Anti-obesity and Anti-diabetic Effects of the Fermented Ethanol Extracts from White Jelly Fungus (Tremella fuciformis Berk) with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76

Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76로 발효한 흰목이버섯

Tremella fuciformis Berk) 추출물의 항비만 및 항당뇨 효과

윤여초^1,2, 김병혁¹, 김중규^1,2, 이준형^1,2, 박예은¹, 박혜숙¹, 황학수³, 권기석²*, 이중복¹*

1㈜비에이치앤바이오생물산업소개발연구소

2안동대학교원예·생약융합학부

3교촌 F&B(주)

Received: November 27, 2018 / Revised: January 16, 2019 / Accepted: January 17, 2019

서 론

최근^, 경제성장과산업화로인해식^·생활습관이서구화되 면서다양한생활습관성질환및대사성질환의발병률의

원인이되고있다^[1]. 특히비만및당뇨병의유병률은기하

급수적으로증가하고있는추세이며^, 합병증을동반하여사 망률을크게높이고있다^. 이러한당뇨병의증가는의료관련

비용증가를야기하고삶의질을저하시킴으로심각한사회

문제로대두되고있다[2]. 당뇨병은비정상적인체내포도당

의흡수로인한대사성질환으로고혈당^, 고지혈증^, 고혈압^,

동맥경화등과같은다양한합병증을유발한다^[3]. 당뇨병에

대한근본적치료방법은보고되어있지않으며^, 탄수화물의 소화를제한하여고혈당을감소시키는것이최선의방법으 로 알려져 있다^[4−^6]. 대표적인 혈당강하제는 ^acarbose, voglibose 등의 α-glucosidase 저해제와 sulfonylurea 계의

인슐린분비촉진제등이있다^[7]. 그러나혈당강하를통한

당뇨병의치료제에대해체중증가^, 간독성등의다양한부

작용이보고되어^[8], 최근에는천연소재를이용한연구가활

발하게진행되고있다^[9−^12]. 천연소재의항당뇨효과는여

러 flavonoids, glycosides 등에의해고혈당완화에유용하 다고보고되고있다^[13−^15].

Anti-obesity and Anti-diabetic Effects of the Fermented Ethanol Extracts from White Jelly Fungus (Tremella fuciformis Berk) with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76

Yeo-Cho Yoon^1,2, Byung-Hyuk Kim¹, Jung-Gyu Kim^1,2,Jun-Hyeong Lee^1,2, YeEun Park¹, Hye-Suk Park¹, Hak-Soo Hwang³, Gi-Seok Kwon²*, and Jung-Bok Lee¹*

1Institute for Development of Bioindustrial Materials, BHNBIO Co., Ltd., Jincheon 27850, Republic of Korea

2Division of Horticulture & Medicinal Plant, Andong National University, Andong 36729, Republic of Korea

3Kyochon F&B Co., Ltd., Osan 18150, Republic of Korea

White jelly fungus (Tremella fuciformis Berk; TF) has been used as a traditional medicine in Asia; it is known to prevent hypertension, aging, cancer, and arteriosclerosis. This study aimed to investigate the anti-diabetic effects of fermented Tremella fuciformis Berk (FTF) ethanol extracts fermented with L.

rhamnosus BHN-LAB 76. We show that FTF increases the α-glucosidase inhibitory activity and suppress the adipogenesis of 3T3-L1 adipocytes. These inhibitory effects of FTF are accompanied by the regulation of the phosphorylation of AMPK, JNK, and Akt. These data demonstrate that FTF not only inhibits adipo- genesis by affecting the adipogenic signaling, but also increases the anti-diabetic effects by regulating the insulin signaling pathway. Therefore, we suggest that the FTF can be used for developing functional food and cosmetics materials.

Keywords: Anti-obesity activity, anti-diabetic activity, biological activity, lactic acid bacteria, Tremella fuciformis Berk

*Corresponding authors G.-S. K.

Tel: +82-54-820-5909, Fax: +82-54-820-6252 E-mail: [email protected]

J.-B. L.

