† 주 저자 (e-mail: [email protected]) call: 043-261-3326 J. Soc. Cosmet. Sci. Korea
Vol. 46, No. 4, December 2020, 349-360 eISSN 2288-9507
http://dx.doi.org/10.15230/SCSK.2020.46.4.349
상업용 β-glucanase를 이용한 홍삼유래 사포닌으로부터 Ginsnoside Rd 의 생물 전환
강 혜 정1ㆍ이 종 우2ㆍ박 태 우3ㆍ박 혜 윤*ㆍ박 준 성4,†
1충북대학교 공업화학과, 대학원생
2충북대학교 공업화학과, 대학원생
3충북대학교 공업화학과, 대학원생
*환경부 국립생물자원관
4충북대학교 공업화학과, 교수
(2020년 9월 6일 접수, 2020년 10월 3일 수정, 2020년 10월 29일 채택)
Biotransformation of Ginsenoside Rd from Red Ginseng Saponin using Commercial β-glucanase
Hye Jung Kang, Jong Woo Lee, Tae Woo Park, Hye Yoon Park*, and Junseong Park†
Department of Engineering Chemistry, Chungbuk National University, College of Engineering, 1 Chungdae-ro, Seowon-gu, Cheongju-si, Chungbuk-do 28644, Korea
*National Institute of Biological Resources
(Received September 6, 2020; Revised October 3, 2020; Accepted October 29, 2020)
4)
요 약: 최근 피부 기능 개선과 관련한 다양한 가능성으로 인해 화장품 소재로서 수요가 높아지고 있는 인삼 유래 사포닌의 한 종류인 ginsenoside Rd를 위한 생물 전환 제조 기술을 확립하였다. 홍삼 사포닌(RGS)에 포함된 ginsenoside Rb1을 Rd로 전환하기 위하여 상업용 효소를 탐색하였고 그 중 Viscoflow MG가 가장 효율적인 것을 확인하였다. Ginsenoside Rd로의 전환에 영향을 주는 요인을 최적화하기 위하여 반응표면분석 법(RSM)을 통하여 실험 조건을 설계하였다. 주요 독립변수는 RGS 농도, 효소 농도와 반응 시 간이었고 Box-Behnken design (BBD) 모델설계법에 따라 선정된 17 가지 조건으로 ginsenoside Rd로 전환을 수행하고 최적화 조건을 분석하였다. 전환된 Ginsenoside Rd의 농도는 0.3113 g/L에서 최대 0.5277 g/L까지였고 RGS 2%, 효소 1.25%를 13.5 h 반응시킨 조건에서 가장 높은 생성량을 보였다. 결론적으로, ginsenoside Rd 생물 전환의 독립변수인 RGS 농도, 효소 농도는 p-value가 0.05보다 작은 값으로 유의미한 값을 나타내었고 각 독립변수 사이의 교호작용 중에서는 효소 농도와 반응 시간 사이의 교호 작용이 가장 큰 영향력을 갖고 있음을 확인하였다.
Abstract: Bio-conversion manufacturing technology has been developed to produce ginsenoside Rd which is increasingly in demand as a cosmetic material due to various possibilities related to improving skin function. In order to convert ginsenoside Rb1 which is contained in red ginseng saponin (RGS) into Rd, several commercial enzymes were tested.
Viscoflow MG was found to be the most efficient. In order to optimize the conversion of RGS to ginsenoside Rd by enzymatic transition was carried out using response surface methodology (RSM) based on Box-Behnken design (BBD).
