reducing antioxidant potential (FRAP) value of fermented K. parviflora by various microorganism

Microorganism¹⁾ FRAP value (mM) (1 mg/mL)²⁾ Control

BS LP LC CU Y1 Y2

1.13±0.01^a3)4) 1.02±0.00^c 0.94±0.01^d 0.93±0.02^d 1.06±0.03^b 1.08±0.01^b 0.95±0.01^d

2)Sample concentration.

3)Mean±SD (n=3).

4)Different letters differ significantly (P<0.05).

높게 나타났다. 각 발효물의 IC50 값은 1.14±0.02 mg/mL, 1.46±0.07 mg/mL, 1.70±0.21 mg/mL, 2.16±0.10 mg/

mL, 2.89±0.26 mg/mL, 3.17±0.14 mg/mL, 3.38±0.11 mg/mL였으며 BS와 CU 발효물 및 LP와 LC 발효물에서는 유의적인 차이가 없었다. DPPH 라디칼 소거능의 경우와 같 이 ABTS 라디칼 소거능 또한 총 플라보노이드 함량이 증가 할수록 소거능이 증가하는 경향을 보였다. Vichitphan 등 (30)은 끄라차이담을 첨가하여 발효시킨 와인의 플라보노 이드를 측정한 결과 3,5,7,3’,4’-pentamethoxyflavone, 5, 7,4’-trimethoxyflavone, 5,7-dimethoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,3’,4’-tetramethoxyflavone, 5-hydroxy-7- methoxyflavone, 5-hydroxy-3,7,4’-trimethoxy flavone, 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone이 검출되었다고 보고 하였으며, 본 연구의 끄라차이담에서도 이러한 methoxy- flavone이 유효성분으로서 항산화 활성에 큰 영향을 미친 것으로 생각된다.

Kim 등(31)은 대부분의 식물체 추출물에서 폴리페놀 화 합물 및 플라보노이드 성분의 함량과 항산화 활성은 양의 상관관계를 나타낸다고 보고하였다. DPPH 라디칼 소거능 결과에서 Y2 발효물은 이와 다른 경향성을 나타내기도 하였 으나, Maxson과 Rooney(32)는 폴리페놀 화합물 또는 플라 보노이드 화합물 함량은 높으나 항산화 활성이 낮은 경우가 있다고 보고한 바 있다.

무발효군 및 발효군에 대한 DPPH 라디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능의 결과는 서로 다른 경향을 보이기도 하였는데, 일반적으로 반응속도가 빠른 ABTS 라디칼과는 달리 DPPH 라디칼의 반응속도는 화합물에 따라 매우 다르 고 비타민 C의 경우 EC50 농도에서 동적평형상태(steady state)로 도달하는 시간이 75분인데 반해 rutin의 경우 103 분이 걸린다고 알려져 있으며(33), ABTS 라디칼과 잘 반응

하는 항산화 물질이 DPPH와는 전혀 반응하지 않을 수도 있다고 한다(34). 따라서 각각의 미생물에 대한 발효 생성물 의 차이가 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성에 대한 차이를 나타내었다고 생각된다.

끄라차이담 발효물의 FRAP

끄라차이담 발효물의 FRAP 측정 결과는 Table 5와 같 다. 양성대조군인 ascorbic acid는 0.1 mg/mL의 농도에서 1.73 mM의 활성을 나타내었고 1 mg/mL 농도의 시료군에 서는 무발효군의 FRAP value(1.13±0.01 mM)가 가장 높 았으며 Y1(1.08±0.01 mM), CU(1.06±0.03 mM), BS(1.02

