Antioxidative and Cellular Protective Effects of Dolwoe (Gynostemma pentaphyllum Makino) Extracts against Oxidative Stress

48(2) : 125∼ 133 (2017)

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돌외(Gynostemma pentaphyllum Makino) 추출물의 산화적 스트레스에 대한 항산화 및 세포보호효과

김경미·김아랑·김아영·하지훈·현송화·정윤주·박영민·정효진·홍인기·박수남*

서울과학기술대학교 정밀화학과, 화장품종합기술연구소, 코스메틱 융·복합산업 지원 센터

Antioxidative and Cellular Protective Effects of Dolwoe

( Gynostemma pentaphyllum Makino) Extracts against Oxidative Stress

Kyoung Mi Kim, A-Rang Kim, A-Young Kim, Ji Hun Ha, Song Hua Xuan, Yoon Ju Jeong, Young Min Park, Hyo Jin Jeong, In Gi Hong and Soo Nam Park*

Department of Fine Chemistry, Seoul National University of Science and Technology, 232 Gongneung-ro, Nowon-gu, Seoul 01811, Korea, Cosmetic R&D Center, Cosmetic Industry Coupled Collaboration Center

Abatract − In this study, we investigated the total phenolic and flavonoid contents, component analysis, antioxidative activity and cellular protective effects against oxidative stress on human skin cells in 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction obtained from Gynostemma pentaphyllum (G. pentaphyllum) Makino. The DPPH (1,1-diphenyl-2-pic- rylhydrazyl) scavenging activites (FSC₅₀) of the 50% ethanol extracts, ethyl acetate fraction and aglycone fraction were 246.8, 147.2, 128.9µg/mL, respectively. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities (OSC50) of the 50% ethanol extract, ethyl acetate fraction and aglycone fraction on ROS generated in Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ system using the luminol-dependent che- miluminescence assay were 37.15, 10.74, 7.19µg/mL, respectively. We investigated the cellular protective activity and the results showed that treatment of aglycone fraction (0.05-0.39µg/mL) protect human skin cells in a concentration-dependent manner when the skin cell damages were induced by treating them with H₂O₂.These results suggest that extract/fractions of G. pentaphyllum Makino may be applicable as natural antioxidants in cosmetics.

Keywords − Gynostemma pentaphyllum Makino, Antioxidant, Cellular protective effect, Components analysis, Cosmetics

피부 노화는 피부내 생리적 요인들의 기능 감소에 의해 발생하는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외부 환경에 의한 외인성 노화(extrinsic aging)로 구분할 수 있다. 특히, 피부 가 노화하는 데 가장 큰 영향을 미치는 외인성 요인으로 자 외선을 꼽을 수 있다.^1,2) 피부가 자외선에 노출되면 피부에 서는 자외선의 작용으로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 생성된다. 이들 ROS는 피부에 광산화적 손상을 증 가시키는 노화의 원인 물질로 알려져 있다.^3,4) ROS의 종류 에는 superoxide anion radical(O₂^·−), hydroxyl radical(·OH) 과 같은 산소중심의 라디칼과 singlet oxygen(¹O₂), hydrogen peroxide(H₂O₂)와 같은 비라디칼종, 그리고 이들 ROS와 생 체분자와의 반응으로 생성된 2차 라디칼 활성종들(ROO·, RO· 및 ·ROOH)이 포함된다. 이들 ROS는 우선적으로 피부

항산화제를 파괴함으로써 피부 항산화 방어망을 붕괴시키 고 이어서 지질 과산화반응을 개시하고, 단백질 산화 및 DNA 산화 등 생체 분자들의 산화적 손상을 일으킨다. 뿐 만 아니라 자외선으로 유도된 ROS는 결합조직 단백질 분 자들을 가수분해시키는 matrix metalloprotainases(MMPs)를 발현시키고 이와 함께 피부 내 콜라겐 및 엘라스틴 분자의 절단 및 비정상적인 교차결합을 유발시킴으로써 주름생성 을 유도하는 피부 광노화를 가속화시킨다.^5-11) 하지만 피부 에는 ROS의 산화적 손상으로부터 피부를 보호하기 위한 항 산화 방어망이 구축되어 있다. 항산화 방어망은 superoxide dismutase(SOD), catalase 및 glutathione peroxidase 등의 항 산화 효소와 vitamin E, vitamin C, glutathione 등과 같은 비효소적 항산화제들로 구성되어 있다. 하지만 피부가 자외 선에 지속적으로 노출되거나 염증을 수반하는 피부질환 상 태에서 발생하는 산화적 스트레스는 피부 항산화 방어망의