Tel: +82-54-822-8972, Fax: +82-54-822-8973 E-mail: [email protected]

© 2019, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology

흰목이버섯(Tremella fuciformis Berk; TF)은 흰목이과 (Tremellaceae)에속하는버섯으로^, 한국^, 일본^, 중국^, 유럽

및아메리카등세계각지에분포하고있다^[16]. 흰목이버섯

의다른명칭은흰젤리버섯(white jelly fungus) 또는은이 (silver ear)가있으며^[17], 효능으로는 ^T 세포활성화를통한 면역력증가를유도하여항암^, 항노화효과와고혈압및동 맥경화예방^, 체지방개선^, 콜레스테롤억제항스트레스효

과가 보고되고 있다^[18−^22]. 또한^, 흰목이버섯 추출물은

tyrosinase 효소활성을저해하고 ^melanin 합성인자조절

을통해 ^melanin 함량을감소시켜미백기능향상및주름

개선효과가있다고보고되었다^[23]. 또한^, 흰목이버섯은수 분을흡수하는성질이매우강하여^, 고보습화장품소재뿐 만아니라항당뇨^, 항혈전효과가있다고보고되고있어건 강기능식품및의약품소재로다양하게이용되고있다^[24].

유산균(lactic acid bacteria)은탄수화물을분해하여젖산

(lactic acid)을생성하는미생물로포유류의장내에서항균

물질분비를통해유해균에의한이상발효를억제함으로서

체내의항상성유지를돕는것으로보고되고있다^[25]. 최근

에는유산균을이용한발효를통해천연추출물의생리활성 증대및이를이용하여기능성소재개발을위한다양한연 구가진행되어^, 건강기능성식품소재^, 화장품소재^, 사료

첨가제등의제조에이용되고있다^[26]. 현재다양한분야에

서유산균발효를통한천연추출물함유활성성분및생리 활성의증가에대한연구가활발하게진행되고있으며^[27−

29], 유산균을이용하여발효한대마씨추출물의경우^, 발효

하지않은대마씨추출물대비 α-glucosidase 저해활성이증 가한다고보고되었다^[30]. 그러나^, 현재까지흰목이버섯에대 한다양한효능이보고되고있지만^, 유산균발효를통한항 당뇨효능에관한연구는알려진바가없다^.

따라서본연구에서는유산균발효를통한흰목이버섯추 출물의항비만및항당뇨효능변화를확인하고^, 기능성생 물소재로의활용가치를검토하고자하였다^.

재료 및 방법

본연구에서사용한흰목이버섯은 ⁽주⁾부농에서국내산을 구입하였다. Acarbose, p-nitrophenyl β-D-glucoside (pNPG), sodium phosphate (monobasic, dibasic), α-glucosidase enzyme, dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-Isobutyl-1- methylxanthine (IBMX), dexamethasone, oil-red-o staining solution은 Sigma-Aldrich Co. (USA)에서구입하여사용하 였으며 ^insulin은 Welgene Inc. (Korea)에서구매하여사용 하였다. phospho-AMPKα (Thr172), phospho-JNK (Thr183/

Tyr185), phospho-Akt (Ser473), β-actin, anti-HRP rabbit 항체는 Cell Signaling Technology (USA)에서구매하여사

용하였다. ELISA reader는 ^SparkTM 10M Multimode Microplate Readers (TECAN, Swizerland)를사용하였다^. 사용 균주 및 배양 조건

본연구에서흰목이버섯의발효를위해사용된유산균은 전통발효식품으로부터스크리닝을통해분리한 Lactobacillus rhamnosus BHN 76을사용하였다^{(Fig. 1).} 유산균배양조 건은초기균수 ^{105 CFU/ml}로 ³⁷℃에서 ⁴⁸시간동안 ^MRS broth 배지에서배양한후, 사용하였다.