±0.00 mM), Y2(0.95±0.01 mM), LP(0.94±0.01 mM), LC (0.93±0.02 mM) 발효물의 순서로 높게 나타나 본 연구의 다른 항산화 측정 결과와 다소 다른 경향성을 보였다. FRAP 방법은 DPPH 라디칼 소거능 검정과 같이 직접 자유라디칼 을 소거하는 것과는 다른 원리로(35), 산성 pH에서 환원제 에 의해 ferric tripyridyltriazine(Fe³⁺-TPTZ) 복합체가 ferrous tripyridyltriazine(Fe²⁺-TPTZ)으로 전환되는 과 정을 이용한 것으로 시료 내의 총 항산화능을 측정하는 방법 이다(36). 또한 Park(37)은 목련을 Pediococcus acidi- lactici KCCM 11614P를 이용하여 0, 12, 24, 48, 72시간 동안 발효시킨 발효물의 항산화능을 측정하였으며 그 결과 DPPH 라디칼 소거능의 경우에는 모든 발효 시간군의 소거 능이 비발효군보다 모두 높았으나 FRAP 측정 결과에서는 0, 24시간 발효군이 비발효군과 비슷하거나 낮은 항산화능 을 나타내었으며 48시간 발효 시간 이후부터 FRAP value 가 급격히 증가하는 것으로 나타났다고 보고하였으므로 발 효기간에 따른 항산화 측정에 관한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

끄라차이담 발효물의 tyrosinase 저해능

Tyrosinase는 tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxy-phen- ylalanine)로의 전환에 관여할 뿐만 아니라 DOPA를 DOPA- quinone으로 전환시킴으로써 적색의 멜라닌 색소를 생성하

(7)

Table 6. Tyrosinase inhibition activity of fermented K. parvi- flora by various microorganism

Microorganism¹⁾ Tyrosinase inhibition activity (%) (5 mg/mL)²⁾

42.01±1.23^b3)4) 38.12±1.01^c 29.29±0.28^e 40.97±1.59^b 47.00±0.78^a 38.12±1.09^c 31.76±0.17^d

1)Control: water extract of K. parviflora, BS: B. subtilis, LP:

L. plantarum, LC: L. casei, CU: C. utilis, Y1: S. cerevisiae strain CHY1011, Y2: S. cerevisiae strain ZP541.

3)Mean±SD (n=3).

Table 7. Elastase inhibition activity of fermented K. parviflora by various microorganism

Microorganism¹⁾ Elastase inhibition activity (%) (5 mg/mL)²⁾

49.21±2.13^b3)4) 56.41±1.85^a 48.28±2.90^b 48.75±1.85^b 47.12±2.01^b 41.32±1.76^c 39.93±2.01^c

3)Mean±SD (n=3).

Table 8. Correlation coefficients among total phenol, flavonoid contents, DPPH, ABTS radical scavenging activity, FRAP, tyrosinase inhibition activity, and elastase inhibition activity of fermented K. parviflora by various microorganism

Factor Total

phenol Total

flavonoid DPPH ABTS FRAP Tyrosinase

inhibition Elastase inhibition Total phenol

Total flavonoid DPPH

ABTS FRAP

Tyrosinase inhibition Elastase inhibition

−

0.521^*

−

0.685^**

0.896^**

−

0.558^**

0.920^**

0.934^**

−

0.335 0.777^**

0.763^**

0.885^**

−

0.160 0.473^* 0.590^**

0.554^**

0.597^**

−

0.648^**

0.459^* 0.593^**

0.358 0.048 0.227

−

*P<0.05, ^**P<0.001.

는 중간 반응에 관여한다(38). 이때 생성되는 멜라닌은 정상 적인 상태에서는 자외선과 같은 피부자극에 대해 저항력을 높여주지만, 과도하게 생합성되면 기미, 주근깨, 검버섯과 같은 색소 침착과 피부 손상을 일으킨다. 이러한 피부 미백 효과를 측정하는 하나의 지표로 tyrosinase 활성을 측정하 고 이를 효과적으로 저해하는 생리활성물질을 탐색하는 것 이 화장품 산업에서 매우 중요한 부분이다(39). 끄라차이담 발효물의 tyrosinase 저해능의 측정 결과는 Table 6과 같 다. 양성대조군인 kojic acid는 0.5 mg/mL의 농도에서 62.40%의 저해율을 보였고 발효군 중에서는 CU 발효물이 47.00±0.78%로 유의적으로 가장 높은 저해능을 나타내었 으며 나머지 발효군 및 무발효군은 이보다 낮은 결과를 나타 내었다. Ahn 등(40)은 라벤더 추출물의 ethyl acetate 분획 과 자연 미생물 발효 추출물의 ethyl acetate 분획에서 tyrosinase 활성 저해 효과(IC50)는 각각 145 및 122 μg/mL로 발효에 의해서 활성이 높아졌으며, Yang 등(41)도 레몬밤 추출물과 발효 추출물의 경우 tyrosinase 저해 활성(IC₅₀)이 각각 365 및 122 μg/mL로 발효에 의해 활성 저해작용이 높아졌다고 하였다. Cha 등(28)의 연구에서도 당귀 뿌리 추 출물의 tyrosinase 저해 활성은 18%로 상당히 낮았으나 Aspergillus oryzae, Aspergillus kawachii 및 Monascus purpureus 균주로 발효시킨 발효 당귀에서는 각각 34, 37 및 45%로 2배 이상 증가한 것으로 나타났다고 보고하였다.

