임 상 가검 물에 서 Nested-PCR과 PCR - dot blot 법 을 이용한 결핵균 검출의 비교

임상병리검사과학회지 : 제 28권 제 1 호 1996.

임 상 가검 물에 서 Nested-PCR과 PCR - dot blot 법 을 이용한 결핵균 검출의 비교

서울의과학연구소 • 서울임상병리검사센터 (SCL)

이성수·검미영·박영석

Comparison of Nested-PCR with PCR-Dot Blot for the Detection of Mycobacierium tuberculosis

in Clinical Samples

Lee , Seong-Soo , Kim , Mi- Young , Park , Young-Suk Se oul Mediclll Scienæ Institute ‘ Seoul Cliniclll Lllboratories( SCL)

The polymerase chain reaction (PCR) technique has widely been used in the direct di- agnosis of Mycobacterium tuberculosis(M. tuberculosis) from variety of clinical samples.

Recently , with development of molecular biological techniques , several PCR methods , in cluding nested - PCR , PCR- RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism) and PCR-dot blot hybridization , have been applied for the clinical diagnosis of M. tubercul o- sis. 1n this study , we evaluated the sensitivity of nested - PCR in comparison with the PCR-dot blot for the determination of M. tuberculosis. Two pairs of primers for nested - PCR were designed from 1S6110 locus of M. tuberculosis. Biotin labeled probe designed in the inner area of PCR product was used for PCR-dot hybridization. 1n a total of 59 sputum samples, thirty five samples (59.3 %) were positive in nested - PCR. On the other hand, fifteen samples (25 .4 %) were positive by PCR - dot blot analysis. From the results, nested - PCR is a more simple, cost effective and sensitive method for the detec tion of M. tuberculosis than PCR - dot blot analysis.

Key words : Mvcobacterium tubercu/osis, nested - PCR , PCR - dot blot

1 . 서

L-

중합 효소 연쇄반응 (PCR) 이 임상 실험실의 진단 목적으로 사용되기 시작한 것은 불과 수

년 내의 일이나 그 방법의 개발과 활용도는 과

특히 항원이나 항체를 간접적인 방법 25) 으로 검

출하던 감염 증 분야에 서 PCR의 활용은 확고

한 실험실적 진단 방법으로 자리잡고 있다. 최 근에는 분자생물학 기술의 신속한 발전과 아울 러 장비의 개발로， PCR 원리를 이용한 보다 신속하고 정밀한 검사 방법이 계속 개발되고 있다. 따라서 단순한 PCR 방법 을 이 용한 분석 보다는 검사의 목적에 따라 PCR-RFLP , nested - PCR, PCR - dot blot 등 임 상 실 험 실 에서 각종 병원 미생물을 검출하는 방법에 대 하여 많은 보고가 이루어 지고 있다 6- ⁹⁾ 저자 들은 결핵균 ， Chlamydia , C형 간염 등 임상 미 생물 분야에서 PCR 검사법의 유용성에 관하 여 보고하여 왔다 1.2.6- 9) 특히 객담에서 1 차 PCR법을 이용한 결핵균의 검출을 결핵균 배 양법과 비교하여 PCR의 우수성을 증명하였으 며， 소변， 척수액 등 결핵균 수가 적게 분포할 가능성이 있는 각종 체액에서 1 차 PCR 방법

2. 실험방법

1) Primer 및 probe의 합성

결핵균 DNA의 증폭을 위한 PCR primer는 M.

tuberculosis의 특이 적 인 부위 로 알려 진 186110 염 기 서열에서 설정하였다. 1 차 PCR을 위한 pnmer

로는 TB 1( 561-58이， TB2(865-884) 를 사용하 였으며， nested - PCR을 위한 pnmer로는 TB3 (588-609) , TB4(805-826) 를 사용하였다 24)

PCR - dot blot에 서 사용한 probe는 PCR 산물의 내측에 위치하는 TB5(705-754) 를 사용하였다.