*교신저자(E-mail):snpark@seoultech.ac.kr (Tel): +82-2-970-6451

붕괴를 가져오고 결국 ROS와 같은 산화제와 피부 항산화제 사이의 불균형을 초래하여 피부노화가 촉진되게 된다.^10-13) 따라서 내외적인 산화적 스트레스로부터 피부를 보호하고 항상성을 유지하기 위해서는 지속적으로 항산화제의 보충 이 필요하다. 이를 위해 비타민 E 및 C 또는 그 유도체들 을 항산화제로서 화장품에 널리 이용하고 있다. 하지만 이 들 항산화제들은 제품내에서의 불안정성이나 유도체의 경 우 활성 저하 등의 문제로 화장품에의 사용에 제한성이 종 종 나타나고 있다. 따라서 최근에는 이러한 문제점을 개선 하고자 비교적 안정하고 피부에 도포했을 때 피부 흡수 및 효능이 증대될 수 있는 안전한 천연 항산화제를 발굴하여 화장품에 응용하려는 시도들이 활발히 이루어지고 있다.^14,15) 화장품에 사용되는 천연 항산화제는 주로 식물 추출물로 플 라보노이드와 같은 페놀성 화합물들이 주성분들이다. 천연 의 플라보노이드는 대부분 배당체 형태로 존재하지만 당이 없는 아글리콘 성분들은 피부 흡수 및 항산화능이 배당체 보다 일반적으로 더 크다. 이러한 연구들은 저자들의 선행 연구에서도 여러 번 보고한 바가 있다.^16-18)

박과(Cucurbitaceae)에 속하는 돌외(G. pentaphyllum Makino) 는 다년생 덩굴성 초본류로써, 예로부터 칠엽담(七葉膽) 또 는 덩굴차 및 덩굴감차라고도 불린다. 우리나라 남부와 일 본, 중국 등 아시아 지역에서 분포되어있다.¹⁹⁾구황본초통 해(救荒本草通解)에 의하면 사람이 섭취하여도 해가 없으며, 중국의 중약대사전(中約大辭典)에서는 전초 또는 지상부위 를 차나 술로 만들거나 약용으로 쓴다는 기록이 있다.²⁰⁾돌 외 추출물은 항산화, 항균, 항당뇨 및 항위궤양 등의 활성 이 보고되었다.^21-24) 돌외의 주성분으로는 사포닌 계열의 gypenoside가 있으며, 그 외에 플라보노이드, 카로티노이드 및 알칼로이드 등이 보고되고 있다.^25-27)

하지만 돌외 추출물이나 특정 분획에 대한 피부 노화에 중 요한 작용을 나타내는 다양한 ROS를 대상으로한 Fe³⁺-EDTA/

H₂O₂계에서의 총항산화능이나 사람 피부세포에서의 자외선 또는 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스에 대한 보호효 과에 관한 연구는 아직 보고된 바가 없다. 본 연구에서는 돌 외 추출물, 추출물의 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획을 제 조하고 이들의 항산화능 및 세포보호효과 그리고 활성분획 의 성분 분석을 통해 화장품의 기능성 항산화 소재로서 가 능성이 있는지를 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

기기 및 시약 − 실험에 사용한 UV-visible spectrophotometer 는 Varian(Astralia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT 제품을 사용하였다. 성 분 분리를 위한 thin layer chromatography(TLC, aluminum sheet silica gel 60 F254)는 Merck(USA)에서 구입하였고,

HPLC는 Shimadzu(Japan) 제품을 사용하였다. LC/ESI-MS/

MS(Applied Biosystems, USA)는 서울대학교 농생명과학 공 동기기원에 분석 의뢰하였다. MTT 실험에서 사용되는 ELISA reader는 Tecan(Austria)사의 제품을, pH 미터는 Mettler-Toledo(Switzerland)를 사용하였다.

Folin-ciocalteu’s phenol reagent, 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl(DPPH) radical, luminol, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), FeCl₃·6H₂O, H₂O_2, (+)-α-tocopherol(1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 및 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)- 2,5-di-phenytetrazolium bromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.(USA)에서 구입하였다. 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc) 등 각종 용매는 시판특급 시약을 사용하였다. 본 실험에 사용한 돌외는 국내 재생으로 ㈜지 에프씨에서 제공받았으며 교신 저자인 서울과학기술대학교 박수남 교수가 검증한 후 실험에 사용하였다.

돌외 추출물 및 분획물 제조 − 건조된 돌외 전초 150 g을 50% 에탄올 3 L 침적시키고 24 hr 동안 교반하여 추출 후 Fig. 1과 같은 방법으로 분획하였다. 50% 에탄올 추출물 35 mL를 40^oC에서 감압 농축하여 파우더를 얻었다. 남은 50% 추출물은 감압증류 한 후 n-헥산을 처리하여 클로로필 등의 비극성 성분을 제거하였다. 항산화능이 큰 플라보노이 드 및 그 배당체들은 에텔아세테이트 용매로 추출하고 감 압 농축하여 파우더를 얻어 실험에 사용하였다. 에틸아세테 이트 분획 중 일부를 H₂SO₄ 및 아세톤 용액을 이용하여 산 가수분해 반응을 통해 당을 제거시키고 5% KOH-MeOH로 중화 적정 후 증류수로 산, 염기 및 당 등을 제거 한 후 에 틸아세테이트로 추출하고 감압·농축하여 아글리콘 파우더를 제조하여 사용하였다(Fig. 1).