따라서 보통 발효에 의해 tyrosinase 저해능은 증가하는 것 으로 보이나 발효 균주에 따라 그 활성 정도는 달라지는 것 으로 생각된다.

끄라차이담 발효물의 elastase 저해능

Elastase는 진피 내 피부 탄력을 유지하는 기질 단백질인 elastin의 분해에 관여하며, 또한 체내의 elastin을 분해하는 백혈구 과립 효소 중 하나로 이상조직에서는 활성이 높아져 조직파괴의 직접적인 원인이 되어 피부의 주름 및 탄력성 소실 등을 유발한다(42). 따라서 elastase 저해제는 피부의 주름을 개선하는 효과가 있다. 끄라차이담 발효물의 elastase 저해능의 측정 결과는 Table 7과 같다. 발효군 및 무발 효군의 elastase 저해능은 39.93~56.41%로 나타났으며 이 중 BS 발효물이 유의적으로 가장 높았고 그다음으로 무발효 군이 높았으며 나머지 발효군은 이에 비에 낮은 활성을 보였 다. Kang 등(43)은 꾸지뽕 열매 분말에 대한 70% 에탄올 추출물(ECT), 40ôC에서 48시간 발효시킨 70% 에탄올 추 출물(FECT), B. licheniformis 균주로 40ôC에서 48시간 발 효시킨 70% 에탄올 추출물(FECTL), B. subtilis 균주로 40ôC에서 48시간 발효시킨 70% 에탄올 추출물(FECTS)의 elastase 저해활성을 조사한 결과, 발효 무처리군에 비해 발효처리군인 EFCT, FECTL, FECTS의 elastase 저해능 이 각각 19.93%, 86.19% 및 77.60% 증가하였으며 균주

(8)

발효군에서 그 활성이 월등히 증가하였다고 보고하였다. 이 는 본 연구에서 BS 발효물 외의 발효물과 다른 결과이므로 발효 균주에 따라 그 활성 정도가 달라지는 것으로 생각된다.

끄라차이담 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량, 항산화 활성, tyrosinase 및 elastase 저해능과의 상관관계

끄라차이담 발효물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량과 활 성 간의 상관관계를 분석한 결과 Table 8과 같이 모든 fac- tor에서 양의 상관관계가 나타났다. 총 페놀 함량의 상관계 수는 DPPH 라디칼 소거능과 0.685(P<0.001), elastase 저 해활성과 0.648(P<0.001)로 나타나 비교적 높은 상관성을 나타내었다. 총 플라보노이드 함량은 DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능, FRAP에서 0.896(P<0.001), 0.920 (P<0.001), 0.777(P<0.001)의 상관계수를 나타내어 매우 높은 상관성을 보였고 tyrosinase 및 elastase 저해활성과 의 상관계수에서도 각각 0.473(P<0.05), 0.459(P<0.05)로 양의 상관성을 보였다. 따라서 항산화 물질인 플라보노이드 성분은 항산화능 증가에 영향을 미치며 tyrosinase 및 elastase 저해활성과 양의 상관관계를 가지므로 항산화 건강 기 능성 소재로 활용될 수 있는 것으로 생각된다.