The main independent variables were RGS concentration, enzyme concentration, and reaction time. Conversion of ginsenoside Rd was performed under 17 conditions selected according to BBD model and optimization conditions were analyzed. The concentration of the converted ginsenoside Rd ranged from 0.3113 g/L to 0.5277 g/L, and the highest
1. 서 론
인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 아시아에서 천년동 안 각종 치료에 민간의학으로 널리 사용됐다. 이러한 인삼 의 생리활성의 주요 약리 성분은 dammarane계 사포닌으로 구분되는 ginsenoside인데 이는 타 식물과 구별하기 위해 인삼에서 분리된 배당체(glycoside)란 의미로 붙여진 이름 이다. 지금까지 인삼의 뿌리, 잎, 줄기, 열매, 꽃으로부터 약 150 종 이상이 보고되고 있으나 인삼에는 ginsenoside Rb 1, Rb 2, Rc, Re 등이 주로 존재하고 이들을 major ginsenoside라 부르고 있다[1-2]. 인삼의 주요 성분인 ginsenoside는 항염증 작용, 항암, 항당뇨, 항혈전 등을 포함 한 다양한 약리 활동이 보고되고 있다[3-8]. 인삼은 가공 방법에 따라 백삼, 홍삼, 태극삼 등으로 분류 되고 특히 인 삼을 증삼하여 건조 시킨 홍삼이 수삼에 비해 효능이 좋다 고 알려져 있다. 이러한 증삼 과정을 거치는 동안 열에 의 한 ginsenoside의 당 부분의 가수분해가 일어나고 major ginsenoside로부터 당이 제거된 작은 분자량의 ginsenoside Rd, Rg3, compound K 등의 minor ginsenoside가 생성이 된 다[9]. Minor ginsenoside는 major ginsenoside에 비해 작은 분자량으로 체내 흡수율이 높고 효능이 뛰어나다고 알려 져 있다. 특히 ginsenoside Rd는 major ginsenoside인 ginsenoside Rb1의 20 번 탄소 위치에 외부에 있는 당부분 이 가수분해되어 glucose 1분자가 남아있는 배당체로 특히 항염, 상처 치유 및 보호 효과, 주름 생성 억제 및 탈모 방 지 효과 등이 보고되고 있다[10-12]. 이러한 피부 기능 개 선과 관련한 ginsenoside Rd의 가능성으로 인해 화장품 소 재로서 수요가 높아지고 있지만, 인삼 및 홍삼에는 그 함 량이 적어 산업적 이용에 어려움이 있고 미생물 및 효소를 이용한 생물 전환 방법이 연구되고 있지만 이를 통한 대량 생산에 관한 연구는 미진한 실정이다. 특히, 효소를 이용 한 ginsenoside의 생물 전환 기술은 효소의 기질 특이성으 로 인해 특정 minor ginsenoside를 생산할 수 있는 선택성 이 높은 생물 전환 기술로서 가능성이 있다[13-14]. 하지만,
ginsenoside 생물 전환에 적용할 수 있는 산업 효소자원 발 굴은 여전히 미진한 실정이며 특정 minor ginsenoside의 생 물 전환하기 위한 효소자원의 지속적 발굴 및 효소 특성 규명은 매우 중요한 연구 주제라 할 수 있다.
본 연구에서는 홍삼으로부터 major ginsenoside를 포함하 는 조사포닌(red ginseng saponin, RGS)을 추출 분리하고 이 를 활용하여 minor ginsenoside 중의 하나인 ginsenoside Rd 를 효과적으로 생물 전환 시키는 산업 효소를 탐색하여 선 정하고 이의 최적화 조건을 결정하여 산업적으로 이용 가 능한 ginsenoside Rd 제조 기술을 확립하고자 하였다.
2. 재료 및 실험
2.1. 실험재료
본 연구에 사용된 홍삼은 홍삼농축액(KGC 인삼공사, Korea)을 구입하여 추가적인 분리 정제를 통해 홍삼 사포 닌(RGS)으로 활용하였다. 실험에 사용한 상업용 효소는 Viscoflow MG, Ultraflo Max, Viscozyme L은 Novozyme (Denmark), Ultra APH는 Daewoong enzymes (Korea), BioMax L 1000 및 Cellulase KN은 비전바이오켐(Korea)으 로부터 공급받아 사용하였다. Ginsenoside 표준품(Rb1, Rb2, Rc, Rd)은 Sigma (USA)에서 구매하여 사용하였다. 기타 실 험에 사용한 시약들은 Sigma (USA)에서 구매하여 사용하 였다.