총 페놀성 화합물 및 플라보노이드 함량 측정 − 돌외 추 출물 중의 총 페놀성 화합물 함량 측정은 Alves 등의 방법

Fig. 1. Scheme for preparation of extract/fractions from G.

pentaphyllum Makino.

을 이용하였다.²⁸⁾ 200 μg/mL 농도의 추출물 80 μL에 Folin- Ciocalteu 시약(50% v/v)을 20 μL를 가한 다음, 25^oC에서 5 min 반응시킨다. 여기에 포화 Na₂CO₃용액(2% w/v) 200 μL 를 가하여 혼합하고 25^oC에서 30 min 반응시킨 후 ELISA reader(Tecan, Austraia)로 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Gallic acid를 표준물질로 하여 농도별(0-50 μg/mL) 표준곡 선을 작성한 후 총 페놀성 화합물 함량을 구하였다.

돌외 추출물의 총 플라보노이드 함량은 Zhishen 등의 방 법을 이용하였다.²⁹⁾ 2 mg/mL 농도의 추출물 30 μL에 증류 수 120 μL를 가한 다음, NaNO₂(25% w/v) 9 μL를 넣고 25^oC 에서 5 min 반응시켰다. 이 용액에 AlCl₃(10% w/v) 9 μL를 넣고, 1 min 후 NaOH(1 M) 60 μL와 증류수 72 μL를 가한 뒤 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 quercetin 을 이용하여 농도별(0-100 μg/mL) 표준곡선을 작성한 후 총 플라보노이드 함량을 구하였다.

DPPH법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성 − 자유 라디 칼은 피부노화의 주된 원인으로 알려져 있다. 따라서 돌외 추출물에 대한 자유라디칼 소거활성 측정은 DPPH를 이용 하였다. 실험방법은 메탄올에 용해시킨 0.2 mM DPPH 용 액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 추출물 1 mL을 첨가하여 섞은 다음 25^oC에서 10 min동안 방치 후 자유 라디칼의 양을 분광광도계로 517 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 돌외 추출물 및 분획물의 자유 라디칼 저해율은 식 (1)에 따라 DPPH 시약을 넣지 않은 것을 blank, 추출물 또는 분획물을 넣지 않은 것을 대조군(control)으로 하여 계 산하였다.

Radical scavenging (%) =

(1) A_Experiment는 실험군의 흡광도(absorbance), A_Blank는 blank 의 흡광도, A_Control는 control의 흡광도를 의미한다. 농도에 따라 각각 세 번씩 측정하였으며, 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging concentration, FSC₅₀, μg/mL)를 구하여 비교하였다.

루미놀 발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 계에서 활성 산소 소거 활성(총 항산화능) − 루미놀은 각종 ROS(O₂^•_,

·OH 그리고 H₂O₂)에 의해 산화되어 들뜬 상태의 아미노프 탈산이 된 후 발광(420-450 nm)하는 것으로 알려져 있다.

이 실험에서는 luminol과 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에서 생성된 각 종 ROS간의 반응을 통한 화학발광을 측정함으로써 총 항 산화능을 측정할 수 있다. 실험방법은 화학발광 측정용 튜 브에 증류수 1.78 mL를 넣고 다양한 농도의 돌외 추출물과 2.5 mM EDTA 40μL 및 5 mM FeCl₃·6H₂O 10μL를 가한 후 35 mM 루미놀 80 μL를 넣고 흔들어 섞어 화학발광기의

cell holder에 튜브를 꽂는다. 5 min 동안 항온시킨 후 Fenton 반응을 일으키기 위해 150 mM H₂O₂ 40μL를 넣고 25 min 동안 화학발광 정도를 측정하였다. 대조군(control)은 시료 용액 대신 증류수를 첨가하였고, 공시험(blank)는 시료군과 조건이 동일하나 H₂O₂와 FeCl₃·6H₂O를 첨가하지 않았다.

화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널간의 차이가 거의 없도록 하였다. 활성산소 소거활성은 다음 식에 의해 계산되었고 활성산소 소거활성 의 크기는 식 (2)에 따라 화학 발광의 세기가 50% 감소되는 데 필요한 시료의 농도(reactive oxygen species scavenging activity, OSC₅₀, μg/mL)로 표기하였다.

Oxygen radical scavenging (%)=

(2) 돌외 추출물 및 분획물의 HaCaT 세포 독성 평가 − 돌 외 50% 에탄올 추출물과 분획물이 세포생존율에 미치는 영 향을 MTT 방법으로 확인하여 실험에 사용될 시료의 농도 범위를 결정하였다.실험방법은 HaCaT 각질형성세포를 96- well plate에 접종한 후 37^oC 세포배양기에서 70-80% 정도 까지 배양하였다. 돌외 50% 에탄올 추출물과 분획물을 농 도 별로 세포에 24 hr 처리한 후, 2 μg/mL 농도의 MTT 용 액을 첨가하여 30 min 동안 반응시켜 formazan 결정을 생 성시켰다. MTT 용액을 제거하고 생성된 formazan 결정을 DMSO에 용해하여 570 nm 파장에서 ELISA reader로 흡광 도를 측정하였다. 비 처리군(untreated group)에 의한 흡광 도를 음성 대조군(100%)으로 하여 식 (3)에 따라 처리군 (treated group)에 대한 상대적인 세포생존율을 구하였다.

