당나귀 사골 효소 분해물의 항산화 활성 및 자외선으로부터 피부 세포보호 효과

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당나귀 사골 효소 분해물의 항산화 활성 및 자외선으로부터 피부 세포보호 효과

김동욱 ∙ 김한나 ∙ 장애라^* 강원대학교 동물생명과학대학 동물생명과학과

Anti-oxidative Activity and Fibroblast Cell Protection Effect of Donkey Bone Hydrolysate Against Ultraviolet B

Dongwook Kim, Hanna Kim and Aera Jang^*

Department of Animal Life Science, College of Animal Life Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea

ABSTRACT¹⁾

Low molecular weight hydrolysates from donkey bone extracts (LHDB) was prepared with different food enzymes, and its antioxidative, elastase and collagenase inhibitory, and fibroblast cell protection effects against photoaging were evaluated. Gelatin from donkey bone was extracted three times at 121℃ for 1 h and was lyophilized. The lyophilized powder (5 g) was dissolved in 95 mL distilled water with 1% FoodPro alkaline protease (A), 1% Protease P (P), 1% Protease M (M) and a 0.3% A + 0.3% P + 0.3% M (APM) mixture and was hydrolyzed for 3 h at 45℃. After enzyme inactivation at 90℃ for 10 min, the LHDBs hydrolyzed by A, P, M, and APM were separated by centrifugal filtration and were lyophilized and marked as LHDB-A, LHDB-P, LHDB-M, LHDB-APM. The LHDB-M showed higher 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline–6- sulphonic acid (ABTS) radical scavenging activity, ferric reducing antioxidant power (FRAP) and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) than the other treatments (p<0.05).

The elastase inhibition effect (37.49%) of LHDB-M were significantly higher than those of the other treatments (9.97-34.18%). The viability of human fibroblast cells (Hs68) after UVB irradiation was significantly increased by LHDB-M, indicating that it can be used as an antioxidant or as a UVB stress protector. However, further in vivo studies should precede its usage in the bioactive compound industry.

(Key Words: Hydrolysates, Donkey bone extracts, Antioxidative, Fibroblast, Photoaging)

* Corresponding author: Aera Jang, Department of Animal Life Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea. Tel:

+82-33-250-8643, E-mail: [email protected].

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Ⅰ. 서론

최근 우리나라 국민의 노령화가 급속도로 진행되고 삶 의 질 향상 즉, 아름다운 삶에 대한 욕구가 증가하면서 피 부 건강에 대한 관심이 확대되고 있다. 특히 자외선 노출에 의한 피부 광노화에 대한 관심이 증가하고 있는데, 이는 자 외선에 장시간 노출 시 피부탄력이 낮아져 주름형성에 영

향을 미치기 때문이다. 이에 식품 섭취를 통해 아름답고 건 강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 식품 및 기능성 화장품이 개발되었으며, 특히 피부 주름형성 예방 및 개선을 위한 천연 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Yaar and Gilchrest., 1998; Kim et al., 2007).

최근에는 식품효소를 이용한 단백질 효소분해물의 다양 한 생리활성기능이 보고되었다. 그 중 FoodPro^Ⓡalkaline

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protease는 식육가공분야에서 추출물의 풍미와 수율을 증 진시키는 목적으로 사용하고 있다. Protease P는 Bacillus protease complex이고, Protease M은 Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens 등과 같은 미생물에서 분리한 효소로서 식품의 바람직한 풍미, 형태와 조직감 등을 얻기 위해 흔히 사용하고 있는 효소이다. 이들 효소는 식품 단백질을 가공에 알맞은 형태 로 분해하는데 최적의 효과를 나타내며 분해과정에서 다 양한 크기와 구조의 펩타이드 및 아미노산을 생성하게 된 다. 거대한 분자크기를 가진 단백질 자체 보다는 저분자크 기의 펩타이드 및 아미노산이 장내 흡수율도 높일 수 있 고, 다양한 생리활성기능을 보인다. 아미노산 잔기 중 tyrosine, methionine, histidine, lysine, tryptophan은 과산 화금속이온의 킬레이팅을 통해 항산화 활성을 갖는다. 이 들 중 특히 항산화 활성기능을 갖는 펩타이드의 경우 피부 주름억제에 효과가 있음이 보고되었다(Kim et al., 2018).