2.2. 홍삼 사포닌(Red Ginseng Saponin, RGS) 제조 홍삼 농축액(Red ginseng extract, RGE)을 정제수로 10%
(w/w) 농도로 희석하고 흡착 레진인 Diaion HP-20에 적용 하여 정제수 세척후 에탄올 농도를 증가시키며 분리능을 확인하였다. 10% 홍삼 농축액을 컬럼에 흡착시킨 후 정제 수, 30 wt% 에탄올, 50 wt% 에탄올, 95 wt% 에탄올, 메탄 올을 순서대로 용출시켜 분획으로 분리하였다. Thin layer chromatography (TLC, Silica gel 60 F254, Merck, Germany) 를 사용하여 각 분획을 확인하고 ginsenoside를 함유한 분 production volume was obtained under condition of reacting 2% RGS and 1.25% enzyme for 13.5 hours. Consequently, RGS concentration, enzyme concentration which is 0.05 less than p-value and among the interactions between the independent variables, the interaction between enzyme concentration and reaction time was confirmed to be the most influential.
Keywords: red ginseng extract, ginsenoside Rd, bioconversion, β-glucanase, RSM
획은 혼합하여 rotary evaporator (N-1110, Eyela Co., Japan) 를 이용하여 감압 농축하고 홍삼 사포닌(RGS)으로 활용하 였다.
2.3. 생물 전환 효소 Screening
상업용 효소를 이용하여 ginsenoside Rb1으로부터 Rd로 생물 전환 실험을 위하여 RGS (1%, w/w)를 정제수에 희석 하고(98%, w/w) 상업용 효소(1%, w/w)를 첨가하여 진행하 였다. 반응액은 45 ℃에서 200 rpm의 진탕 속도로 48 h 동 안 반응 후 95 ℃에서 20 min 동안 보관하여 효소 반응을 정지시키고 상등액에서 ginsenoside Rd 생산 여부를 검토하 였다. 효소 반응이 진행됨에 따라 생성 및 감소하는 ginsenoside 함량을 TLC를 이용하여 분석하였다.
2.4. Ginsenoside 분석
TLC는 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, F2 과 반응 산물을 메탄올에 용해하여 점적하였다. 전개 용매로서 CHCl3 : CH3OH : H2O (65 : 35 : 10, v/v/v)를 사용하였고, 10%의 황산을 분무한 뒤 5 min 동안 가열 건조하여 발색시켰다.
HPLC (2695 Separations Module, Waters, USA)를 이용하여 ginsenoside의 함량을 정량 분석하였다. 컬럼(column)은 Mightysil RP-18GP 5 μm 4.6 x 250 mm (KANTO CHEMICAL, Japan)을 사용하였고 검출기는 Waters 486 tunable absorbance detector로 파장은 210 nm에서 검출하였 으며, 이동상 A는 acetonitrile, B는 deionized water로 하여 샘플은 10 μL를 주입하였고, column 온도 30 ℃에서 분석 하였다. Column의 유속은 1.0 mL/min이었고, 분석 시간은 0 min에서 10 min까지 이동상 A를 10%, 이동상 B를 90%
로 용리하기 시작하였으며, 10 min에서 25 min까지 이동상 A를 90%, 이동상 B를 10%가 되도록 용리하였고, 25 min 에서 30 min까지 다시 이동상 A를 10%, 이동상 B를 90%
가 되도록 한 다음, 30 min에서 35 min 까지 이동상 A를 10%, 이동상 B를 90%로 유지하면서 분석을 진행하였다.