유산균 발효 흰목이버섯 추출물(FTF)

흰목이버섯 ^{100 g}을분말로파쇄한후^, 유산균을 ^{1 × 107} CFU/ml로접종하여배양기⁽³⁷℃⁾에서 ⁷²시간동안발효하 였다^. 각각의유산균으로발효한흰목이버섯의추출법은추 출용매^, 시간^, 온도에따른최적의추출수율을통해선별 하였으며(data not shown), 선별된조건인시료부피 ¹⁰배 의에탄올^(EtOH)을가하여 ⁸⁰℃에서 ²⁴시간동안추출하였 다^. 추출한시료는여과후감압농축기(Eyela, Japan)로

60℃에서감압농축을하고^, 동결건조하여얻은추출물을

실험에사용하였다^.

α-Glucosidase 저해 활성 분석

α-Glucosidase 저해활성측정은 ^Tibbot과 ^Skadsen의방 법에따라 pNPG (p-nitrophenyl β-D-glucoside)에서유리되

어나오는반응생성물(p-nitrophenol)을측정하여수행하였

다^[31]. 각 농도의 시료 ²⁵ μ^l에 2.5 mM pNPG 50 μ^l와 0.2 unit/ml α-glucosidase enzyme solution 25 μ^l를첨가한 후^{, 37}℃에서 ²⁰분간반응시키고 0.1 M NaOH 50 μ^l를넣어 반응을 정지시켰다^. 반응액 중 p-nitrophenol 생성량은 microplate reader를사용하여 ^{405 nm}에서흡광도를측정 하였으며^, α-glucosidase 저해활성은효소를첨가한처리구 와무처리구사이의흡광도차이를백분율로나타내었다^. 양 성대조구로 ^acarbose를 사용하였으며^, 음성대조구로 α^- glucosidase enzyme 대신 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)를동량분주하였다^.

α-Glucosidase 저해활성^{(%) =}

1−^(S−SB) × 100 / (Control − ^Blank) S : α-glucosidase enzyme 처리구의흡광도 SB : α-glucosidase enzyme 무처리구의흡광도 세포 배양

본실험에사용된 ^3T3-L1 전지방세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)에서분양받아사용하였 다^{. 3T3-L1} 세포는 10% bovine calf serum (BCS, Gibco,

Fig. 1. The phylogenetic tree of lactic acid bacteria used in this study.

USA), 1 x antibiotics (Welgene Inc., Korea)를 첨가한 Dulbecco modified Eagle medium (DMEM, Welgene Inc.) 배지를사용하여 ³⁷℃^{, 5% CO}2조건에서배양하였다^. 세포가 80% confluent 되었을 때, 0.05% trypsin/EDTA (Welgene Inc.)을사용하여세포를떼어내고 1,100 rpm, 3분 동안원심분리하여세포 ^pellet을모으고^, 새로운배지로현 탁하여사용하였다^.

지방세포 분화 유도 및 시료 처리

6-well plate의 ^well 당 ^{1.2 × 106}개의 ^3T3-L1 세포를 10% BCS가첨가된 ^DMEM 배지에분주^, 배양한후 ^100%

confluent 한 상태에서 MDI (0.25 μM dexamethasone (Sigma-Aldrich Co.), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX, Sigma-Aldrich Co.), 10 μ^g/ml의 insulin (Welgene Inc.)을포함한 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco)가첨 가된지방분화유도 ^DMEM 배지로변경후 ³⁷℃^{, 5% CO}2조 건에서 ⁷²시간동안배양하였다^. 그후^, 동일농도⁽¹⁰ μ^g/ml) 의 ^insulin을 첨가한 ^{10% FBS}를포함한 ^DMEM 배지로 48시간간격으로변경하였다^. 시료추출물은 100, 250, 500,

1000 μ^g/ml의농도로지방유도배지변경시동시에처리하

였다^.