항산화 활성기능을 가진 펩타이드는 난황(Park et al., 2001), 로얄젤리(Guo et al., 2009), 말의 사골(Kim et al., 2013), 당나귀 아교 등(Kim et al., 2018)과 같은 다양한 단 백질 식품 원료로부터 분리되어 연구되고 있다. 특히 당나 귀 아교로 알려진 콜라겐 성분이 많은 껍질은 중국에서 민 간요법으로 널리 활용되고 있으며 항산화 활성, 신경보호 효과, 항당뇨 등의 효과가 보고되고 있다. Zhuang 등 (2009)은 마우스 피부에 UV를 조사한 후 콜라겐 저분자 효 소분해물의 급여가 콜라겐 원료를 급여시보다 항산화 효 소 활성이 높았고, 피부 콜라겐 합성을 촉진한다고 하였다.

Kim 등(2018)도 당나귀 껍질의 젤라틴 저분자 효소분해물 이 항산화 활성이 높으며, 자외선으로 인한 산화스트레스 로부터 피부를 보호한다고 하였다. 그러나 당나귀의 사골 에서 추출한 단백질 내 효소분해를 통해 분리한 저분자 펩 타이드의 항산화 활성과 피부탄력과 주름에 영향하는 elastase와 collagenase에 미치는 영향에 대한 연구는 거의 없다. 따라서 본 연구는 당나귀 사골에서 추출한 단백질에 식품효소를 이용하여 3kDa 이하의 저분자 효소분해물을 분리하고 이들의 항산화 활성과 elastase 및 collagenase 억 제 활성으로 인한 피부 주름생성 억제효과, 그리고 자외선 (UVB)으로부터 인간피부섬유아세포 보호효과를 평가하여 피부건강 증진 식품소재 개발을 위한 기초자료로 활용하 기 위해 실시하였다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시료의 제조

본 실험에 사용된 당나귀 사골은 20개월령의 당나귀를 도축 후 구입하여 사용하였다. 당나귀 사골 젤라틴 추출 및 3kDa 이하 저분자 효소분해물 제조 과정은 Fig. 1에 나 타내었다. 당나귀 사골은 4℃ 증류수에 24시간 방치하여 핏물을 제거하였으며, 100℃ 끓는 물에서 20분 동안 가열 하고, 이를 수세하여 이물질을 제거한 후 사용하였다. 전 처리된 당나귀 사골 400g에 증류수 600ml을 넣고, 고온고 압기(121℃, 1.5kgf/cm²)에서 1시간 동안 1차 추출하였다.

1차 추출물을 150μm 체를 이용하여 여과하였다. 여과액을 분리하고 당나귀 사골에 대해 다시 동일한 조건으로 반복 추출을 하여 총 3회 추출을 실시하였다. 회수된 1, 2, 3차 당나귀 사골 젤라틴 추출물은 혼합 후 동결건조하였다. 동 결건조된 당나귀 사골 젤라틴 분말을 증류수에 5%가 되도 록 희석한 후 1% 단백질분해 효소를 첨가하였다. 사용된 단백질 분해효소는 FoodPro alkaline protease(A, Dupont Danisco, Denmark), Protease P(P, Amano Enzyme, USA), Protease M(M, Amano Enzyme, USA)을 사용하였으며, A 와 P 효소처리의 경우 pH를 7.0로 보정하였고, M과 APM 은 pH를 5.0으로 보정하여 45℃에서 3시간 효소분해 하였 다. 효소분해 후 90℃에서 10분간 효소 불활성화 과정을 실시하였으며, membrane filter units(3kDa, Millipore, Ireland)를 이용하여 3kDa 이하의 당나귀 사골 저분자 효 소분해물을 분리한 후 동결 건조하여 사용하였다.

2. 가수분해도

당나귀 사골 3kDa 이하의 저분자 효소분해물의 가수분 해도는 Hoyle와 Merritt(1994) 방법을 이용하여 측정하였 다. 저분자 효소분해물과 20% trichloroacetic acid(TCA)를 1:1로 혼합하여 상온에서 30분간 방치한 다음 원심분리 (3,000xg, 15분)하여 상등액을 취하였다. 그다음 Bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit(Sigma Chemical Co., USA)를 이용하여 단백질 함량을 측정한 후 다음과 같은 계산방법으로 가수분해도(%)를 계산하였다.