2.5. 반응표면분석법(Response Surface Methodology, RSM)을 활용한 효소 반응 최적화
스크리닝을 통해 선정된 상업 효소를 활용한 RGS의 ginsenoside Rb1에서 Rd로의 생물 전환 반응의 최적화는 RSM을 사용하여 반응 조건을 설계하였다. RSM 중 3 개의 변수에 대해 3 개의 수준을 선정해 2 차 회귀방정식과 최 적의 조건을 확인할 수 있는 Box-Behnken 디자인 모델 (BBD)을 도입하였는데 BBD 계획법은 3 가지 이상의 요인 을 가질 때 3 수준의 실험을 진행하여 정사면체의 각 꼭지 점 사이의 위치한 중앙점과 전체 입방체의 중심점으로 구 성된다[15]. 변수는 홍삼 사포닌 농도(X₁, 1, 2, 3%), 효소 농도(X₂, 0.5, 1.25, 2%), 반응 시간(X₃, 3, 13.5, 24 h)로 설정하였다(Table 1). 3 개의 독립변수의 범위를 –1, 0, 1(최 저값, 중심값, 최대값) 총 3 단계로 부호화하였으며 독립변 수로 선택된 조건 외에 다른 조건들은 동일하게 유지하였 고, 최소의 오차를 위하여 총 17 회의 실험을 진행하였다.
각 반응에 대해 다음의 이차 다항식으로 표현할 수 있다.
은 각각의 선형 계수이고 은 변수들 간의 상관관계에 관한 계수, 은 각각의 변수의 이차 계수를 의미한다.
2.6. 통계 처리
반응 표면 분석법은 Design Expert 12.0 (Stat-Ease Inc.
USA)를 사용하여 통계학적 최적화를 수행하였다. 전체 모델 의 적합성을 파악하기 위해 analysis of variance (ANOVA) 를 수행하였으며 분석된 p-value가 0.05보다 작은 값을 가 질 때, 모델의 유의성이 있다고 판단하였다. 각 실험은 신 뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 3 회 이상 반복 실험을 수 행하였으며 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
Xn Independent
variables
Level
-1 0 +1
X1 RGS concentration (%, w/w) 1 2 3
X2 Enzyme concentration (%, w/w) 0.5 1.25 2.0
X3 Reaction time (hour) 3 13.5 24
Table 1. Independent Variables Levels Used for BBD for RSM
3. 결과 및 고찰
3.1. 홍삼 추출물 분리 정제
효소 반응의 효율을 높이려는 방법으로 홍삼 농축액 (RGE)의 ginsenoside 부분을 분리하기 위해 홍삼 농축액을 10%로 증류수에 희석하여 흡착 레진인 Diaion HP-20를 사 용하여 용매 비율별 분리능을 확인하였다. 10% 농도의 홍 삼 농축액을 컬럼에 흡착시킨 후 동량의 정제수로 3 회 이 상 세척하였다. 이후 30 wt% 에탄올, 50 wt% 에탄올, 95 wt% 에탄올, 메탄올로 순서로 용액을 넣어 순차적으로 탈 착시켰다. Figure 1의 TLC 분석 결과로 확인 할 수 있듯이 초기 미흡착된 일부 ginsenoside가 보이기는 하였으나 이온 수로 추가 세척하여 흡착 ginsenoside로부터 비흡착 성분을 분리하였고(Figure 1A lane 2∼4) 30 wt% 에탄올을 사용하 여 용리하였을 때 추가적인 비진세노사이드 성분들이 분 리되는 것을 확인할 수 있었다. 50 wt% 에탄올을 투여 하 였을 때부터는 ginsenoside 성분들이 용리되어 이후 95 wt% 에탄올 및 메탄올을 추가 투여하여 ginsenoside 성분
들을 분리해 낼 수 있었고 이를 50wt% 와 95 wt% 그리고 메탄올 분획을 혼합하여 용매를 제거하고 최종적으로 홍 삼 사포 닌(RGS)을 확보하였다. Kim 등은 홍삼 추출물을 HP-20 수지에 흡착 시켜 에탄올 농도별로 용출하였을 때 25% 이하에서는 용출되지 않고 그 이상의 농도에서는 사 포닌성분들이 용출된다고 보고하였다[16]. 하지만, 본 연구 에서는 50 wt% 이하의 농도에서는 ginsenoside가 용출되지 않은 것으로 확인되었다. 이는 사용 에탄올의 농도 및 에 탄올 수용액의 제조 방법에 따른 차이에 따른 결과로 추정 이 된다. Figure 1B 에서 보이듯이 홍삼 사포 닌은 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc등을 포함하는 것으로 확인할 수 있었고 이는 ginsenoside Rd 제조를 위한 생물 전환 전구체 로써 활용이 가능한 복합 성분임을 확인할 수 있었다.