세포독성평가

유산균발효전과발효후흰목이버섯추출물의 ^3T3-L1

세포에대한독성평가는세포에의해생성되는 ^formazan

측정을통한 tetrazolium bromide salt (MTT) assay를이용 하여 진행하였다. 24 well plate에 ^3T3-L1 전지방세포를 well 당 ^{0.5 × 105}개씩 분주하고, confluent 된 상태에서 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μ^g/ml의농도의흰목이 버섯추출물을 ³⁷℃^{, 5% CO}2조건에서 ²⁴시간동안처리 하였다^{. 24}시간후^, 흰목이버섯추출물이포함된배지를완 전히 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)에 ^{5 mg/}

ml의농도로용해된 ^MTT 시약을 Serum-free 배지에농도 0.5 mg/ml로희석하여처리한후, 4시간동안반응시켰다. 반 응후^, 배지를완전히제거하고 ²⁰⁰ μ^l의 ^DMSO를첨가하여

살아있는 ^3T3-L1 세포에서생성된 ^formazan을용해시켰

다^. 용해된 ^formazan은 96-well plate에각 ^well 당 ⁹⁰ μ^l씩 넣어 microplate reader를이용하여 ^{540 nm}에서흡광도를 측정하였다^. 세포생존율(% of Control)은흰목이버섯추출물

을처리하지않은 ^3T3-L1 전지방세포를대조군으로하여계

산하였다^.

Cell viability (%) =

OD_{540 nm} (sample)/OD _{540 nm} (control) × 100

Oil-red-O 염색

지방세포로의분화후^, 세포내지방구생성확인은 ^{Oil red} O 염색을통해실시하였다^. 세포를배양한배지를완전히제 거하고 phosphate-buffered saline (PBS)로 세척한후 ^4%

formalin으로 ¹⁰분간세포를고정하였다^. 고정후, deionized water로세척하고 ^{Oil red O}를넣어실온에서 ³⁰분간염색 한후염색액을제거하고 deionized water로 ³회세척하여 염색된 지방구를 microscopic image (Olympus, Japan)로 관찰하였다^. 그후, 100% isopropyl alcohol를가하여염색된 지방을추출하고 microplate reader를이용하여 ^{510 nm}에 서흡광도를측정하여정량분석하였다^.

Western blot

지방분화유도단백질의활성을확인하기위하여 ^{cold PBS} 로 세척 후 수거한 세포에 protease inhibitor cocktail (Roche, Swizerland)과 phosphatase inhibitor cocktail (Roche)을첨가한 RIPA buffer (150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, and 2 mM EDTA) (Bioseang, Korea)를넣고 ⁵분간격으로 ^voltex하여얼음에 ³⁰분간방 치하였다^. 그후 12,000 rpm, 4℃에서 ³⁰분동안원심분리 하고 상등액을 취하여 ^SMARTTM bicinchoninic assay (BCA) protein assay kit (iNtRON Biotechnology, Korea) 를 사용하여 단백질 양을 정량하였다^. 정량한 각 단백질 lysate 100 μ^g을취하여 SDS loading buffer와섞고 ⁹⁵℃에서 3분간반응시킨후^, 얼음에넣고 ¹⁰분간방치하였다^. 각단백 질은 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 ^loading을 하고 ^{80 V}에서 30분^{, 120 V}에서 ¹시간 ³⁰분동안전기영동을통해단백질 을분리시켰고 PVDF (polyvinylidendifluoride) membrane (Amersham, UK)에 ¹시간동안전이시킨후, 5% skim milk 를처리하여상온에서 ¹시간동안반응시켜비특이적인단 백질을 ^blocking하였다^. 그리고각각의 ¹차항체를 ⁴℃에서 12시간이상반응시키고 ^PBS-T로세척한후^{, 1}차항체에따 른 ²차항체를처리하여상온에서 ²시간동안반응시켰다^. 그후, enhanced chemiluminoesence (ECL) solution을처리

하고^{, chemidoc}을이용하여특정단백질의발현양을분석하

였다^.

통계 분석

본실험에서사용된모든실험은 ³회반복하여진행하였 으며^, 결과값은 ^mean±standard deviation (SD)로나타내 었다^. 각그룹간평균은 SPSS (SPSS Inc., USA)를이용한 비모수적 Kruskal-Wallis 및 Mann-Whitney 분석을사용

하여비교하였으며, p < 0.01 과 p < 0.05 수준에서유의성을 검정하였다^.