Cell viability (%) = (3)

과산화수소로 유도된 세포손상에 대한 세포보호효과 − HaCaT 세포를 1×10⁴ cells/well로 96-well plate에 분주하고 24 hr 동안 37^oC, 5% CO₂ 조건으로 incubator에서 배양하였 다. 24 hr incubation후, 배지를 모두 제거하고 PBS 100 μL 로 1회 세척하였다. PBS를 모두 제거 후, 과산화수소 6 mM 농도(in PBS)로 30 min 처리하였다. 과산화수소를 모두 제 거 후, PBS 100 μL로 2회 세척하였다. 세척 후, 1% PBS를 함유한 DMEM 배지에 돌외 50% 에탄올 추출물과 분획물 을 농도별로 희석하여 처리한 후, 37^oC, 5% CO₂ 조건으로 incubator에서 24 hr 배양하였다. 24 hr incubation후, MTT assay로 세포생존율을 확인하여 과산화수소로 유도된 세포 손상에 대한 돌외 50% 에탄올 추출물과 분획물들의 세포 보호효과를 확인하였다.

돌외 추출물의 성분분석 − 돌외 추출물의 플라보노이드 성분을 동정하기 위하여 TLC, HPLC, LC/ESI-MS/MS을 이 1 (A_Experiment–A_Blank)

AControl

---

⎩ – ⎭

⎨ ⎬

⎧ ⎫

×100

1 (AControl–AExperiment) A_Control–A_Blank

( )

---

⎩ – ⎭

⎨ ⎬

⎧ ⎫

×100

Atreated group

Auntreated group

--- 100×

용하여 분석하였다.

TLC 및 HPLC를 이용한 돌외 추출물의 성분 분석 − TLC 전개용매는 ethyl acetate:chloroform:formic acid:distilled water = 10:5:0.5:0.4(v/v) 및 ethyl acetate:chloroform:formic acid:distilled water = 8:1:0.5:0.4(v/v)를 사용하였다. TLC에 서 성분 동정을 위해 표준물질의 R_f 값, 자외선 그리고 2- aminoethyl diphenylbroinate-polyethylene glycol(NP-PEG) 발색법을 이용하였고 이미 보고된 분광학적 자료를 참고하 였다.

돌외 추출물의 성분 분석을 위해 TLC로부터 각각의 띠 를 긁어 100% 에탄올로 추출한 후 여과·농축하여 파우더를 얻었다. HPLC 분석은 2% acetic acid 및 0.5% acetic acid 의 50% acetonitrile 용액을 기울기 용리법으로 분리하였고, 이때, HPLC 분리조건은 Table I에 나타내었다.

HPLC 및 LC/ESI-MS/MS를 이용한 돌외 추출물의 성 분 분석 − LC 분석은 autosampler와 PDA-UV detector가 장 착된 Thermo-Finnigan Surveyor instrument(Thermo Scientific, USA)를 사용하였다. 컬럼은 U-VDSpher Pur C18-E(2.0×

50 mm, 1.8μm)을 사용하였다. 이동상은 0.1% formic acid (in D.W)(solvent A):0.1% formic acid(in acetonitrile)(solvent B)로 하였으며, 유속은 200 μL/min이며, injection volume은 5μL로 하였다. MS/MS 분석은 Thermo-Finnigan LCQ Deca XP plus ion trap mass spectrometer, with ESI interface를 사용하였다. Negative ion model로 capillary voltage는 -3500 V, nebulizer gas(N₂) 10(arbitrary units), collision gas (N₂) 그리고 ion source temperature는 400^oC에서 행하였다.

통계처리 − 본 연구의 모든 실험은 3회 반복하여 실시하 였고 통계자료의 값은 mean±SD.로 표시하였다. 통계적 유 의성 검증은 Graphpad Prism 5.0(San Diego, CA)프로그램 을 이용하였으며, one-way ANOVA 검정을 적용하여 p<0.05 유의수준에서 유의성 검정을 실시하였다.

결과 및 고찰

돌외 추출물과 분획물의 수율, 총 페놀성 화합물 및 플 라보노이드 함량 측정 − 침적하여 얻은 돌외 50% 에탄올 추출물을 여과하고 감압증발기를 이용하여 여과된 추출물 을 건조시켜 50% 에탄올 추출물을 얻었다. 수율은 돌외 원 물 건조 중량당 18.1%이었다. 50% 에탄올 추출물로부터 얻 어진 에틸아세테이트 분획물의 수율은 1.3%였으며, 에틸아 세테이트 분획물로부터 얻어진 아글리콘 분획물의 수율은 0.7%였다(Table II).

