47(1), 7～14(2018) https://doi.org/10.3746/jkfn.2018.47.1.007
물레나물(Hypericum ascyron L.) 추출물의 생리활성 효소 억제 효과
이은호1․김명욱2․강인규3․박경일4․조영제1
1경북대학교 식품공학부/식품생물산업연구소, 2경북해양바이오산업연구원
3경북대학교 원예과학과, 4영남대학교 생명응용과학대학 원예생명과학과
Inhibitory Activities of Extracts from Hypericum ascyron L.
on Biological Enzymes
Eun-Ho Lee1, Myung-Uk Kim2, In-Kyu Kang3, Kyeung-Il Park4, and Young-Je Cho1
1School of Food Science & Biotechnology/Food & Bio-Industry Research Institute and
3Department of Horticultural Science, Kyungpook National University
2Gyeongbuk Institute for Marin Bio-industry
4Department of Horticulture & Life Science, Yeungnam University
ABSTRACT This study was designed to assess the anti-oxidation and biological activities of extracts from Hypericum ascyron L.. The contents of phenolic compounds in water and 90% ethanol extracts from H. ascyron L. were 29.75 and 31.82 mg/g, respectively. The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical scavenging and 2,2’-azino-bis(3-ethylben- zothiazoline-6-sulfonic acid) radical decolorization activities of water and ethanol extracts were 86.90% and 91.71%
as well as 90.45% and 98.05% at a phenolic content of 100 µg/mL, respectively. The antioxidant protection factor (PF) values of water and ethanol extracts at a phenolic content of 50 µg/mL were 2.11 PF and 2.22 PF, respectively.
Thiobarbituric acid reactive substance values were 81.75% in water extract and 93.67% in ethanol extract at a phenolic content of 200 µg/mL. The inhibitory activities against α-glucosidase were 43.47% in water extract and 100.00%
in ethanol extract at a phenolic content of 200 µg/mL. The inhibitory activities against xanthine oxidase in water and ethanol extracts were 49.52% and 85.30% at a phenolic content of 200 µg/mL, respectively. Tyrosinase inhibitory activities as a measure of whitening activity in ethanol extracts were 89.59% at a phenolic content of 200 µg/mL, respectively. The collagenase and elastase inhibitory activities as a measure of anti-wrinkle activity were 84.76% and not detected in water extract as well as 98.46% and 75.59% in ethanol extract at a phenolic content of 200 µg/mL, respectively. Astringent effect as a measure of pore tightening activity of the ethanol extracts were 88.23% at a phenolic content of 200 µg/mL, respectively. The results show that extracts from H. ascyron L. can be used as a functional resource with antioxidant, carbohydrate degradation inhibitory, anti-gout, whitening, anti-wrinkle, and pore tightening activities.
Key words: biological activities, extracts, phenolic compounds, Hypericum ascyron L.
Received 11 September 2017; Accepted 18 December 2017 Corresponding author: Young-Je Cho, School of Food Science and Biotechnology/Food and Bio-Industry Research Institute, Kyungpook National University, Daegu 41566, Korea
E-mail: [email protected], Phone: +82-53-950-7755
서 론
노화를 촉진하는 원인들은 여러 가지가 있으나 그중에서 도 활성산소계(reactive oxygen species, ROS)가 상당히 주요한 원인 중 하나인 것으로 받아들여지고 있다. 이러한 활성산소는 에너지 대사과정, 면역 반응 등에서 필수 불가결 하게 생성되며, 외부의 유해 환경에 의해서도 유발되는 피할 수 없는 자극이다. 활성산소는 반응성이 매우 커서 체내에서 DNA 변성, 과도한 신호전달 유발 및 단백질 변성 등을 초래
하여 건강에 해로운 영향을 누적하는 일련의 반응을 일으키 게 된다. 이러한 유해한 반응들은 생체 내에 존재하는 항산 화 물질(uric acid, 비타민 C, 비타민 E 등) 또는 항산화 효소 (glutathione peroxidase, superoxide dismutase, cata- lase 등)에 의해 정교하게 그 항상성을 유지하도록 되어 있 다(1). 현재 항산화제로 알려진 대부분은 채소류, 과일 및 생약재 등과 같은 식물 소재로 활성을 나타내는 주요 물질은 식물체에 다량 함유된 2차 대사산물인 페놀화합물로 밝혀져 있다(2). 특히 생약재는 과일이나 채소류보다 약리효과가 우 수하여 음료 및 가공식품의 주원료 또는 부재료로 활용되며, 질병의 예방이나 치료, 건강 유지 등의 생체 기능 증강을 위한 소재로 다양하게 이용되고 있다(3). 식물류로부터 항산 화 활성 연구는 오래전부터 수행되어 왔으며, 유사한 기작에 의해 생체 방어, 면역 기능을 조절함으로써 질병 예방이나
노화 지연 등의 효능이 발휘되는 것으로 알려져 있다(4). 한 편 식물류의 유효 생리활성 물질은 단일 식품보다 여러 식품 이 혼합될 경우 그 효과가 상승하므로(5), 생리활성이 높은 식물류의 다양한 혼합 과정은 기능성 소재로서의 활용도를 높일 수 있을 것으로 판단된다.