DH (%) = (Soluble protein content in 10% TCA / total protein content in sample)× 100

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Donkey bone

Ÿ Removing debris in water at 4℃ for 12 h Ÿ Heating for 20 min and filtration (gauze) to

remove fat and residue Gelatin extraction (three times)

Ÿ Donkey bone 400 g + DW 600 mL

Ÿ Extraction at 121℃, 1.5 kgf/cm² for 1 h and filtration (150 μm mesh)

Mix with those gelatin extract Ÿ Lyophilization

Add lyophilized donkey bone gelatin powder (5 g) into DW (95 mL)

Add 1% FoodPro Alkaline Protease (A)

Add 1%

Protease P (P) Add 1%

Protease M (M)

Add 0.33% FoodPro Alkaline Protease,

0.33% Protease P, 0.33% Protease M (APM)

Enzyme hydrolysis for 3 h at 45℃

Ÿ Enzyme inactivation at 90℃ for 10 min Centrifugal membrane filtration (<3 kDa)

Low molecular weight hydrolysate (<3 kDa) from donkey bone extract (LHDB)

LHDB-A LHDB-P LHDB-M LHDB-APM

Fig. 1. Preparation procedure of low molecular weight hydrolysate from donkey bone extracts.

3. 항산화 활성

(1) 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼 소거활 성 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Blois 방법(1958)을 이용하여 측정 하였다. DPPH(0.2M) 용액 1ml과 시료 1ml을 혼합하여 암실 에서 30분간 반응시킨 다음 UV/VIS spectrophotometer (SpectraMax M2e, Molecular Devices, USA)를 사용하여 흡광도 517nm에서 측정하였다. 표준물질로 trolox를 사용 하였으며, trolox 농도에 해당하는 μM trolox/g로 계산하 여 결과를 나타내었다.

(2) 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) 라디칼 소거 활성 측정

ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(1999)의 방법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. ABTS(7mM) 용액과 potassium

persulphate(2.45mM) 용액을 동량으로 혼합하여 실온에서 12~16시간 동안 암소에서 방치하여 ABTS⁺라디칼을 형성 시켰다. 라디칼이 생성된 용액을 흡광도(735nm) 값이 0.700±0.02가 되도록 희석한 다음, 각 시료 50µl와 ABTS⁺용 액 950µl를 혼합하여 30℃에서 30분간 암실에서 반응시킨 다음 UV/VIS spectrophotometer(SpectraMax M2e, Molecular Devices, USA)을 이용하여 735nm에서 흡광도 를 측정하였다. 표준물질로 사용한 trolox 농도에 해당하는 μM trolox/g로 계산하여 결과를 나타내었다.

(3) Ferric reducing antioxidants power(FRAP)

FRAP 활성은 Benzie와 Strain(1996)의 방법을 이용하여 측정하였다. Acetate buffer(300mM, pH 3.6)와 40mM HCl 에 녹인 10mM TPTZ(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine), 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1의 비율로 혼합하여 반응용 액(FRAP solution)을 만들어 37℃를 유지하면서 사용하였

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다. 각 시료 또는 trolox 표준물질 25μl와 FRAP solution 175μl를 96 well plate에 혼합하여 37℃에서 30분간 암실에 서 방치한 후, 590nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 표준물질로 사용한 trolox 농도에 해당하는 μM trolox/g 로 계산하여 결과를 나타내었다.

(4) Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)

ORAC은 Gillespie 등(2007)의 방법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 시료 또는 trolox 표준물질 25μl와 80 nM fluorescein 150μl를 black 96 well plate에 넣어 혼합한 뒤 37℃에서 15분 동안 방치하였다. 이후 150mM AAPH 25µl 넣고, 혼합한 뒤 fluorescent microplate reader (SpectraMax M2e, Molecular Devices, US)를 사용하여 excitation wavelength 485nm, emission wavelength 520nm로 37℃에서 60분 동안 1분 간격으로 측정하였다.

각 시료와 trolox의 area under the curve(AUC)를 측정하 고, trolox 농도와 AUC간의 회귀곡선을 이용하여 결과는 μM trolox/g로 나타내었다.