본 실험에서 사용된 pnmer 및 probe의 합성은

392 DNA/RNA 합성기 (Applied Biosystem , U.

8. A.) 를 이 용하여 합성하였다.

2) DNA 추출

과 nested-PCR 방법 을 비 교하여 nested- DNA는 proteinase K와 phenol/ chlorof orm을

PCR 방법의 유용성을 입증한 바 있다 2) 최근 이용하여 추출하였다. 점성이 높은 객담을 4N

PCR을 이용한 병원균의 검출에 있어서 상품 NaOH와 동량 혼합하여 점도를 저하시킨 후 3 , 화된 kit에서는 PCR - dot blot 방법이 많이 응

용되고 있으므로， 저자들은 결핵균 검출률에 있어 서 nested-PCR과 PCR - dot blot 방법 간 의 예민도 및 정확성을 비교하기 위하여， 1 차 PCR을 시행한 뒤 얻어진 산물을 재 증폭하는

nested-PCR 방법과 l 차 PCR을 시행한 후 화학 형광 발광물질로 표식한 DNA probe로 교잡을 하는 PCR - dot blot 방법을 59 예의 임상 검체로 동시에 시행하여， 비교 분석한 후 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

II. 실험재료 및 방법

1. 실험재료

결핵균 표준 균주로는 M. tuberculosis( A TCC

27294) 를 사용하였으며， 임상 검체로는 결핵으 로 의심되는 환자의 객담으로서 본원에 의뢰된

59 예를 대상으로 하였다.

800 rpm에서 원심분리 하였다. 상충액을 제거 한 침전물을 세포 완충 용액 (50 mM Tris- HCl pH 7.5 , 1 mM EDTA , 1 % Triton X- 100) 200 띠에 부유시킨 후 proteinase K를 최 종 농도가 400 명Iml 되도록 혼합하였다. 37

C

에서 1 시간 반응시킨 후 phenol/ chlorof orm을 동량 넣 은 다음 1 분간 혼합하여 12 , 000 rpm에 서 10 분간 원심분리 한 후 상충액을 취해 chloroform을 동량 넣고 12 , 000 rpm에서 10 분 간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상충액을 취 하여 최 종 농도 0.2 M sodium acetate와 2배 부피의 100% 에탄올을 넣어 혼합하였다. -20

℃에서 1 시간 이상 방치한 후 18 , 000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 침전물을 70% 에탄올에 세척하고 건조시켰다. 건조된 침전물은 TE buffer(Tris EDTA , pH 7.6) 에 재 용해시키고 이 중 일부를 PCR 반응에서 주형으로 사용하

였다 15)

3) 중합 효소 연쇄 반웅 및 전기영동

PCR 반응액 조성 은 다음과 같다. 총부피 20

t1l에 10 x buffer(50 mM KCl , 10 mM Tris- HCl pH 8.8 , 1. 5 mM MgC lz, 0.1 % Triton X- 100) , 0.5 unit Taq DNA polymerase , 0.2 mM dNTP , 20 pmol primer와 주형을 넣었다. 1 차 PCR에서는 DNA 추출물 중에서 5 띠를 주형으 로 사용하였고 nested-PCR에서는 1 차 PCR

산물 중에서 1 띠를 주형으로 이용하였다. 1 차

PCR 반응은 95

C 에서 3분간 가열한 후 94

C 에 서 denaturation 1. 5분， 62

C 에서 annealing 1. 5 분， 72t 에 서 extension 2 분을 1 주기 로 하여 35회 반복하였고 nested-PCR에서는 95