물레나물(Hypericum ascyron L.)은 물레나물과의 다년 초로 전초를 홍한련 또는 대련교라고도 하며, 그 밖에도 대 황심초, 방심초, 일지전 등의 여러 가지 이명이 있다. 물레나 물은 우리나라 각지의 산기슭, 산골짜기 도랑가, 양지바르면 서도 비교적 습기가 많은 땅과 같은 환경에서 주로 자라며, 세계적으로는 중국(동북, 화북), 시베리아, 몽골, 일본 등에 분포되어 있다(6). 우리나라에서 자생하고 있는 것으로 알려 진 Hypericum 속 식물은 모두 10여 종이며, 이 중 물레나물 (H. ascyron L.), 고추나물(Hypericum erectum), 애기고 추나물(Hypericum japonicum) 등의 전초를 약용으로 사용 하고 있다. 특히 물레나물은 전초를 홍한련이라 하여 민간에 서는 평간, 지혈, 패독, 소종의 효능이 있고 두통, 토혈, 타박 상을 치료한다고 알려져 있다. 또한, 중국에서는 물레나물과 같은 Hypericum 속 식물인 서양고추나물(Hypericum per- foratum)을 관엽연교라 하여 청열, 해독, 수렴, 지혈의 목적 으로 토혈, 외상출혈, 객혈, 종독 등의 치료에 사용되고 있으 며(7), 서양에서는 서양고추나물을 고대부터 우울증을 비롯 하여 여러 질병을 치료하는 약초로 쓰여 왔고 현재에도 우울 증 환자를 위한 치료에 이용되고 있다(8). 항생제에 내성이 생긴 여러 가지 염증성 질병에도 탁월한 치료 효과가 있다고 알려졌지만, 사람이 이 식물을 과다 섭취할 경우 피부염을 일으킬 염려가 있다는 부작용도 보고된 바 있다(9). 물레나 물의 주요성분으로는 flavonoid, xanthone, triterpene이 보고되었으나 우리나라에서는 현재까지 물레나물의 성분 및 활성에 대한 연구는 전혀 되어 있지 않으며, 단지 고추나 물로부터 항산화 flavonoid 성분들이 분리되었다는 보고만 있을 뿐이다(10). Lavie 등(11)의 보고에 의하면 Hyperi- cum 속 식물인 Hypericum triquetrifolium으로부터 얻은 hypericin과 pseudohypericin 성분이 탁월한 항바이러스 작용을 나타낸다고 보고하였을 뿐만 아니라 이의 유효 농도 에서는 독성이 아주 약하여 사람을 대상으로 한 임상시험을 보고한 바 있으며, 이 성분은 국내에서도 암세포주에 대한 항암작용이 뛰어나고, 특히 백혈구 세포주에 대한 선택성이 우수한 것으로 보고된 바 있다(12). 국내에서도 고추나물에 대한 성분 실험을 실시한 결과 서양고추나물 못지않게 hy- pericin 성분이 많다고 밝혀졌으며, 또한 이 성분의 항산화 효과에 대해서도 보고된 바 있다(13).