4. Elastase 저해 활성

Elastase 저해 활성은 Kraunsoe 등(1996) 방법을 이용하 여 분석하였다. 각 시료 100µl와 0.2M Tris-HCl buffe(pH 8.0) 120µl, 1.0mM N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 20μl를 혼합한 뒤 25℃에서 10분간 배양하였다. 그다음 1 unit/ml 이 되도록 희석한 효소(Porcine pancreas elastase)를 20μl 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하 여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

5. Collagenase 저해 활성

Collagenase 저해 활성은 Wuensch와 Heidrich(1963) 방법 을 이용하여 다음과 같은 방법으로 측정하였다. Clostridium histolyticum에서 유래한 collagenase와 각각의 시료는 0.1M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 녹이고, collagenase chromophore-substrate는 4mM CaCl2을 함유하는 0.1M tris-HCl buffer(pH 7.5)에 희석하여 사용하였다. 각각의 시 료 100μl와 0.2mg/ml의 collagenase 150μl, collagenase chromophore-substrate 250μl를 혼합하여 실온에서 20분간 암소에 방치하였다. 이후 6% citric acid를 0.5ml 첨가하여 반응을 정지시키고 ethyl acetate 1.5ml을 넣은 다음 320 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

6. MALDI-TOF를 이용한 당나귀 사골 저분자 추출물의 분자량확인

당나귀 껍질 및 사골 젤라틴 저분자 효소분해물의 구성 펩타이드의 분자량을 확인하기 위해 matrix는 sinapinic acid를 사용하였다. Sinapinic acid는 acetonitrile과 0.1%

trifluoroacetic acid를 70:30 비율로 혼합한 용매에 용해하 여 사용하였다. 그다음 matrix 용매와 시료를 각각 1:1 비 율로 혼합한 뒤 MALDI plate에 점적 및 건조한 후 Autoflex MALDI-TOF(Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA)를 이용하여 reflector positive 모드에서 500~3,000 m/z 범위 내 질량분석을 실시하였다.

7. 세포배양 및 자외선(UVB) 조사

인간피부섬유아세포(Hs68)는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.

세포배양은 Dulbeco’s modified eagle’s medium(DMEM)배 지에 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin (100U/ml)을 첨가하여, 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 배 양하였다. 자외선(UVB) 조사는 인간피부 섬유아세포를 배 양한 plate 내 배지를 DPBS로 교체한 다음 UVB 램프 (T-15M, Vilber Lourmat, France)를 이용하여 100mJ/cm² 의 UVB 조사를 실시하였다. 그 후 다시 DPBS로 세척을 실시하여 1% penicillin/streptomycin이 함유된 serum-free 배지로 교체하고 시료를 농도별로 첨가하여 37℃, 5% CO2

인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

8. 세포독성 및 생존율 측정

인간피부섬유아세포(Hs68)의 세포독성 및 세포생존율 측정은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. Hs68 세포를 배양 후 시료를 농도별로 처리하여 세포독성을 측정하고, 자외선(UVB)을 100mJ/cm²로 조사한 다음 시료를 농도별 로 24시간 처리하여 세포생존율을 측정하였다. MTT stock solution 시약을 4시간 동안 처리한 다음 배지를 제거하였다.

그 후 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 넣어 생성된 formazan crystals을 용해시키고 UV/VIS spectrophotometer(SpectraMax M2e, Molecular Devices, US)를 이용하여 540nm에서 흡광 도를 측정하였다. 세포독성 및 세포생존율 결과값은 대조 군에 대한 백분율로 나타내었다.

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Table 1. Degree of hydrolysis of low molecular weight donkey bone hydrolysates (%)

Treatments Degree of hydrolysis

LHDB-A 88.01^a

LHDB-P 91.60^a

LHDB-M 90.32^a

LHDB-APM 89.76^a

SEM¹⁾ 2.024

aMeans within a column with different superscript differ significantly at p<0.05.

1)SEM: Standard error of means.

LHDB, low molecular weight hydrolysates from donkey bone extracts; LHDB-A, LHDB hydrolyzed by 1% FoodPro alkaline protease;

LHDB-P, LHDB hydrolyzed by 1% Protease P; LHDB-M, LHDB hydrolyzed by 1% Protease M; LHDB-APM, LHDB hydrolyzed by mixture of 0.3% FoodPro alkaline protease, 0.3% Protease P, and 0.3% Protease M.