3.2. Ginsenside Rd 생물 전환 효소 Screening Ginsenoside Rd 는 ginsenoside Rb1 의 체내 대사중의 중 간체로서 생성이 되는데 20 번 탄소 위치에 외부에 있는 당부분이 가수분해되어 glucose 1분자가 남아있는 배당체
Figure 1. TLC analysis of separated red ginseng extract (RGE).
(A) Analysis of elution process after adsorption of RGE.
1. red ginseng extract; 2∼4. D.W; 5. 30wt% ethanol; 6. 50wt% ethanol; 7. 95wt% ethanol; 8. methanol.
(B) Analysis of red ginseng saponin (RGS).
1. Ginsenoside Rb2 and Rc; 2. ginsenoside Rg3 ; 3. ginsenoside Rd ; 4. ginsenoside Rb1 ; 5. RGS.
이다. 대사 반응이 연속적으로 진행이 되면 이후 추가적인 당의 가수분해를 통해 Rg3나 F2 로 전환이 되고 이후 compound K로 전환이 되게 된다[17]. 각 대사 단계의 ginsenoside 성분의 유효 효능이 다양하게 보고되어 있어 각 ginsenoside 성분의 제조 목적에 따른 대사 단계의 반응 조절은 각 ginsenoside의 물질 생산에 매우 중요한 요소라 할 수 있다. 본 연구에서는 효율적인 ginsenoside Rd의 개 발을 위해 ginsenoside Rb1으로 부터의 1 차 전환 반응은 유효하게 진행이 되지만 이후의 Rg3 및 F2 로의 전환은 이루어지지 않도록 조절하는 것이 핵심이라 할 수 있다 (Figure 2). 이를 위해 당의 가수분해 기능이 있는 다양한 상업용 효소를 탐색하여 적절한 효소를 선정하였다. RGS 1%와 각 상업용 효소 1%를 45 ℃에서 950 rpm, 48 h 동안 반응하여 상등액을 분리하였다. 상등액 분리 후, TLC 분석
을 이용하여 Rd 전환 여부를 확인하였다. 이때, 사용된 상 업용 효소는 β-glucanase 2종(Viscoflow MG 와 Viscozyme L), Pullulanase 1종(BioMax L 1000), Xylanase 및 β- glucanase (Ultraflo Max), Pectinase 및 β-glucanase (Ultra APH), 그리고 Cellulase 및 Hemicellulase (Cellulase KN) 복 합 효능 각 1 종을 사용하여 시험을 진행하였다(Table 2).
Figure 3에서 확인 할수 있듯이 효소 반응의 기질로써 사 용된 RGS 내의 ginsenoside Rb1 은 BioMax L 1000을 제외 하고 최소 3 h에서 12 h 이후 사라지는 것으로 확인이 되 었다. BioMax L 1000을 제외한 모든 반응에서 ginsenoside Rd 는 ginsenoside Rb1의 감소에 따라 점차 증가하는 것으 로 확인이 되었는데 Ultraflo Max, Viscozyme L, Cellulase KN, Ultra APH 의 경우 반응 6 h에서 12 h 사이부터 ginsenoside F2 의 생성이 관찰되었다. 이것은 최종적으로 Figure 2. Bioransformation pathway of ginsenoside Rb1 to Rd in red ginseng saponin (RGS).
Product name Source Main activity Manufacturer
Viscoflow MG Aspergillus aculeatus Humicola insolens
Bacillus amyloliquefaciens β-glucanase Novozymes
Viscozyme L Aspergillus aculeatus β-glucanase Novozymes
Ultraflo Max Aspergillus oryzae
Trichoderma reesei Xylanase
β-glucanase Novozymes
Ultra APH Aspergillus aculeatus
Aspergillus niger Pectinase
β-glucanase Daewoong enzymes
Cellulase KN Aspergillus niger Cellulase
Hemicellulase Bision
BioMax L 1000 Bacillus licheniformis Pullulanase Bision
Table 2. Characteristics of Enzyme Used to RGS
ginsenoside Rd 의 생성량을 감소시키는 결과로 확인이 되었 고 검토한 상업용 효소중 Viscoflow MG 의 경우 ginsenoside Rd로의 전환 이후 추가적인 반응이 진행되지 않는 것으로 확인이 되어 가장 적절한 효소로 선정하게 되었다.