결과 및 고찰

유산 발효에 따른 발효 흰목이버섯 추출물(FTF)의 제조 본실험에서사용한발효하지않은흰목이버섯추출물^(Not fermented Tremella fuciformis; NFTF) 및 L. rhamnosus

BHN-LAB 76 유산균발효흰목이버섯추출물 (Fermented

Tremella fuciformis; FTF)은 ^{100 g}의흰목이버섯을이용하 였으며^, 발효전과발효후의흰목이버섯으로부터추출수율 을확인하였다^. 각흰목이버섯 ^{100 g}으로부터에탄올추출 후^, 동결건조한결과약 ^{16.45 g}과 ^{21.65 g}의추출분말을 확보하였으며^, 추출수율은 ^16.45%와 ^21.65%로확인되어^, 유산균을통한발효흰목이버섯의추출효율은발효하지않 은흰목이버섯추출수율대비약 ^31.6% 증가하는것을확

인하였다(Table 1). 일반적으로유산균을통한발효시다양

한유기산및아미노산등의대사산물이생성되며이러한대 사산물에의해 ^pH의감소에따라추출효율이증가한다고 보고되었으며^, 본연구에서도유산균발효흰목이버섯추출 효율이 ^30% 넘게증가하였다^{[32, 33].}

유산 발효에 의한 흰목이버섯 추출물(FTF)의 α-glucosidase 저해 활성

α-Glucosidase는이당류를단당류로의분해를촉매하는가

수분해효소이며^[34], 이러한α-glucosidase를저해시키는 물질은항당뇨활성을증진시킨다고보고되고있다^[35]. 본 연구에서는유산발효에의한흰목이버섯추출물의당뇨억 제활성을α-glucosidase assay를통해비교분석하였다^. 그 결과^, 양성대조구로서사용된 acarbose (1 mg/ml)는 ^42.21± 1.03%의α-glucosidase 억제활성이나타났으며^, 동일한농

도 ^{1 mg/ml}로 처리한 발효하지 않은 흰목이버섯 추출물

(NFTF)과 L. rhamnosus BHN-LAB 76 유산균으로발효한 흰목이버섯 추출물^(FTF)의 α-glucosidase 억제 활성은 64.83±1.55%, 89.74±^1.16%로유산발효한흰목이버섯추 출물은발효하지않은흰목이버섯추출물대비약 ^138% 배 증가하는것으로나타났다^. 또한^, 모든흰목이버섯추출물은

양성대조구에비해현저히증가된α-glucosidase 억제활성 을확인하였다(Fig. 2). 1990년초부터α-glucosidase의활성 저해에의한항당뇨활성은당대사를지연시켜혈당증가를 막는방법이연구되기시작하였다^{[36, 37].} 유산균발효에의

한대마씨추출물의 α-glucosidase 저해활성은발효하지않

은대마씨추출물보다약 ^15% 이상증가시킨다고보고되었

으며^[38], 유산균발효를통한생물전환은천연물의효능을

증가시키는유용한기술로이용되고있다^{[30, 39].} 이러한결 과로미루어볼때^, 유산균으로발효한흰목이버섯추출물은

α-glucosidase 저해활성을증가시켜당뇨억제활성을촉진

하는것으로판단되며^, 추가연구를통해유산균발효흰목 이버섯추출물의항당뇨활성을확인해볼필요성이있다고 판단된다^.

흰목이버섯 추출물(FTF)의 세포 독성 평가 및 지방분화유 도 억제 효과

NFTF와 ^FTF가세포에미치는독성을평가하기위하여

3T3-L1 전지방세포에각추출물을 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/ml의

농도로처리한후 ^{MTT assay}를통해세포생존율을측정하

였다^. 그결과 ^NFTF와 ^FTF를처리한모든농도에서세포

생존율에영향을미치지않아^, 모든실험은 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/ml 농도에서진행하였다^{(Fig. 3).}

흰목이버섯추출물이 ^3T3-L1 전지방세포에서지방분화유 도를통한지방구형성에미치는영향을조사하기위해 ⁸일 간분화유도배지에 ^NFTF와 ^FTF를 0.25, 0.5, 1 mg/ml의 농도로처리하였다(Fig. 4). MDI 처리를통한전지방세포의 지방분화유도는지질성분에특이적으로반응하여지방구