9. 통계분석

본 실험의 모든 결과는 SAS program(ver. 9.4 Statistics Analytical System)의 General Linear Model(GLM)방법을 이용하여 one-way ANOVA로 분석하였다. 처리군의 평균 값간의 비교를 위해 Tukey's방법을 이용하여 p<0.05 수준 에서 유의성 검정을 하였다. 모든 통계 수치는 평균값과 평균표준오차로 나타내었다.

Ⅲ. 결과 및 고찰

1. 가수분해도

당나귀 사골 추출물에 식품효소를 첨가하여 효소분해 한 후 가수분해도를 측정한 결과 효소분해물의 가수분해도는 88.01~91.60%의 범위를 보였으나 처리 효소에 따른 차이는 보이지 않았다(Table 1). 본 연구에 사용된 효소인 FoodPro alkaline protease는 alkaline serine endopeptidase로서 Bacillus licheniformis로부터 유래된 효소이며 주로 단백질 분해수율증진을 위해 사용된다. 또한 Protease P는 Aspergillus melleus로 부터, Protease M은 Aspergillus oryzae 에서 유래된 protease 효소로서 이들 모두 단백질의 펩타 이드 결합을 분해한다. 특히 Protease M은 광범위한 분해 특이성을 갖고 있다. Endopeptidase는 일부 특정 부위만을 분해하지만 protease는 endo- 및 exo- peptidase로 작용하 기 때문에 대상 단백질원에 대해 최적 pH와 온도조건에서 분해했을 때 생산되는 펩타이드는 그 종류는 다를 수 있으 나 가수분해율은 유사했던 것으로 판단된다.

2. 항산화 활성

당나귀 사골 추출물에 식품효소를 첨가하여 분해한 후 이들 각각의 3kDa 이하의 저분자 효소분해물의 항산화 활 성을 Table 2에 나타내었다. 식품 내 구성성분의 항산화 활 성 분석은 식품제품 내 항산화 물질의 함량을 측정하여 산 화에 대항하는 능력과 식품 섭취 후 생체 내부에서 항산화 활성을 갖는지에 대한 정보를 나타낼 수 있다. DPPH와 ABTS 라디칼 소거능, FRAP은 LHDB-A와 LHDB-M이 LHDB-P와 LHDB-APM보다 유의적으로 높은 수치를 나타 내었다(p<0.05). 특히 ORAC활성은 LHDB-M이 204.45μM TE/g을 보여 105.99~161.53μM TE/g의 범위를 나타낸 다 른 처리구에 비해 가장 높은 활성을 보였다(p<0.05).

DPPH 라디칼 소거능은 보라색을 띄는 비교적 안정한 보 라색의 자유 라디칼로서 항산화제, 방향족 아민류에 의해 수소나 전자를 받아 환원되어 안정한 분자를 형성하게 된 다. ABTS 라디칼 소거능은 수용성 상태의 시료에서 발생 된 ABTS+라디칼을 소거할 수 있는 수소공여활성을 측정 하여 나타내는 방법이며, FRAP은 전자를 제공하는 항산화 물질에 의해 무색의 산화된 Fe⁺³가 Fe⁺²-tripyridyltriazine 성분으로 환원되면서 발생하는 물질을 측정하는 방법으로 라디컬 소거능 메카니즘과는 다른 환원력 측정을 통한 측 정법이다. ORAC활성은 AAPH에 의해 발생된 퍼옥시라디 칼을 저해하는 활성을 측정하는 것으로 기존 여러 항산화 활성 측정방법에 비해 반응 감도가 예민하여 가장 신뢰성 있는 방법으로 알려져 있다(Kim et al., 2013). 따라서 항산 화 활성을 측정 시 이들 중 하나의 결과를 제시하는 것보 다는 다양한 항산화 활성 메카니즘을 살펴보는 것이 중요 하기 때문에 이들 결과를 동시에 비교하는 것이 필요하다. Kim 등(2013)은 돼지 껍질 젤라틴에 flavorzyme으로 효소

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Table 2. Anti-oxidative activity of low molecular weight donkey bone hydrolysates (μM TE/g) Treatments DPPH radical

scavenging activity ABTS radical

scavenging activity FRAP ORAC

LHDB-A 11.08â 29.64â 7.52â 105.99^c

LHDB-P 8.32^b 18.90^b 4.68^b 154.79^b

LHDB-M 11.29â 26.90â 6.64â 204.45â

LHDB-APM 9.59^b 19.15^b 5.28^b 161.53^b

SEM¹⁾ 0.300 0.801 0.234 5.352

a-cMeans within a column with different superscript differ significantly at p<0.05.