요 약

본 연구에서는 끄라차이담을 여러 유용 미생물(BS: Bacil- lus subtilis, LP: Lactobacillus plantarum, LC: Lactoba- cillus casei, CU: Candida utilis, Y1: Saccharomyces cerevisiae strain CHY1011, Y2: Saccharomyces cerevisiae strain ZP541)을 이용한 발효물의 총 페놀 및 플라보노 이드 함량, 라디칼 소거능, tyrosinase 및 elastase 저해 활 성을 측정하여 끄라차이담의 향후 건강기능식품 및 화장품 등과 같은 산업원료 소재로서의 이용 가능성을 탐색하고자 하였다. 발효물별 추출 수율은 BS 발효물(56.41%)이 가장 높았으며 그다음으로 무발효군(49.21%), LC(48.75%), LP (48.28%), CU(47.12%) Y1(41.32%), Y2(39.93%) 발효물 의 순서로 나타났다. 총 페놀 측정 결과 13.88~33.29 GAE mg/g의 함량을 나타내었고 BS를 이용한 발효물이 유의적 으로 높았으며 총 플라보노이드 함량은 무발효군이 가장 높 은 값(8.55 CE mg/g)을 나타내었으며 발효군에서는 BS (7.08 CE mg/g)가 가장 높았고 CU(5.65 CE mg/g), Y1 (4.54 CE mg/g), Y2(4.20 CE mg/g), LC(3.51 CE mg/g), LP(3.50 CE mg/g)의 순서로 높은 함량을 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능 측정 결과 IC50 값이 BS 발효물에서 0.56 mg/mL로 가장 활성이 높았고 무발효군(0.68 mg/mL), CU(0.87 mg/mL), Y1(1.38 mg/mL), LP(1.72 mg/mL), LC(1.84 mg/mL), Y2(1.95 mg/mL) 발효물의 순서로 높게 나타났으며 모든 시료에서 유의적 차이를 보였다. ABTS 라 디칼 소거능 측정 결과 IC50 값이 무발효군에서 1.14 mg/mL 로 가장 높았고 발효물 중에서는 BS(1.46 mg/ mL)가 가장

높았으며 CU(1.70 mg/mL), Y1(2.16 mg/mL), Y2(2.89 mg/mL), LP(3.17 mg/mL), LC(3.38 mg/mL)의 순서로 높 게 나타났다. 이때 DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거능은 총 플라보노이드 함량이 증가할수록 소거능이 증가하는 경 향을 보였으며, 이는 끄라차이담의 주요 성분인 methoxy- flavone이 유효성분으로서 항산화 활성에 큰 영향을 미친 것으로 생각된다. 끄라차이담 발효물의 FRAP 측정 결과 무 발효군의 FRAP value(1.13 mM)가 유의적으로 가장 높은 활성을 나타내었다. Tyrosinase 저해활성 측정 결과 29.29

~47.00%의 저해 활성을 나타내었으며 CU 발효물이 가장 높은 수치를 보였다. Elastase 저해능 측정 결과 39.93~

56.41%로 나타났으며 이 중 BS 발효물이 유의적으로 가장 높았다. 상관관계 분석 결과 총 페놀 함량은 DPPH 라디칼 소거능 및 elastase 저해활성과 비교적 높은 상관관계가 있 는 것으로 확인되었다. 총 플라보노이드 함량 또한 항산화 활성과 매우 높은 상관성을 나타내었으며 tyrosinase 및 elastase 저해활성과도 양의 상관관계를 나타내었다. 이상 의 연구 결과 끄라차이담을 발효시킨 경우 균주 중 Bacillus subtilis를 사용하는 것이 우수한 항산화 활성을 가지는 것 으로 생각되며 끄라차이담의 발효물은 tyrosinase 및 elastase 저해 효과가 있어 기능성 식품 및 화장품으로서 개발 가능성이 있을 것으로 생각된다.

감사의 글

본 연구는 충남대학교 자체연구과제를 통해 수행되었으며, 그 지원에 감사드립니다.

REFERENCES

1. Kobayashi H, Suzuki R, Sato K, Ogami T, Tomozawa H, Tsubata M, Ichinose K, Aburada M, Ochiai W, Sugiyama K, Shimada T. 2018. Effect of Kaempferia parviflora extract on knee osteoarthritis. J Nat Med 72: 136-144.

2. Tewtrakul S, Subhadhirasakul S. 2008. Effects of compounds from Kaempferia parviflora on nitric oxide, prostaglandin E2

and tumor necrosis factor-alpha productions in RAW264.7 macrophage cells. J Ethnopharmacol 120: 81-84.

3. Yenjai C, Prasanphen K, Daodee S, Wongpanich V, Kitta- koop P. 2004. Bioactive flavonoids from Kaempferia parvi- flora. Fitoterapia 75: 89-92.