만을염색하는 Oil red O 시약을사용하여염색한후현미

경관찰을통해확인하였다^. 그결과^, 미분화된 ^3T3-L1 전지

방세포^(normal)는지방구의형성이거의나타나지않은반

면^{, 8}일간분화시킨 ^MDI 양성대조군에서는염색된지방구

Fig. 2. The α-glucosidase inhibitory effects of non-fermented TF and FTF with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76. NFTF;

not fermented Tremella fuciformis, FTF; fermented Tremella fuciformis.

Table 1. Extraction yield of non-fermented TF and FTF with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76.

Sample Non-fermentation L. rhamnosus BHN-LAB 76

Extraction yield 16.45% 21.65%

NFTF; not fermented Tremella fuciformis, FTF; fermented Tremella fuciformis.

의수가현저하게증가되었음을확인하였다(Fig. 5A). 양성

대조군에비해^{, NFTF}를처리한군에서는미미하게감소된

지방구가나타났으나^{, FTF}를처리한군에서는현저히감소 된지방구를확인하였고^, 용해시킨지방축적도는농도의존 적으로 p < 0.05, p < 0.01 수준에서감소하는것을확인하

였다^. 특히 FTF 1 mg/ml 농도로처리한군에서는분화배지

만을처리한군에비해현저히감소된지방구형성을확인 하였으며(Fig. 5A), Oil-Red-O 염색약으로염색된지방구를 100% isopropyl alcohol로용해시켜지방축적도를확인해 본결과, p < 0.01 수준에서약 ^25% 지방축적감소를확인

하였다(Fig. 5B). 유산균을통한발효는지방분화억제효

과를가진삼정환의지방구생성억제효과를더욱증대시킨 다고보고하였다^[40]. 이러한결과로미루어볼때^{, FTF}는

NFTF 보다지방세포로의분화억제활성이탁월한것으로

판단된다^.

유산 발효에 의한 흰목이버섯 추출물(FTF)의 p-AMPK, p- JNK, p-Akt의 유전자 발현 억제 효과

FTF에의한지방구형성의감소가유전자발현에미치는

영향을알아보기위해 ^3T3-L1 전지방세포에서세포내에너

지항상성조절인자인 ^p-AMPK 인산화와지방세포분화

에관여한다고알려진 ^insulin을통해활성화되는 ^Akt 단백 질의발현을확인해보았다^{[41, 42].} 또한^, 세포분화에관여 한다고알려진 ^JNK의활성을 western blot을통해확인해 보았다^[43]. 그결과^, 미분화된 ^3T3-L1 전지방세포의인산화

된 ^AMPK 유전자발현은현저히감소됨을확인하였고이에

비해 ^FTF을 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg/ml의농도로처리한경우 증가함을확인하였다^. 특히 FTF 1 mg/ml 농도로처리한군

에서는확연하게증가한 ^AMPK의발현을확인하였다^. 또한

Akt 유전자발현에서 ^FTF를처리하지않은군에비해저농

도(0.1, 0.25, 0.5 mg/ml)에서는유의적인차이를보이지는않

았지만^, 고농도^{(1 mg/ml)}로처리한군에서는현저하게증

가된결과를확인하였다^. 추가적으로 ^JNK 유전자발현을통 해세포분화에미치는영향을확인해본결과^, 미분화된

3T3-L1 전지방세포에서는어떠한발현이나타나지않았지

만^, 분화유도한세포에서는확연하게증가된양상을확인하 였으며^, 발효흰목이버섯추출물을처리한군에서는농도의 존적이지는않았지만^, 감소된유전자발현을확인하였다^(Fig.

Fig. 3. The cell viability of non-fermented TF and FTF with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76 in 3T3-L1 cells. NFTF; not fer- mented Tremella fuciformis, FTF; fermented Tremella fuciformis.