페놀 및 플라보노이드는 주로 항산화능을 나타내는 물질 로서 천연물의 항산화력을 결정하는데 중요한 화합물로 알 려져 있다. 돌외 1 g 50% 에탄올 추출물 파우더, 에틸아세 테이트 분획물 파우더 또는 아글리콘 분획물 파우더 각각 에 포함되어 있는 총 페놀성 및 플라보노이드 함량을 Table II에 나타내었다. 돌외 50% 에탄올 추출물과 분획물에 함유 된 페놀성 화합물의 함량을 gallic acid의 양으로 환산하여 표시한 결과, 추출물 또는 분획물 중 아글리콘 분획물 (517.2 mg/g)이 에틸아세테이트 분획물(409.8 mg/g), 50% 에 탄올 추출물(197.8 mg/g)보다 높게 나타났다. 총 플라보노이 드 화합물의 함량은 quercetin의 양으로 환산하여 나타내었 으며 추출물 또는 분획물 중 아글리콘 분획물(103.4 mg/g) 이 에틸아세테이트 분획물(99.6 mg/g), 50% 에탄올 추출물 (47.8 mg/g)보다 높게 나타났다.

DPPH 시험법을 이용한 자유 라디칼 소거 활성 − 피부 가 자외선에 노출되어 생성되는 ROS에는 ·OH, O₂^·−과 같 은 홀 전자를 갖는 자유라디칼이 포함되어 있다. 이러한 홀 전자를 가지고 있는 라디칼은 에너지가 높고 반응성이 크 기 때문에 세포막에서 지질 과산화반응의 자동산화반응을 개시시킬 수 있다. 자동산화 반응이 개시되면, 생체 내 구 성물질이 산화과정을 거치며 피부노화가 일어나게 된다. 이 때, (+)-α-tocopherol, 플라보노이드 등의 항산화제는 ROS 및 유도된 지질 라디칼에 의해 개시된 지질과산화 반응인 연쇄반응에서 지질 과산화라디칼에 수소 주개로 작용하여 연쇄반응을 종결시킨다. 시료의 항산화능은 전자를 제공함 으로써 라디칼을 소거하는 능력인 환원력을 통하여 측정할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 비교적 안정한 라디칼로 존 Table I. HPLC conditions for separation of ethyl acetate

fraction and aglycone fraction from G. pentaphyllum Makino Column Shim-pack VP-ODS C18 (L:250 nm,

LD:4.6 mm)

Detector UVD 170s DIONEX Flow rate 1.0 mL/min

Injection volume

20μL Mobile

phase

A: 2% acetic acid in D.W

B: 0.5% acetic acid in 50% acetonitrile solution

Gradient elution

0-10.0 min, 0% (v/v) of B; 10.0-30.0 min, 0- 20% (v/v) of B; 30.0-100.0 min, 20-80% (v/v) of B; 100.0-110.0 min, 80% (v/v) of B; and 110.0-115.0 min, 80-0% (v/v) of B

Table II. Yields and bioactive compounds contents of G.

pentaphyllum Makino extract/fractions Yields

(wt%)

Total phenolic (gallic acid,

mg/g)

Total flavonoid (quercetin,

mg/g) 50% EtOH extract 18.1 197.8 47.8

EtOAc fraction 1.3 409.8 99.6 Aglycon fraction 0.7 517.2 103.4

재하는 DPPH를 이용하여 돌외 추출물의 라디칼 소거활성 을 측정하였다. 돌외 50% 추출물과 분획물 및 대조군으로 기존에 강력한 지용성 항산화제로 알려진 (+)-α-tocopherol 의 자유라디칼 소거활성 측정 결과를 Fig. 2에 나타내었다.

돌외의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아 글리콘 분획의 라디칼 소거활성(FSC₅₀)은 각각 246.82, 147.18 및 128.89 μg/mL으로 나타났다. 에틸아세테이트 분 획 및 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성이 50% 에탄올 추 출물의 활성보다 크게 나타났으며, 특히 아글리콘 분획의 라디칼 소거 활성이 가장 높게 나타났다. 에틸아세테이트 분 획과 아글리콘 분획에서 라디칼 소거활성이 크게 나타난 것 은 함유된 플라보노이드의 함량이 크기 때문인 것으로 추정 된다. 비교물질로 사용한 지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol (FSC₅₀, 8.98μg/mL)보다는 낮은 활성을 보였지만, 아글리콘 분획은 50% 에탄올 추출물보다 약 2배 높은 활성으로 가 장 높은 DPPH 자유 라디칼 소거활성을 나타내었다.