4. Shin SR, Hong JY, Nam HS, Yoon KY, Kim KS. 2006.

Anti-oxidative effects of extracts of Korean herbal materials.

J Korean Soc Food Sci Nutr 35: 187-191.

5. Jeon YH, Kil JH, Lim SM, Kim MH, Kim MR. 2008. Anal- ysis of antioxidative activity and antimutagenic effect of ethanol extract from Schizandra chinensis Baillon. J East Asian Soc Diet Life 18: 746-752.

6. Kwon TH, Kim JK, Kim TW, Lee JW, Kim JT, Seo HJ, Kim MJ, Kim CG, Jeon DS, Park NH. 2011. Antioxidant and anti-lipase activity in Halocynthia roretzi extracts. Ko- rean J Food Sci Technol 43: 464-468.

7. Ito M, Ohara E, Kobayashi A, Yamazaki A, Kaji R, Yama- guchi M, Ishizaki K, Nara E, Ohtsubo KI. 2011. Antioxidant

(9)

capacities and polyphenol content of colored rice cultivars.

J Jpn Soc Food Sci Technol 58: 576-582.

8. Wattanapitayakul SK, Suwatronnakorn M, Chularojmontri L, Herunsalee A, Niumsakul S, Charuchongkolwongse S, Chansuvanich N. 2007. Kaempferia parviflora ethanolic ex- tract promoted nitric oxide production in human umbilical vein endothelial cells. J Ethnopharmacol 110: 559-562.

9. Tep-areenan P, Sawasdee P, Randall M. 2010. Possible mechanisms of vasorelaxation for 5, 7-dimethoxyflavone from Kaempferia parviflora in the rat aorta. Phytother Res 24:

1520-1525.

10. Sae-wong C, Tansakul P, Tewtrakul S. 2009. Anti-inflam- matory mechanism of Kaempferia parviflora in murine mac- rophage cells (RAW 264.7) and in experimental animals. J Ethnopharmacol 124: 576-580.

11. Rujjanawate C, Kanjanapothi D, Amornlerdpison D, Pojana- garoon S. 2005. Anti-gastric ulcer effect of Kaempferia par- viflora. J Ethnopharmacol 102: 120-122.

12. Jo KT. 2013. Cosmetic composition for skin whitening hav- ing Kaempferia parviflora. Korean Patent 1020130038496.

13. Choi MH, Kim KH, Yook HS. 2018. Antioxidant activity and development of cosmetic materials of solvent extracts from Kaempferia parviflora. J Korean Soc Food Sci Nutr 47: 414-421.

14. Kim KH, Kim DM, Byun MW, Yun YS, Yook HS. 2013.

Antioxidant activity of Panax ginseng flower-buds ferment- ed with various microorganisms. J Korean Soc Food Sci Nutr 42: 663-669.

15. Kim NM, Lee JS. 2003. Effect of fermentation periods on the qualities and physiological functionalities of the mush- room fermentation broth. Korean J Mycol 31: 28-33.

16. Folin O, Denis W. 1912. On phosphotungstic-phosphomo- lybdic compounds as color reagents. J Biol Chem 12: 239- 243.

17. Zhishen J, Mengcheng T, Jianming W. 1999. The determi- nation of flavonoid contents in mulberry and their scaveng- ing effects on superoxide radicals. Food Chem 64: 555-559.

18. Blois MS. 1958. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181: 1199-1200.

19. Pellegrini N, Re R, Yang M, Rice-Evans C. 1999. Screening of dietary carotenoids and carotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2,2’-azinobis(3-ethyleneben- zothiazoline-6-sulfonic acid radical cation decolorization as- say. Methods Enzymol 299: 379-389.

20. Benzie IF, Strain JJ. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem 239: 70-76.

21. Flurkey WH. 1991. Identification of tyrosinase in mushrooms by isoelectric focusing. J Food Sci 56: 93-95.

22. Kraunsoe JA, Claridge TD, Lowe G. 1996. Inhibition of human leukocyte and porcine pancreatic elastase by homo- logues of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Biochemistry 35: 9090-9096.

23. Kim KH, Yun YS, Chun SY, Yook HS. 2012. Antioxidant and antibacterial activities of grape pomace fermented by various microorganisms. J Korean Soc Food Sci Nutr 41:

1049-1056.