Fig. 4. Flowchart of 3T3-L1 adipocyte differentiation procedure. Cell medium for adipocyte differentiation was composed of DMEM.

containing MDI (10% FBS, 0.5 mM isobutylmethylxanthine (IBMX), 10 µg/ml insulin, 0.25 µM dexamethasone). NFTF; not fermented Tremella fuciformis, FTF; fermented Tremella fuciformis.

6A). 본연구에서는인산화되기전 total form을확인하지 못했으나^, β^-actin 대비 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 수치정량

화를통해분석해본결과^{, FTF} 처리전시료에비해각인

자들이변화하는것을확인하였다(Fig. 6B). 이러한결과를 통해 ^FTF를처리한군에서의감소된지방구형성은세포내 p-AMPK, p-JNK, p-Akt 유전자발현을억제함으로써^, 지방

세포로의분화및세포분화유도에관여하는것으로생각

되어진다. Adipogenesis 억제는 ^AMPK의 활성화를 통한

adipogenic transcription factors의발현감소가중요한역 할을하는것으로알려져있으며[44], Aspergillus oryzae로 발효한 울금 주정 추출물에서의 지방 형성 억제 효과는

AMPK의 ^mRNA 발현이증대되는것을통해나타난다고보

Fig. 5. Adipocyte differentiation inhibitory effects of non-fermented TF and FTF with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76.

BHN-LAB76 in 3T3-L1 cells. (A) Lipid droplet staining with Oil-red-O solution, (B) Lipid accumulation (%) dissolved with 100% isopropyl alcohol. NFTF; not fermented Tremella fuciformis, FTF; fermented Tremella fuciformis.

Fig. 6. (A) Phosphorylated AMP-activated kinase (AMPK), Jun N-terminal kinase (JNK), and Protein kinase B (PKB or Akt) protein levels by western blot in the 3T3-L1 cells after adipocyte differentiation with the ethanol extracts of Tremella fuciformis Berk (FTF) fermented with Lactobacillus rhamnosus BHN-LAB 76. (B) Quantification of p-AMPK, p-JNK, p-Akt protein activities com- pared to β-actin. A total of 90 µg of protein was separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).

고하였다^[45]. 따라서^, 유산균으로발효한흰목이버섯추출 물은항비만및항당뇨효과가있을것으로판단되며^, 건강 기능식품으로활용및발전가능성을확인하였다^.

요 약

흰목이버섯(Tremella fuciformis Berk.; TF)은흰목이과에 속하는버섯으로한국^, 중국및열대지방에분포한다^. 흰목 이버섯은아시아전통의학에서고혈압^, 노화^, 암및동맥경 화를예방하는것으로알려져있다^. 본연구는 L. rhamnosus

BHN-LAB 76로발효된흰목이버섯추출물의항당뇨효능

에대해조사하였다^. 그결과^, 발효된흰목이버섯추출물은

발효하지않은추출물에비해α-glucosidase 저해활성을증

가시키고^{, 3T3-L1} 전지방세포에서의지방세포분화유도를

통한지방구생성을억제하는것을확인하였다^. 이러한발효 된흰목이버섯은지방및세포분화유도에관여한다고알

려진 ^{AMPK, Akt}의유전자발현을촉진하고^{, JNK}의발현

을억제하는것을통해지방생성억제및항당뇨활성이증 가됨을확인하였다^. 따라서 L. rhamnosus BHN-LAB 76으 로발효한흰목이버섯추출물은항비만및항당뇨기능성소 재및식품개발로의활용이가능할수있음을제안한다^.

Acknowledgments

This work was supported by the Technology development Pro- gram (C0563692) funded by the Ministry of SMEs and Startups (MSS, Korea).

Conflict of Interest

The authors have no financial conflicts of interest to declare.

References

1. King H, Aubert RE, Herman WH. 1998. Global burden of diabe- tes, 1995-2025: Prevalence, numerical estimates, and projec- tions. Diabetes Care. 21: 1414-1431.

2. Kim SG, Choi DS. 2009. Epidemiology and current status of dia- betes in Korea. Hanyang Med. Rev. 29: 122-129.

3. Chait A, Brunzell JD. 1996. Diabetes, lipids, and atherosclerosis, pp. 467-469. In LeRoith D, Taylor SI, Olefsky JM (eds.), Diabetes Mellitus, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia.