C 에서

3 분간 가열한 후 94

C 에서 1 분， 68

C 에서 l

분， 72

C 에서 1 분을 1 주기로 하여 28 회를 자동 thermal cycler( GeneAmp PCR system 9600 , Perkin Elmer Cetus 1nc.) 를 이 용하여 실 행하였다. PCR을 시행한 후 반응의 확인을 위 하여 증폭된 DNA에 6 x loading buffer(0.25%

bromophenol blue , 0.25% xylene cyanol FF , 15 % Ficoll 400 ) 를 넣 어 2 % agarose gel에 서 전기영동을 한 후 ethidium bromide로 염색하 여 UV 상에서 PCR에 의해 증폭된 DNA를 확

4) PCR 산물의 제한 효소 분석

PCR 산물의 결핵균 특이성을 확인하기 위하여

nested-PCR 산물 10 띠에 제한 효소 (AsuI，

Hh al) 10 unit를 넣은 후 3TC 에서 6 시간 이상 반응시키고， 12% polyacrylamide gel에서 전기 영동을 하여 증폭된 DNA 단편을 분석하였다.

5) PCR - dot blot

CD Nylon membrane상에 DNA 고정 1 차 PCR 산물을 알칼리 변성 (0.4 M NaOH , 10 mM EDTA) 한 후， 냉장 보관된 2M am- monium acetate(pH 7.0) 를 넣은 다음 dot blot- ter(Bio- Rad , Bio- Dot Microfiltration Appa- ratus , U.S.A.) 를 이 용하여 nylon membrane 상 에 DNA를 옮긴 후 80

C 에서 2 시간 동안 건 조시켜 고정하였다.

@ Hybridization

Biotin으로 표식한 probe( 50 ng/ml)를 95

C

에 서 10분간 변 성 시 켜 hybridiza tion 용액

(1 mM EDT A , 7 % SDS , 0.25 M disodium phosphate pH 7.2 , 5% dextran sulfate) 과 혼 합한 후 hybridizer(Techne Ltd. , U. K.) 를 이 용하여 65

C 에 서 2 시 간 동안 hybridiza tion 하 였다. Hybridization 과정을 거친 membrane을 실온에서 2 x SSC( 0.3 M sodium chloride , O.

03 M sodium citrate dihydrate pH 7.0) , 1. 0%

SDS 로 세척하고 65

C 에서 1 x SSC , 1 % SDS

로 세척한 후 다시 실온에서 1 x SSC로 세척

하였다 18)

@ 화학 형광 발광 물질의 검출

Hybridization한 membrane을 blocking 완충 액 (0.2 % 1 - Block reagent , 1X PBS , 0.5%

SDS) 으로 세척한 다음 blocking 완충액에

AVIDx- AP(Tropix , 1nc. Massachusetts , U.S.

A.) 를 1 : 5， 000으로 희석한 용액에 20 분간 섞 어 준 후 blocking 완충액， 세척 완충액 (1 x PBS , 0.5 % SDS) , assay 완충액 (0.1 M die- thanolamine , 1 mM MgC1 2 ) 으로 각각 2 회 씩 세 척한 다음 membrane을 화학 형광 발광 기질액

(0.1 M diethanolamine, 1 mM MgClz, 0.25 mM CSPD ; Tropix, Inc. Massachusetts, U. S. A. )

으로 골고루 섞어 주었다. 모든 과정이 끝난 membrane은 건 조되 지 않게 plastic wrap에 싸 서 X-ray 필름 상에 20 분간 노출시킨 후 현

상하였다 11 ， 13)

m. ^실험성적

1. PCR 의 특이도

본 실험에 사용된 1S6110 primer의 특이도를

보기 위하여 사용한 결핵성 항산균 표준 균주 중

M. tuberculosis(ATCC 27294) 를 사용하여 1 차

PCR에 서 324 bp , nested - PCR에 서 는 239 bp의

특이한 DNA band를 확인할 수 있었다 (Fig. 1).

M 1 2 3 4

M I 2

Fig. 1. Identification of M. tuberculosis by specific Fig. 2. DNA fragments of nested - PCR digested primer based on IS6110 by Asu! and Hh a! restriction enzymes on 12 % M : DNA size marker (PhiX174/Hae m ) polyacrylamide gel electrophoresis.