루미놀 발광법을 이용한 Fe³⁺-EDTA/H₂O₂계에 있어서 활성 산소 소거활성(총 항산화능) − Fe³⁺-EDTA/H₂O₂ 계에 서는 Fenton 반응을 통해 생성된·OH, H₂O₂와 같은 ROS가 생성되고, 생성된 ROS는 루미놀을 산화시킨다. 루미놀은 ROS 의해 산화되어 들뜬 상태의 아미노프탈산이 된 후 420- 450 nm에서 발광하는 것으로 알려져 있다. 이 계에서는 다 양한 종류의 활성산소가 생성되기 때문에 이들 활성산소종 들에 대한 총 항산화능을 측정할 수 있다. 돌외 50% 추출 물과 분획물 및 대조군으로 수용성 항산화제로 L-ascorbic acid의 총 항산화능(OSC₅₀) 측정 결과를 Fig. 3에 나타내었다.

돌외 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획 및 아글리 콘 분획의 활성산소 소거활성은 각각 37.15, 10.74 및 7.19 μg/

mL로 나타났다. 라디칼 소거 활성과 마찬가지로 에틸아세 테이트 분획 및 아글리콘 분획의 총 항산화능이 50% 에탄 올 추출물의 활성보다 크게 나타났으며, 특히 아글리콘 분

획의 총 항산화능이 가장 높게 나타났다. 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획에서 총 항산화능이 크게 나타난 것 은 함유된 플라보노이드의 함량이 크기 때문인 것으로 추 정된다. 비교물질로 사용된 수용성 항산화제로 잘 알려진 L-ascorbic acid(OSC₅₀,50μg/mL)보다 낮은 활성을 보였지 만, 아글리콘 분획은 50% 에탄올 추출물 보다 약 5배 높은 활성으로 가장 높은 총 항산화 활성을 나타내었다.

돌외 추출물 및 분획물의 HaCaT 세포 독성 평가 − MTT 방법으로 돌외 추출물 및 분획물이 사람각질형성세포에 대 한 세포독성을 확인함으로써 실험에 사용될 시료의 농도범 위를 결정하였다. 0.4-400 μg/mL의 돌외 50% 에탄올 추출 물과 분획물의 세포 생존율을 Fig. 4에 나타내었다. 돌외 50% 에탄올 추출물은 25 μg/mL, 에틸아세테이트 분획물은 Fig. 2. Free radical scavenging activities of extract/fractions

from G. pentaphyllum Makino and reference. Data are indi- cated as mean±SD. *p<0.05 compared with (+)-α-tocopherol.

Fig. 3. ROS scavenging activities of extract/fractions from G.

pentaphyllum Makino and reference. Data are indicated as mean±SD. *p<0.05 compared with L-ascorbic acid.

Fig. 4. Effects of 50% ethanol extract/fractions from G. pen- taphyllum Makino on HaCaT cells viability. HaCaT cells were treated with different concentration of samples, and cytotoxic- ity was then determined by the MTT assay. Data are presented as mean±SD. *p<0.05 compared with untreated control in 50% ethanol extract dose-treated groups, ^#p<0.05 compared with untreated control in ethyl acetate fraction dose-treated groups, ^¶p<0.05 compared with untreated control in aglycone fraction dose-treated groups.

6.25μg/mL, 아글리콘 분획은 3.13 μg/mL의 농도까지는 세 포독성을 나타내지 않았다. 따라서 본 실험에서는 이를 바 탕으로 돌외 50% 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획 및 아글리콘 분획의 최고 농도를 3.13 μg/mL으로 설정하였다.

과산화수소로 유도된 세포손상에 대한 세포보호효과 − 과 산화수소는 세포 내에서 O₂^·−이 SOD로 촉매되어 생성되거 나, 자외선 조사에 의해서 과잉 생산되면 산화적 손상을 일 으킨다. 활성산소인 과산화수소는 세포막을 통과하여 생체 내 미량으로 존재하는 금속이온과 반응하여 다른 ROS를 생 성시켜 세포손상을 야기시킨다.³⁰⁾ 돌외 50% 에탄올 추출물 및 분획물의 과산화수소로 유도된 HaCaT 세포의 세포보호 효과를 Fig. 5에 나타내었다.

실험 결과, 과산화수소를 처리한 실험군은 처리하지 않은 군에 비하여 약 50%의 생존율을 나타내었다. 50% 에탄올

추출물 처리 군의 세포생존율은 모든 농도에서 미미한 수 준으로 증가하지 않았다. 그러나 에틸아세테이트 분획과 아 글리콘 분획에서 H₂O₂로 유도된 세포 손상에서 보호효과를 나타내었다. 그 중에서, 아글리콘 분획은 0.05-0.39 μg/mL 농도에서 각각 53.5, 54.8 및 53.8으로 최대 55% 증가하였 다. 즉, 아글리콘 분획물이 과산화수소로 유도된 세포손상 에 대한 보호효과를 나타냈다.