24. Seo YH. 2017. Antioxidant and antimicrobial activities of ginger with aging and fermentation. Korean J Food Preserv 24: 1180-1187.

25. Lee SB. 2010. A study on the biological properties of fer- mentation Bangpungtongseongsan. PhD Dissertation. Pu- kyong National University, Busan, Korea. p 31-34.

26. Alpen EL, Mandel HG. 1960. A rapid assay method for tritium in bacterial cells. Biochim Biophys Acta 43: 317-321.

27. Lee SG, Kim HJ, Lee SP, Lee IS. 2009. Antioxidant and anticancer activities of defatted soybean grits fermented by Bacillus subtilis NUC1. J Korean Soc Food Sci Nutr 38:

657-662.

28. Cha JY, Kim HW, Heo JS, Ahn HY, Eom KE, Heo SJ, Cho YS. 2010. Ingredients analysis and biological activity of fermented Angelica gigas Nakai by mold. J Life Sci 20:

1385-1393.

29. Yoon HH, Chae KS, Son RH, Jung JH. 2015. Antioxidant activity and fermentation characteristics of blueberry wine using traditional yeast. J Korean Soc Food Sci Nutr 44:

840-846.

30. Vichitphan S, Vichitphan K, Sirikhansaeng K. 2007. Flavo- noid content and antioxidant activity of KRACHAI-DUM (Kaempferia parviflora) wine. KMITL Sci Tech J 7: 97-105.

31. Kim EY, Baik IH, Kim JH, Kim SR, Rhyu MR. 2004. Screen- ing of the antioxidant activity of some medicinal plants.

Korean J Food Sci Technol 36: 333-338.

32. Maxson ED, Rooney LW. 1972. Evaluation of methods for tannin analysis in sorghum grain. Cereal Chem 49: 719-729.

33. Huang D, Ou B, Prior RL. 2005. The chemistry behind anti- oxidant capacity assays. J Agric Food Chem 53: 1841-1856.

34. Kim SJ, Kim SM, Kang SW, Um BH. 2010. The rapid de- tection of antioxidants from safflower seeds (Carthamus tinctorius L.) using hyphenated-HPLC techniques. Korean J Food Sci Technol 42: 414-419.

35. Bogin E, Abrams M. 1976. The effect of garlic extract on the activity of some enzymes. Food Cosmet Toxicol 14: 417- 419.

36. Arano MB, Cano A, Acosta M. 2001. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity. Food Chem 73: 239-244.

37. Park EH. 2016. Antioxidative, cytotoxic, and tyrosinase-inhibitory effects of natural medicinal herbs fermented with kimchi lactic acid bacteria. MS Thesis. Konkuk University, Seoul, Korea. p 37.

38. Jimenez M, Kameyama K, Maloy WL, Tomita Y, Hearing VJ. 1988. Mammalian tyrosinase: biosynthesis, processing, and modulation by melanocyte-stimulating hormone. Proc Natl Acad Sci USA 85: 3830-3834.

39. Cabanes J, Chazarra S, Garcia-Carmona F. 1994. Kojic acid, a cosmetic skin whitening agent, is a slow-binding inhibitor of catecholase activity of tyrosinase. J Pharm Pharmacol 46: 982-985.

40. Ahn YJ, Won BR, Kang MK, Kim JH, Park SN. 2009.

Antioxidant activity and component analysis of fermented Lavamdula angustifolia extracts. J Soc Cosmet Scientists Korea 35: 125-134.

41. Yang HJ, Kim EH, Park JO, Kim JE, Park SN. 2009.

Antioxidative activity and component analysis of fermented Melissa officinalis extracts. J Soc Cosmet Scientists Korea 35: 47-55.

42. DeWitt DL, Rollins TE, Day JS, Gauger JA, Smith WL.

1981. Orientation of the active site and antigenic determi- nants of prostaglandin endoperoxide synthase in the endo- plasmic reticulum. J Biol Chem 256: 10375-10382.

43. Kang DH, Kim JW, Youn KS. 2011. Antioxidant activities of extracts from fermented mulberry (Cudrania tricuspida- ta) fruit, and inhibitory actions on elastase and tyrosinase.

Korean J Food Preserv 18: 236-243.