3.3. 반응표면분석법에 의한 Ginsenoside Rd 생물 전환 RGS로부터 ginsenoside Rd로의 생물 전환의 조건을 설 계하기 위하여 RSM을 사용하였다. 실험 계획법으로는 BBD를 사용하였다. 선행된 각 요인별 실험결과를 토대로 변수로는 RGS의 농도, 효소의 농도와 반응 시간을 선택하 였고 이 변수들의 값을 최적화하고자 –1, 0, +1로 부호화하 였다. BBD 설계법에 의해 설계된 17 가지의 실험 조건에 대해 3 회 반복을 통해 총 51 회의 실험이 수행되었다. 독 립변수에 영향을 받는 종속변수(Y)는 ginsenoside Rd의 함 량으로 회귀분석에 사용되었으며 HPLC 분석을 진행하여 확인하였다. 계획된 실험 조건에 따라 진행된 반응 이후 검출된 ginsenoside Rd의 양을 Table 3에 나타내었고 17 회 의 실험 조건 중 반복 조건을 제외한 13 회의 반응의 HPLC 분석 결과를 Figure 4에 나타내었다. Ginsenoside Rd 는 0.3113 g/L에서 최대 0.5277 g/L까지 전환이 되었다.
RGS 2%, 효소 1.25%를 13.5 h 동안 반응시킨 조건에서 가
장 많은 양의 ginsenoside Rd를 생성하였다. 회귀 분석에 의한 모델식은 Design Expert ver. 12.0 (Stat-Ease Inc., USA) 를 사용하여 예측하였다. 통계 처리를 통해 실험결과를 분 석하였고 분산분석표(analysis of variance, ANOVA)를 통하 여 전체적인 실험 모델의 p-value를 확인하였다(Table 4).
p-value는 각 계수의 유의성을 확인하는 도구 역할을 하며 작을수록 해당 계수가 더 유의하다[9]. 실험을 통하여 확인 된 p-value는 0.0003로 생물 전환 조건 설계에 따른 모델의 유의성이 있는 것을 확인하였다. F-value는 21.58로 유의미 한 모델임을 확인하였다. 특히 가장 큰 F-value 갖는 효소 의 농도(B)와 반응 시간(C) 사이의 교호작용 효과 (BC)가 Viscoflow MG를 이용한 Rd 전환에 가장 많은 영향을 준다는 것을 확인하였다. 그리고 모델의 R²(결정계수)는 0.9652로 1 에 가까운 값으로 신뢰할 수 있는 반응 모형임을 확인하였다.
모형진단에 관한 결과를 Figure 5에 나타내었다. Figure 5A는 오차의 정규성을 진단 결과로 표준화 잔차의 정규 확률도가 직선형태로 나타나고 정규 분포를 따른다는 것 을 확인할 수 있으며, Figure 5B는 표준화 잔차를 나타내었 다. 표준화 잔차가 ± 3 이내에 고르게 분포하므로 등분산 가정을 만족하고 모형이 적합하다는 것을 보여준다. Figure 5C는 box-cox 변환에 의한 데이터의 분산이 안정적으로 이 Figure 3. Time coursed bioconversion of ginsenoside Rd from Rb1 in RGS with several commercial enzyme.
Lane S: ginsenoside strandards; Lane 0∼48: reaction time (h)
(A) Viscoflow MG, (B) Ultraflo Max, (C) Viscozyme L, (D) Cellulase KN, (E) Ultra APH, (F) BioMax L 1000.
루어져 있음을 나타내었고, Figure 5D는 RGS로부터 ginsenoside Rd 변환이 상대적으로 RGS의 농도 (A)의 수준
변화에 가장 민감하게 반응하였고, 반응시간 (C)의 수준변 화에 가장 둔감하게 반응하였다.