LHDB, low molecular weight hydrolysates from donkey bone extracts; LHDB-A, LHDB hydrolysed by 1% FoodPro alkaline protease;

LHDB-P, LHDB hydrolysed by 1% Protease P; LHDB-M, LHDB hydrolysed by 1% Protease M; LHDB-APM, LHDB hydrolysed by mixture of 0.3% FoodPro alkaline protease, 0.3% Protease P, and 0.3% Protease M.

DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid FRAP: ferric reducing antioxidant power

ORAC: Oxygen radical absorbance capacity

분해한 후 분리한 3kDa 이하의 저분자 펩타이드의 ORAC 활성이 141.39μM TE/g를 나타낸다고 보고하였으며, 또한 Kim 등(2013)은 말 사골 추출물에 pepsin과 pancreatin으 로 효소분해한 3kDa 이하의 저분자 펩타이드가 DPPH 및 ABTS 항산화 활성에서 각각 7μM TE/g과 24μM TE/g를 나타내었다고 하였다. 이들 결과와 비교한 결과, 본 연구에 서 분리한 당나귀 사골 저분자 효소분해물(LHDB-M)의 항 산화 활성이 기존의 문헌에서 보고된 것보다 높은 것으로 판단된다.

단백질 효소분해물의 항산화 활성은 효소분해물의 아미 노산 함량, 아미노산 서열, 저분자 펩타이드 비율에 따라 달라지며, 이는 가수분해에 사용된 단백질 분해효소에 의 해 차이가 발생할 수 있다(Intarasirisawat et al., 2012). 특 히 동물성 단백질 효소분해물 중 3kDa 이하의 저분자 펩 타이드가 거대 분자량의 펩타이드 보다 우수한 항산화 활 성을 나타낸다(Jang et al., 2016).

따라서 기존의 선행결과에서 제시된 항산화 활성보다 당나귀 사골 저분자 효소분해물(LHDB-M)의 활성이 높은 것은 본 연구에서 가수분해에 사용된 단백질 분해효소에 의해 분해된 펩타이드의 특성 차이가 영향을 미친 것으로 생각된다. 추후 당나귀 사골 저분자 효소분해물(LHDB-M) 의 유효펩타이드 서열 분석을 통한 효과확인시험이 필요 할 것으로 판단된다.

3. Elastase와 collagenase 억제효과

당나귀 사골 추출물을 효소 분해한 후 이들 각각의

3kDa 이하의 저분자 효소분해물의 elastase 억제 활성과 collagenase 억제 활성을 Table 3에 나타내었다. 본 연구결 과 LHDB-M이 37.49%로 가장 높은 elastase 억제 효과를 나타내었으며, LHDB-P는 19.97%로 가장 낮은 elastase 억 제 효과를 나타내었다(p<0.05). 또한 3kDa 이하의 저분자 효소분해물의 collagenase 억제 효과를 측정한 결과 LHDB-M이 64.84%로 LHDB-APM 보다 유의적으로 높은 억제효과를 보였으나 LHDB-A와 LHDB-P는 유의적인 차 이를 보이지 않았다. Kim 등(2018)에 의하면 당나귀 껍질 젤라틴 추출물에 단백질 효소를 이용하여 3kDa 이하로 분 해한 다음 elastase와 collagenase 억제 활성을 측정한 결 과, 각각 15.10~23.68%와 42.31~55.21% 억제 효과를 나타 내었다고 보고하였다. 본 연구에서는 당나귀 사골 3kDa 이 하의 저분자 효소분해물은 각각 19.97~37.49%와 58.30~

64.84%로 더 높은 억제 효과를 보였다.

Elastin은 피부 세포외기질(ECM: extracellular matrix)을 구성하는 성분중의 하나이며, elastase는 동물 결합 조직의 불용성 탄성 섬유 경단백질인 elastin을 분해하는 유일한 효소로서 콜라겐과 elastin 같은 결합조직을 지지하고 구성 하는 모든 단백질들을 분해한다. 그러므로 elastase 저해제 는 피부 주름을 개선하는 작용을 한다(Balo and Banga.