Lane 1: First PCR of M. tuberculosis infected M : Molecular standard marker(PhiX174/Hae m) cells(324 bp) Lane 1 : DNA fragment of nested-PCR product Lane 2 : First PCR negative control digested with Asu!(1 10 , 59 , 46 , 24 bp) Lane 3 : Nested - PCR of M. tuberculosis infected Lane 2: DNA fragment of nested - PCR product

cells(239 bp) digested with Hh a!(185 , 54 bp)

Lane 4 : Nested - PCR negative contro l.

2. 제한 효소를 이용한 PCR 산물의 확인 였다 (Table 1). 따라서 nested-PCR은 PCR-

dot blot 보다 2 배 이상의 양성률을 나타내어

186110내의 염기 서열의 증폭을 확인하기 위 매우 높은 민감도를 가지고 있는 것으로 나타

해 nested-PCR 산물을 제한 효소 Asul과 났다.

Hha!으로 절단한 결과 AsuI'에 의해서는 4 개의

서로 다른 DNA 절편 (1 10 , 59 , 46 , 24 bp) 을 나 T able 1. Comparison of detection of M. tuberculosis 타내었고， 제한 효소 Hha/'에 의해서는 2 개의 in 59 specimens by nested - PCR and PCR - dot blot DNA 절편(1 85 ， 54 bp) 을 나타내어 결핵균

186110에 특이한 PCR 산물임을 확인하였다 (Fig. 2).

3. 임상 검체에서으I nested - PCR 과 PCR- dot blot 결과의 비교

총 59 예의 임상 검체 중 nested-PCR에서 는 35 예에서 양성을 나타내어 59.3% 의 양성 률을 보였다. 한편， PCR - dot blot의 경우 15 예에서 양성을 나타내어 25 .4%의 양성률을 보

Detection rate of

M. tuberculosis nested-PCR PCR - dot blot Positive rate(%) 35/59(59.3%) 15/59(25 .4%) Negative rate(%) 24/59(40.7%) 44/59 (74.6%)

N. 고 찰

1988년 8ail이 등에 의해서 처음으로 소개된

중합 효소 연쇄 반응은 DNA 염기 서열 중 원

하는 어느 특정한 부위를 수백만배 이상 증폭 에 많은 검체를 검사할 수 있다는 장점이 있으 시켜 증폭된 산물을 전기영동에 의하여 확인할 나， 실험 과정을 수행하는데 있어 검사 과정이 수 있는 분자생물학적 기법으로서， 분자생물학

의 발전에 많은 진전을 가져왔을 뿐만 아니라，

이를 임상적으로 활용함에 따라 질병 진단에

는 결핵균의 신속하고 정확한 검출을 위하여 nested-PCR 방법과 PCR - dot blot 방법으로，

동시에 동일한 검체 59 예로 실험을 실시하여 예민도와 정확성을 분석하였다. 먼저 nested-

PCR은 기존의 1 차 PCR을 보완한 방법으로서，

임상 검체에서 DNA를 추출한 후 결핵균 내의 특이적인 부위로 알려진 IS6110의 561-884

위치에서 1 차 PCR을 실시하고， 다시 그 내부 의 588-826 위치에서 1 차 PCR 산물을 주형 으로 이용하여 nested-PCR을 실시하였다 19) 그 결과， nested - PCR에서 59.3% 의 양성률을 나타내었다 (Table 1). Nested-PCR로 증폭된 결핵균 DNA의 확인을 위하여 중합 효소 연쇄 반응-제한 효소 절펀 다형성 (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymor- phisms : PCR - RFLP) 을 이용하여 분석하였다.

증폭된 PCR 산물에 두 가지 제 한 효소 ， AsuI 과 Hhal을 처 리 하여 반응한 후 잘라진 DNA

단편 의 길 이 를 12 % polyacrylamide gel을 이 용 하여 분석한 결과， 결핵균에 특이한 PCR 증폭 산물임이 확인되었다 (Fig. 2).