돌외 분획물의 성분분석 − 돌외의 에틸아세테이트 및 아 글리콘 분획의 성분을 확인하기 위해, TLC 크로마토그램에 서 극성도가 다른 다음의 2개의 용매조건을 이용하였다(A 조건; ethyl acetate:chloroform:formic acid:DW = 8:1:0.5:0.4 (v/v), B조건; ethyl acetate:chloroform:formic acid:DW = 10:

5:0.5:0.4(v/v)). TLC 크로마토그램에서 돌외 아세테이트분 획은 Fig. 6에 아글리콘분획은 Fig. 7에 각각 나타내었다. A 조건에서 아랫부분에 있는 3개의 띠들(GPME1, GPME2, GPME3)을 분리했으며(Fig. 6A, 7A), B조건에서 윗부분의 4개의 띠들(GPME4, GPME5, GPME6, GPME7)을 분리했 다(Fig. 6B, 7B). 성분 분석을 위해, 돌외의 에틸아세테이트 분획의 TLC로 분리된 GPME1-7띠들을 추출하여, LC/ESI- MS를 이용하였다(Table III).

돌외 에틸아세테이트 분획의 GPME1은 kaempferol 3-O- β-rutinoside, GPME2는 quercetin 3-β-O-glucoside, GPME3 는 astragalin, GPME4는 caffeic acid, GPME5는 quercetin, GPME6는 ferulic acid, GPME7은 kaempferol로 확인되었으 며, 표준물질을 이용하여 TLC, HPLC 및 UV-Visible 흡수 스펙트럼 결과와 참고논문을 통해 최종적으로 확인하였다 (Fig. 6-8, Table III). TLC 크로마토그램에서 분리한 성분들 (GPME1-7)과 HPLC의 피크들을 비교한 결과는 GPME1은

Fig. 5. (A) Cell protective effects of 50% ethanol extract/frac- tions from G. pentaphyllum Makino on H₂O₂-induced HaCaT cell. HaCaT cells were treated with different concentration of sample for 24 h after being exposed to oxidative stress.

*p<0.05 compared with untreated control in 50% ethanol extract dose-treated groups, ^#p<0.05 compared with untreated control in ethyl acetate fraction dose-treated groups, ^¶p<0.05 compared with untreated control in aglycone fraction dose- treated groups. (B) Rate of increace in proliferation of ell pro- tective effects. -●-: 50% EtOH extract, -■-: EtOAc fraction, -▲-: aglycone fraction. Data are presented as mean±SD.

Fig. 6. TLC chromatogram of ethyl acetate fraction from G.

pentaphyllum Makino and references. (A) Eluent system: ethyl acetate : chloroform : formic acid : DW = 8 : 1 : 0.5 : 0.4 (v/

v), ① kaempferol 3-O-β-rutinoside, ② ethyl acetate fraction,

③ quercetin 3-β-O-glucoside, ④ astragalin. (B) Eluent sys- tem: ethyl acetate : chloroform : formic acid : DW = 10 : 5 : 0.5 : 0.4 (v/v), ① caffeic acid, ② quercetin, ③ ethyl acetate fraction, ④ ferulic acid, ⑤ kaempferol.

peak 3(kaempferol 3-O-β-rutinoside), GPME2은 peak 5 (quercetin 3-β-O-glucoside), GPME은 peak 4(astragalin), GPME4은 peak 1(caffeic acid), GPME5은 peak 6(quercetin) GPME6은 peak 2(ferulic acid), GPME7은 peak 7(kaemp- ferol)로 나타났다. HPLC에서 에틸아세테이트 분획 및 아글 리콘 분획(Fig. 8B)의 성분 변화를 확인하였으며, 플라보노 이드의 배당체인 peak 3-5번이 두드러지게 감소하거나 사 라졌고, peak 6(quercetin)및 peak 7(kaeampferol)의 함량이 증가함을 보였다.

결론적으로 돌외 에틸아세테이트 분획보다 아글리콘 분 획에서 당이 제거된 아글리콘 구조의 플라보노이드가 증가 함을 확인할 수 있으며, 이러한 성분 변화가 그들의 활성에 차이를 나타냈을 것으로 사료된다.

Fig. 7. TLC chromatogram of aglycone fraction from G. pen- taphyllum Makino and references. (A) Eluent system: ethyl acetate : chloroform : formic acid : DW = 8 : 1 : 0.5 : 0.4 (v/

v), ① kaempferol 3-O-β-rutinoside, ② quercetin 3-β-O-gluco- side, ③ aglycone fraction, ④ astragalin. (B) Eluent system:

ethyl acetate : chloroform : formic acid : DW = 10 : 5 : 0.5 : 0.4 (v/v), ① caffeic acid, ② quercetin, ③ aglycone fraction,

④ ferulic acid, ⑤ kaempferol.

Table III. LC/ESI-MS characteristics of ethyl acetate fraction from G. pentaphyllum Makino in ion mode

TLC band

HPLC pack No.