4. Toeller M. 1991. Diet therapy of diabetes mellitus. Fortschr.

Med. 41: 41-42.

5. Koivisto VA. 1993. Insulin therapy in type II diabetes. Diabetes Care. 16: 29-39.

6. Boulé NG, Haddad E, Kenny GP, Wells GA, Sigal RJ. 2001. Effects of exercise on glycemic control and body mass in type 2 diabe-

tes mellitus: a meta-analysis of controlled clinical trials. JAMA 286: 1218-1227.

7. Bhatt S, Mahesh R, Gampa G. 2011. An overview on recent advances in diabetes mellitus therapy. Int. J. Pharm. Fron. Res. 1:

84-100.

8. Hanefeld M. 1998. The role of acarbose in the treatment of noninsulin-dependent diabetes mellitus. J. Diabetes Complica- tions 12: 228-237.

9. Jang MJ, Rhee SJ. 2004. Hypoglycemic effects of pills made of mulberry leaves and silkworm powder in streptozotocin- induced diabetic rats. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 33: 1611- 1617.

10. Ham IH, Jeong ES, Lee BH, Choi HY. 2008. The study on anti- hypertensive and anti-diabetic effect of Moriramulus. Korean J.

Herbology 23: 203-212.

11. Kim OK. 2008. Antidiabetic and antioxidative effects of Lycii fructus in streptozotocin-induced diabetic rats. Korean J. Phar- macogn. 23: 73-82.

12. Lee K-J, Ham I-H, Bu Y-M, Kim H-C, Choi H-Y. 2008. Antidiabetic effect of Glechoma longituba (Nakai) Kupr in diabetic rats induced by streptozotocin. Korean J. Herbology 23: 175-180.

13. Andrade-Cetto A, Wiedenfeld H. 2001. Hypoglycemic effect of Cecropia obtusifolia on streptozotocin diabetic rats. J. Ethno- pharmacol. 78: 145-149.

14. Farkes L. 1998. Active principles of plants of traditional medi- cine as models of new drugs. J. Ethnopharmacol. 2: 45-48.

15. Vetrichelvan T, Jegadeesan M. 2002. Anti-diabetic activity of alcoholic extract of Aerva lanata (L.) Juss. ex Schultes in rats. J.

Ethnopharmacol. 80: 103-107.

16. Oh Y-H, Kim S-B, Lee G-W, Kim H-Y, Shim M-J, Rho H-S, et al.

2006. The immunomodulatory and antitumor effects of crude polysaccharides extracted from Tremella fuciformis. Korean J.

Mycol. 34: 105-111.

17. Ko MS. 2012. The growth level of hair follicles and hairs about stress-induced mice of Tremella fuciformis Berk. J. Korean Soc.

Cosm. 18: 1158-1165.

18. Cheng H-H, Hou W-C, Lu M-L. 2002. Interactions of lipid metab- olism and intestinal physiology with Tremella fuciformis Berk edible mushroom in rats fed a high-cholesterol diet with or without nebacitin. J. Agric. Food Chem. 50: 7438-7443.

19. Cheung PCK. 1996. The hypocholesterolemic effects of two edible mushrooms: Auricularia auricula (tree-ear) and Tremella fuciformis (white jelly-leaf) in hypocholes-terolemic rats. Nutr.

Res. 16: 1721-1725.

20. Ko MS, Lee SJ, Kang SM. 2009. Effect of Tremella fuciformis Berk on anti stress activities during long-term and short-term in mice. KSBB J. 24: 131-139.

21. Li H, Lee HS, Kim SH, Moon B, Lee C. 2014. Antioxidant and anti-inflammatory activities of methanol extracts of Tremella fuciformis and its major phenolic acids. J. Food Sci. 79: C460- C468.

22. Shi Z-W, Liu Y, Xu Y, Hong Y-R, Liu Q, Li X-L, et al. 2014. Tremella Polysaccharides attenuated sepsis through inhibiting abnor-