Figure 4. HPLC analysis of the transformation of ginsenoside Rb1 by Viscoflow MG for RSM (A) ginsenoside standards (Re, Rb1, Rc, Rb2, Rd), (B)∼(N) Reaction condition 1 to 13.
Run RGS concentration
(%, w/w)
Enzyme concentration
(%, w/w) Reaction time
(h) Ginsenoside Rd content (g/L)
1 1 0.5 13.5 0.3965
2 3 0.5 13.5 0.4289
3 1 2.0 13.5 0.4628
4 3 2.0 13.5 0.4878
5 1 1.25 3 0.4504
6 3 1.25 3 0.4494
7 1 1.25 24 0.3671
8 3 12.5 24 0.4903
9 2 0.5 3 0.3113
10 2 2.0 3 0.5116
11 2 0.5 24 0.4920
12 2 2.0 24 0.3568
13 2 1.25 13.5 0.5138
14 2 1.25 13.5 0.5111
15 2 1.25 13.5 0.5109
16 2 1.25 13.5 0.4903
17 2 1.25 13.5 0.5277
Table 3. Ginsenoside Rd Content of RGE Treated with Viscoflow MG
Source Sum of
squares DF Mean square F-value p-value
Model 0.0631 9 0.0070 21.58 0.0003 significant
A 0.0040 1 0.0040 12.42 0.0097
B 0.0045 1 0.0045 13.93 0.0073
C 0.0000 1 0.0000 0.1039 0.7566
AB 0.0000 1 0.0000 0.0413 0.8447
AC 0.0039 1 0.0039 11.86 0.0108
BC 0.0281 1 0.0281 86.68 < 0.0001
A² 0.0022 1 0.0022 6.67 0.0363
B² 0.0082 1 0.0082 25.18 0.0015
C² 0.0100 1 0.0100 30.83 0.0009
Residual 0.0023 7 0.0003
Lack of fit 0.0016 3 0.0005 2.92 0.1639 not significant
Pure error 0.0007 4 0.0002
Cor total 0.0653 16
Std Dev0.0180 R² 0.9652
A: RGS concentration, B: Enzyme concentration, C: Reaction time Table 4. ANOVA of Ginsenoside Rd for Response Surface Quadratic Model
3.4. Ginsenoside Rd 생물 전환 최적 조건 분석 모수 추정에 의한 특성값인 Ginsenoside Rd의 2 차 회귀 방정식은 다음과 같이 제시되었다.
Ginsenoside Rd = 0.5108 + 0.0225A + 0.0238B – 0.0021C – 0.0018AB
+ 0.0310AC – 0.0839BC – 0.0227A2 – 0.0441B2 – 0.0488C2
A: RGS concentration, B: Enzyme concentration, C:
Reaction time
회귀방정식을 이용하여 RGS 농도, 효소 농도와 반응 시 간에 따른 교호작용을 3 차원 반응 표면도와 그것을 2 차 원으로 표현한 등고선은 Figure 6에 나타나 있다. Figure 6A, B는 반응 시간이 13.5 h일 때, RGS의 농도와 효소 농 도에 따라 변하는 ginsenoside Rd 생물 전환량을 3D와 등 고선 그래프이다. Ginsenoside Rd의 생물 전환량은 RGS의 농도가 높아짐에 따라 증가하였다가 RGS의 농도가 2.48%
일 때부터 감소하는 곡선을 확인하였고, 효소 농도가 높아 짐에 따라 증가하였다가 효소 농도가 1.44%일 때부터 감 Figure 5. Diagnostics of testing model.
(A) normal plot of residuals, (B) residuals vs predicted, (C) box-cox plot for power transforms, (D) perturbation.
Figure 6. 3D response surface and contour plot as three variables.
(A), (B) concentration of RGS vs Viscoflow MG; (C), (D) concentration of RGS vs reaction time; (E), (F) concentration of Viscoflow MG vs reaction time.
소하는 곡선을 확인하였다. 반응 시간이 13.5 h 일 때, RGS 농도 2.48%, 효소 농도 1.44%에서 가장 높은 ginsenoside Rd의 생물 전환량을 확인하였다.