다음으로， PCR - dot blot 방법의 원리는 특 정한 DNA 염기 서열을 방사선 동위원소나 형 광 화학 발광 물질 둥으로 표식한 DNA probe

를 이용하여 병원체의 DNA 또는 RNA를 검출 할 수 있는 방법으로서 l6l7) ， 본 실험에서 결핵 균 PCR - dot blot을 시행하는데 필요한 주형은 1 차 PCR 산물을 이용하였고， probe는 PCR 산 물 내의 염기 서열을 이용하였으며， 형광 화학 발광 물질인 biotin으로 probe를 표식하여 PCR

-dot blot을 실시하였다. PCR - dot blot을 실 행한 결과 25.4%의 양성률을 나타내어 nested

- PCR (59.3%) 보다 낮은 양성률을 나타내었

r:t (Table 1). PCR-dot blot의 경우에는 한번

복잡하고， 많은 시간이 소모되며， 시약 조제의 번거로움 등의 단점이 있다. 이에 비해 nested

-PCR의 경우 방법이 간단하며， 신속한 검사가 가능하고 결과의 판독이 용이하다는 장점을 가 지고 있다. 이상의 결과로 볼 때， nested - PCR

방법은 1 차 PCR 방법이나 PCR - dot blot에 비 하여 신속하고 정확한 진단이 가능하므로 임상 검사실에서 매우 잘 활용 할 수 있을 것으로 사 료된다.

v. ^결 론

본 실험에서는 결핵균의 검출을 위하여 nest-

ed-PCR과 PCR - dot blot을 동시에 시행하였 으며， 각각의 민감도를 비교 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1) 총 59 예의 nested-PCR을 실시하여서

239 bp의 DNA 단편을 확인할 수 있었으 며， 35 예 (59.3% )가 양성으로 나타났다.

2) 화학 발광 물질을 이용한 PCR - dot blot

에서는 총 59 예 중 15 예 (25 .4% )에서 양 성을 나타내어， PCR - dot blot 보다는 nested-PCR에서 약 2 배 이상의 양성률 을 보였다.

본 실험의 결과， 임상 검체의 결핵균 동정을 위해서는 신속하고 민감도가 높은 nested- PCR 방법이 유용하다는 것을 알 수 있었다. 나 아가 균수가 적은 뇌척수액， 소변 등 각종 체액 에서도 PCR - dot blot 방법보다 효과적으로 활 용될 수 있으리라 사료된다.

REFERENCES

1. 김미영， 이무주， 최철석 : 질내 가검물 및 소 변 에 서 nested-PCR을 이 용한 Chlamydia trachomatis의 검 출. 대 한임 상병 리 학회 . 추계 학술대회. 1995.

2. 김미영， 이무주， 최철석， 이경옥 : 체액에서

nested-PCR을 이용한 결핵균 검출에 관한 고찰. 임상병리검사 과학회지 27 : 98-104 , 1995.

3. 박남일， 김법완 : 이중 중합 효소 연쇄 반응 을 이용한 요중 결핵균 핵산 검사. 대한비 뇨기과학회지 5 : 465 - 468 , 1994.

4. 서상철， 은상진， 김한길， 송경은， 서장수， 최 성만， 이원길， 김재식， 김중명 : 결핵의 진단 법으로서 중합 효소 연쇄 반응의 가치. 경 북의대지 35 : 14-35 , 1994.

5. 윤경한， 이태윤， 조상래， 김득순， 정동현， 김 주덕 : 가검물내 결핵균 검출에 있어서

DNA 분리 방법에 따른 중합 효소 연쇄 반 옹의 민감도 비교. 대한미생물학회지 26 : 159 -166 , 199 1.