1950). 콜라겐은 진피 층의 90% 이상으로 구성되어 있고 주 단백질로서 피부 탄력과 구조를 유지하는 역할을 하고 있다. 피부 노화 발생 시 피부섬유아세포의 기능 저하로 인해 젤라틴 생성능이 감소될 뿐만 아니라 collagenase에 의해 젤라틴이 분해됨에 따라 피부 내 불규칙한 구조를 형 성하여 잔주름 및 주름을 생성한다. 이는 피부 진피조직의

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Table 3. Elastase and collagenase inhibitory activity of low molecular weight donkey bone hydrolysates (%)

Treatments Elastase inhibitory activity Collagenase inhibitory activity

LHDB-A 34.18^b 62.76^ab

LHDB-P 19.97^c 61.40^ab

LHDB-M 37.49^a 64.84^a

LHDB-APM 33.09^b 58.30^b

SEM¹⁾ 0.695 1.275

a-c Means within a column with different superscript differ significantly at p<0.05.

LHDB, low molecular weight hydrolysates from donkey bone extracts; LHDB-A, LHDB hydrolysed by 1% FoodPro alkaline protease;

LHDB-P, LHDB hydrolysed by 1% Protease P; LHDB-M, LHDB hydrolysed by 1% Protease M; LHDB-APM, LHDB hydrolysed by mixture of 0.3% FoodPro alkaline protease, 0.3% Protease P, and 0.3% Protease M.

교원질 중 주 단백질인 콜라겐의 감소에 의한 것이라 할 수 있다. 또한 피부 내 collagenase와 elastase는 노화뿐만 아니라 자외선 조사에 의해 collagen과 elastin 분해를 촉진 시켜 주름과 탄력 저하 및 피부 처짐을 유발한다(Getie et al., 2005; Park et al., 2017). 즉, 피부가 UVB에 노출되면 복잡한 메카니즘을 통해 생리적인 변화를 일으키게 되는 데 궁극적으로는 활성산소종이나 MMPs와 elastase 분비를 촉진하여 주름이나 조직의 손상을 만들게 되므로 이를 억 제하기 위해서는 항산화제가 필요하다(Widowati et al., 2017; Kim et al., 2018). 본 연구에서 LHDB-M이 다른 처 리구보다 elastase 억제활성이 높았던 것은 항산화활성 중

특히 높은 ORAC 활성과 관련이 있을 것으로 판단된다.

4. 당나귀 사골 저분자 추출물의 분자량확인

당나귀 사골 추출물을 효소 분해한 후 이들 각각의 3kDa 이하의 저분자 효소분해물의 항산화 활성과 elastase 와 collagenase 억제활성이 가장 높았던 LHDB-M을 선택 하여 구성 펩타이드의 분자량 분포를 MALDI-TOF를 이용 하여 측정하였다(Fig. 2). 그 결과 LHDB-M은 3kDa 이하의 여러 가지 펩타이드로 구성되어 있는 것으로 확인하였다.

Fig. 2. Molecular weight of peptides in LHDB-M using MALDI-TOF.

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Fig. 3. Effects of different concentration of LHDB-M on Hs68 cell cytotoxicity (A), viability (B), and morphology (C) after UVB irradiation.

a-eValues of bar with different superscript among treatments differ significantly at p<0.05.

CON, Hs68 cell without UVB; UVB-CON, UVB irradiated Hs68 cell; LHDB-M, LHDB hydrolyzed by 1% Protease M.

5. 세포독성 및 자외선 조사 후 생존율

인간피부섬유아세포(Hs68)에서 LHDB-M의 처리가 세포 독성과 자외선(UVB) 조사에 의한 세포 증식에 미치는 영 향을 확인하기 위해 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 본 연구 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 피부섬 유아세포에 LHDB-M을 10, 50, 100, 250, 500μg/ml의 농도 로 처리 한 후 세포독성을 살펴본 결과 모든 처리농도에서 유의적인 차이를 보이지 않아 처리농도에서 세포독성은 없는 것으로 판단되었다(Fig. 3A). 한편 피부섬유아세포에 UVB를 100mJ/cm²의 양으로 조사 한 후 LHDB-M을 10, 50, 100, 250, 500μg/ml의 농도로 처리한 후 세포 생존율을 측정한 결과, UVB만 조사한 대조구보다 모든 처리 농도에 서 유의적으로 cell viability가 증가하는 것으로 나타났다