Figure 6C, D는 효소 농도가 1.25%일 때, RGS의 농도와 반응 시간에 따라 변하는 ginsenoside Rd 생물 전환량을 3D와 등고선 그래프이다. Ginsenoside Rd의 생물 전환량은 RGS의 농도가 높아짐에 따라 증가하였다가 RGS의 농도 가 2.61%일 때부터 감소하는 곡선을 확인하였고, 반응 시 간이 길어짐에 따라 증가하였다가 반응 시간이 15 h 일때 부터 감소하는 곡선을 확인하였다. 효소 농도가 1.25%일 때, RGS 농도 2.61%, 반응 시간 15 h에서 가장 높은 ginsenoside Rd의 생물 전환량을 확인하였다.
Figure 6E, F는 RGS의 농도가 2%일 때, 효소 농도와 반 응 시간에 따라 변하는 ginsenoside Rd 생물 전환량을 3D 와 등고선 그래프이다. Ginsenoside Rd의 생물 전환량은 효 소 농도가 높아짐에 계속 증가하는 곡선을 확인하였다. 효 소 농도가 낮을 때, ginsenoside Rd의 생물 전환량은 반응 시간이 길어짐에 따라 증가하는 곡선을 보였으며, 효소 농 도가 높을 때, ginsenoside Rd의 생물 전환량은 반응 시간 이 짧아짐에 따라 증가하는 곡선을 그렸다. 효소 농도 2%, 반응 시간 4.64 h에서 가장 높은 ginsenoside Rd의 생물 전 환량을 확인하였다.
4. 결 론
홍삼으로부터 조사포닌(RGS)을 추출 분리하고 이를 활 용하여 minor ginsenoside 중의 하나인 ginsenoside Rd를 효 과적으로 생물 전환시키기 위하여 당 가수분해 효소 활성 을 가진 산업 효소를 탐색하고 이의 최적화 조건을 결정하 여 산업적으로 이용 가능한 ginsenoside Rd 제조 기술을 확 립하였다.
RGS 내의 ginsenoside R을 Rd로 전환하기 위하여 여러 상업용 효소를 사용하였고 그 중 Viscoflow MG가 가장 효 율적이었다. 더 나아가 Rd로의 생물 전환에 영향을 주는 요인을 확인하기 위하여 RSM을 통하여 실험 조건을 설계 하였다. 주요 독립변수는 RGS 농도, 효소 농도, 반응 시간 이었고 BBD 설계법에 따라 선정된 17가지 실험 조건으로 ginsenoside Rd로 전환을 하였고 통계처리에 의해 분석하였 다. Ginsenoside Rd는 0.3113 g/L에서 최대 0.5277 g/L까지 전환이 되었다. RGS 2%, 효소 1.25%를 13.5 h 반응시킨 조건에서 가장 많은 양의 ginsenoside Rd를 생성하였다. 이
러한 BBD 모델의 p-value는 0.0003으로 귀무가설을 채택하 지 않고 신뢰성 있는 모델임을 확인하였고 분산분석을 통 하여 각각 독립변수의 유의성과 독립변수들 사이의 교호 작용을 확인하였다. 결론적으로, ginsenoside Rd 생물 전환 의 독립변수인 RGS 농도, 효소 농도는 p-value가 0.05보다 작은 값으로 유의미한 값을 나타내었고 독립변수와 독립 변수 사이의 교호작용 중에서는 효소 농도와 반응 시간 사 이의 교호 작용이 가장 큰 영향력을 갖고 있음을 확인하였 다. 이러한 연구 결과는 홍삼에 미량 존재하지만, 약리적 효과가 뛰어난 ginsenoside Rd를 산업적으로 생산하기 위한 기초 자료로 사용될 수 있으며 향후 기능성 물질로의 응용 이 가능할 것으로 보인다.
Acknowledgement
이 논문은 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재 단의 지원(NRF2019R1F1A1058645) 그리고 환경부 국립생 물자원관의 지원(NIBR202018101)을 받아 수행된 연구입니다.
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