6. 이무주， 김미영 : 자궁 경부 세포에서 nest-

ed-PCR을 이 용한 human papilloma virus

의 측정. 대한임상병리학회. 추계학술대회.

1995.

7. 최철석， 김은아， 이경옥 : 임상 가검물에서 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 결핵균 진단 의 평가. 대한미생물학회지 28 : 381- 389 , 1993.

8. 최철석， 이경옥， 이규범 : PCR을 이용한 결 핵균 진단에 있어서 효과적인 DNA 추출 법. 대한미생물학회지 29 : 147-152 , 1994.

9. 최철석， 김은아， 이경옥， 이규범， 이연태 : 임상 혈청에서 중합 효소 연쇄 반응을 이용 한 HCV-RNA의 측정. 대한바이러스학회 지 24:87-92 , 1993.

10. Brisson NA , Aznar C , Chureau C , Nguyen S. Pierre C. Bartoli M. Bonete R. Pialoux G, Gicquel B and Garriqe G. : Diagnosis of tuberculosis by DNA amplification in clini cal practice evaluation. Lancet 338 : 364- 366.199 1.

1 1. Bronstein 1 and McGrath P. Chemilu- minesce light up. Nature 338: 599 - 600, 1989.

12. Bronstein 1 , Voyta JC , Lazzari KG , Murphy

0 , Edwards B and Kricka LJ. : Rapid and sensitivity detection of DNA in southern blots with chemiluminescence. BioTechniques 8 : 310-314 , 1990.

13. Cousins DV , Wilton SD , Francis BR and Gow BL. : Use of polymerase chain reac- tion for rapid diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 30 : 495 - 503 , 1990.

14. Hong YK.: Epidermiology of tuberculosis - result of study in Korea. J Kor Med Assoc. 34 : 468-476 , 199 1.

15. Kirby KS. : Isolation of nucleic acids with phenolic solvents. In: Gross man L and maldave K (Ed). Methods in enzymology.

Academic press , London.

16. Kreike CM , de Konin JRA and Krens F A. : Nonradioactive detection of single- copy DNA - DNA hybrids. Plant Mol Biol Reporter 8(3) : 172-179 , 1990.

17. Lanzillo. : Preparation of digoxigenin -la- beled probes by polymerase chain reac- tion. BioTechniques 8 : 620 - 622 , 1990.

18. Leary JJ , Bridgati DJ and Ward DC.:

Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin -labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio- Blots. Pro. Natl.

Acad. Sci. (USA) 80 : 4045-4049 , 1983.

19. Miyazaki Y , Koga H, Kohno S and Kaku M. : Nested polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. J Clin Microbiol. 31:

2228 - 2232 , 1993.

20. Pao CC, Y ou JB, Maa JS, Fiss EH and Chang CH.: Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA am- plification. J Clin Microbiol. 28: 1877- 1880 , 1990.

2 1. Sail이 RK, Scharf S , Faloona F, Mullis

KB , Horn GT and Erlich H. : Primer di-

rected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Sci- ence 239 : 489-491 , 1988.

22. Shankar P , Manjunath N , Mohan KK , Prasad K , Behari M , Shriniwas and Ahuja GK.: Rapid diagnosis of tubercu- lous meningitis by polymerase chain reac- tion. Lancet 337 : 5-7 , 199 1.

23. Southern EM. : Detection specific sequence among DNA fragments segregated by gel electrophoresis. J Mol Bio. 98 : 503-517.

24. Thierry D , Brisson NA , Vincent LF , Ngu yen S and Guesdon JL. : Characterization of a Mycobacterium tuberculosis insertion sequence , IS and its application in diagno- sis. J Clin Microbio l. 28: 2668 - 2673 , 1990.

25. Yanez MA , Coppola MP , Russo DA , Delaha E , Chaparas SD and Yeager H Jr. : Determination of mycobacterial anti- gens in sputum by enzyme immunoassay.

J Clin Microbiol. 23 : 822 - 825 , 1986.