Identified compound

Retention time (min)

Molar mass (g/

mol)

λ_max (nm)

MS ions

Reference Negative

ions (m/z) [M-H]^-

Positive ions (m/z) [M+H]⁺ GPME1 3 Kaempferol 3-O-β-rutinoside

C₂₇H₃₀O₁₅

59.988 594.5 264.8, 347.1 - 595.3 31) GPME2 5 Quercetin 3-β-O-glucoside

C₂₁H₂₀O₁₂

76.313 464.4 255.7, 355.1 - 465.6 32)

GPME3 4 Astragalin

C₂₁H₂₀O₁₁

61.531 448.4 265.4, 343.9 447.2 449.1 33) GPME4 1 Caffeic acid

C₉H₈O₄

36.971 180.2 292.4, 331.0 - 181.1 34)

GPME5 6 Quercetin

C₁₅H₁₀O₇

100.515 302.2 254.4, 370.4 301.3 303.3 35) GPME6 2 Ferulic acid

C₁₀H₁₀O₄

50.335 194.2 279.1, 325.0 - 195.1 35)

GPME7 7 Kaempferol

C₁₅H₁₀O₆

115.605 286.2 264.4, 365.1 - 287.0 36) Fig. 8. The HPLC chromatograms of ethyl acetate fraction (A) and aglycone fraction (B) from G. pentaphyllum Makino at 360 nm absorbance. 1: GPME4, 2: GPME6, 3: GPME1, 4:

GPME3, 5: GPME2, 6: GPME5, 7: GPME7.

결 론

본 연구에서는 돌외 50% 에탄올 추출물과 분획물들의 총 페놀성 화합물과 플라보노이드 함량, 항산화 및 세포보호효 과를 평가하고 추출물의 성분분석을 진행하였다.

돌외 추출물과 분획물들의 총 페놀성 화합물 함량 분석결 과, 아글리콘 분획물(517.2 mg/g) > 에틸아세테이트 분획물 (409.8 mg/g) > 50% 에탄올 추출물(197.8 mg/g) 순서로 나 타났다. 총 플라보노이드 함량은 아글리콘 분획물(103.4 mg/

g) > 에틸아세테이트 분획물(99.6 mg/g) > 50% 에탄올 추 출물(47.8 mg/g) 이었다. 돌외 추출물의 자유라디칼 소거활 성(FSC₅₀) 측정 결과, (+)-α-tocopherol(8.98 μg/mL) > 아글 리콘 분획(128.9 μg/mL) > 에틸아세테이트 분획(147.2 μg/

mL) > 50% 에탄올 추출물(246.8 μg/mL) 순서로 나타났다.

지용성 항산화제인 (+)-α-tocopherol 보다는 낮은 활성을 보 였지만, 아글리콘 분획은 50% 에탄올 추출물보다 약 2배 높은 라디칼 소거활성을 나타내었다. 돌외 추출물의 활성산 소 소거활성(총 항산화능, OSC₅₀)은 L-ascorbic acid(1.50 μg/

mL) > 아글리콘 분획(7.19 μg/mL) > 에틸아세테이트 분획 (10.74μg/mL) > 50% 에탄올 추출물(37.15 μg/mL) 순서로 나타났다. 수용성 항산화제로 잘 알려진 L-ascorbic acid 보 다 낮은 활성을 보였지만, 아글리콘 분획은 50% 에탄올 추 출물 보다 약 5배 높은 총 항산화능을 나타내었다.

사람피부세포인 HaCaT을 이용한 세포보호효과 실험에서 과산화수소 처리 후 돌외 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획을 처리한 경우 50% 에탄올 추출물을 처리한 것 보다 과산화수소로 감소되었던 세포 생존율이 더욱 증가하였으 며, 아글리콘 분획은 최대 55% 증가함을 확인 하였다.

TLC 및 HPLC 크로마토그램 분석을 통해 활성분획인 에 틸아세테이트 및 아글리콘 분획에서 quercetin 3-β-O- glucoside, kaempferol 3-O-β-rutinoside, astragalin, caffeic acid, quercetin, ferulic acid, kaempferol 성분들이 있음을 확 인하였다. 돌외 에틸아세테이트 분획으로부터 아글리콘 분 획물을 제조했을 때, 플라보노이드 배당체들(quercetin 3-β- O-glucoside, kaempferol 3-O-β-rutinoside, astragalin)은 감 소하고, 아글리콘인 qercetin 및 kaemperol은 증가하였다.

본 연구에서는 항산화 활성 평가를 통해 돌외 분획물의 항산화 활성을 확인하였다. 특히 아글리콘 분획물은 50%

에탄올 추출물에 비해 가장 큰 항산화능을 갖는 것으로 평 가되었다. 이상의 결과들을 볼 때, 돌외의 아글리콘 분획물 이 플라보노이드 및 페놀성 화합물에 기인하여 항산화 활 성 및 세포보호효과를 나타냄을 확인하였다. 결론적으로, 돌 외 분획물은 활성산소(H₂O₂)로 유도된 사람피부세포 손상 에서 세포보호효과를 나타냈으며, 이는 항산화 화장품 원료 로써 활용 가능성이 있음을 시사한다.

사 사

본 연구는 보건복지부 보건의료개발사업의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다(과제 고유번호:HN15C0104).

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(2017. 5. 17 접수; 2017. 6. 12 심사; 2017. 6. 15 게재확정)