(Fig. 3B and 3C, p<0.05). 이는 LHDB-M의 처리가 UVB 조사로 광스트레스를 받은 피부섬유아세포를 보호하는 것 으로 판단된다. Kim 등(2018)은 당나귀 껍질 저분자 효소 분해물이 100mJ/cm²양의 UVB로 조사된 피부섬유아세포 의 보효효과를 나타내었으며 이는 당나귀 껍질 저분자 효 소분해물이 강한 항산화 활성을 나타내어 UVB 조사로 인 한 산화스트레스를 억제하였기 때문이라고 보고 하여 본 연구결과와 유사한 결과를 나타내었다. 따라서 LHDB-M은 당나귀 사골 효소분해물(3kDa 이하) 중 항산화활성이 가 장 우수하며 피부주름형성에 주로 영향하는 elastase와 collagenase 억제 효과를 나타내고, 자외선으로부터 피부섬 유아세포 보호효과를 나타내어 피부건강을 증진시킬 수 있는 식품소재로 활용가능성이 있는 것으로 판단된다.

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Ⅳ. 요약

본 연구는 당나귀 사골 추출물에 식품효소를 이용하여 3kDa 이하의 저분자 효소분해물로 분리하고 이들의 항산 화 활성과 elastase 및 collagenase 억제 활성을 측정하고, 자외선(UVB)으로부터 피부섬유아세포 보호효과에 미치는 영향을 확인하기위해 실험을 실시 하였다. 당나귀 사골은 고온고압기(121℃, 1.5kgf/cm²)에서 1시간 동안 1, 2, 3차 추출하여 혼합 후 동결건조 하여 사용하였다. 동결 건조된 당나귀 사골 추출물은 FoodPro alkaline protease(A), Protease P(P), Protease M(M) 그리고 FoodPro alkaline protease+Protease P+Protease M(APM) 혼합효소를 1% 첨 가하고 45℃에서 3시간 효소분해 하였다. 효소분해 후 3 kDa 이하로 분리하여 항산화 활성, elastase 및 collagenase 억제 활성 그리고 세포 보호효과를 측정하였다. 가수분해 도는 유의적인 차이를 보이지 않았으며, DPPH와 ABTS 라 디칼 소거능, FRAP은 LHDB-A와 M이 다른 처리구에 비 해 유의적으로 높은 수치를 나타내었다. ORAC활성은 LHDB-M이 다른 처리구에 비해 가장 높은 활성을 보였다.

Elastase, collagenase 억제 효과를 측정한 결과 LHDB-M이 각각 37.49, 64.84%로 가장 높은 억제 효과를 나타내었다.

항산화 활성과 elastase와 collagenase 억제 활성이 가장 높 았던 LHDB-M을 선택하여 분자량 분포를 MALDI-TOF를 이용하여 측정하고, 피부섬유아세포를 이용하여 세포독성 과 자외선 조사 후 세포생존율을 측정한 결과 LHDB-M은 3kDa 이하의 여러 가지 펩타이드로 구성되었으며, 세포독 성은 모든 농도에서 유의적인 차이를 보이지 않아 세포독 성을 나타내지 않았다. 또한 피부섬유아세포에 자외선 (UVB)을 100mJ/cm²로 조사한 후 LHDB-M을 농도별로 처 리한 결과, 자외선만을 조사한 대조구보다 모든 농도에서 유의적으로 세포생존율이 증가하여 세포 보호효과를 나타 내었다. 따라서 본 연구결과, 당나귀 사골 추출물을 Protease M 효소를 이용하여 얻은 3kDa 이하의 저분자 효 소분해물(LHDB-M)은 항산화 활성 및 피부 주름 억제 효 과를 보여, 피부 건강증신 식품소재로 이용될 수 있을 것 으로 사료되나 in vivo 실험을 통한 추가실험이 진행되어야 할 것으로 판단된다.

사사

본 연구는 2016년도 강원대학교 대학회계 학술연구조성

비로 연구하였음(관리번호-520160451).

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(Received 01 April 2019, Revised 27 May 2019, Accepted 03 June 2019)