따라서 본 연구에서는 Hypericum 속 식물인 물레나물로 부터 phenolic compounds를 추출하여 기능성 소재로 이용 하기 위한 기초자료로 이용하고자 생리활성 효과를 측정하 여 활용 가능성을 알아보았다.
재료 및 방법
실험재료
본 연구에서 사용된 물레나물은 2016년 대구 팔공산 인 근 고산지대에서 직접 채취하여 이물질을 제거한 후 45°C dry oven(FO600M, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 건조 시켜 40 mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
물레나물 추출물의 제조
생리활성 측정을 위한 추출물의 제조는 물 추출물의 경우 물레나물 건조 분말 1 g을 증류수 200 mL에 침지하여 추출 물이 100 mL가 될 때까지 가열한 후 냉각하여 24시간 동안 교반 추출하였으며, 에탄올 추출물의 경우에는 에탄올(10~
100%)을 사용하여 물레나물 건조 분말 1 g에 에탄올 100 mL를 첨가하여 4°C의 shaking incubator에서 24시간 동안 교반 추출하였다. 용매별 추출물의 경우에는 에탄올, 메탄 올, 아세톤, 부탄올(100%)을 사용하여 물레나물 건조 분말 1 g에 각각의 용매를 100 mL를 첨가하여 교반 추출하였다.
각 추출물은 Whatman No. 1 filter paper(Whatman Inc., Piscataway, NJ, USA)로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator(Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축 하여 4°C sample 보관 냉장고에서 저온 보관하며 시료로 사용하였다.
총 페놀 함량
총 페놀 함량은 추출물 1 mL에 95% 에탄올 1 mL와 증류 수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu reagent 0.5 mL 를 잘 섞어 5분간 방치한 후 Na2CO3 1 mL를 가하여 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하여 mg gallic acid equiv- alent(GAE mg/g)로 나타내었다(14).
항산화 효과 측정
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 소거 활성은 Blois(15)의 방법에 따라 측정하였으며, 전자공 여능(%)은 [1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100 으로 나타내었다. 2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid) radical cation decolorization(ABTS)의 측정은 Fellegrini 등(16)의 방법에 따라 측정하였고, 저해 율(%)은 [1－(반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100으 로 나타내었다. Antioxidant protection factor(PF)는 An- darwulan과 Shetty(17)의 방법에 따라 측정하였으며, PF 는 반응구의 흡광도/대조구의 비로 나타내었다. Thiobar- bituric acid reactive substance(TBARS) 측정은 Buege 와 Aust(18)의 방법에 따라 측정하였다.
α-Glucosidase 저해 효과 측정
α-Glucosidase 저해 효과 측정은 Tibbot과 Skadsen
(19)의 방법에 따라 측정하였다. 50 mM sodium succinate buffer(pH 6.8)에 p-nitrophenol-α-D-glucopyranoside (PNPG)를 용해시켜 1 mg/mL 농도로 기질을 만들고, 기질 2 mL와 효소액 0.1 mL를 혼합하여 반응구에는 시료 0.1 mL, 대조구에는 증류수 0.1 mL를 넣어 37°C에서 30분간 반응시킨 후 반응종료시약 5% Na2CO3를 첨가하였다. 이때 생성된 p-nitrophenol을 흡광도 470 nm에서 측정한 후 표 준곡선에 대입하여 양을 환산하였다.
Xanthine oxidase(XOase) 저해 효과 측정
XOase 저해 효과 측정은 Stirpe와 della Corte(20)의 방 법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5)에 녹인 기질액 2 mM xanthine 3 mL에 효소액(0.05 U/0.1 mL) 0.1 mL와 시료 0.3 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수를 0.3 mL 첨가하여 37
°C에서 5분간 반응시키고 종료시약 20% trichloroacetic acid 1 mL를 가한 후 반응액을 원심분리 하여 단백질을 제 거하였다. 생성된 uric acid를 흡광도 292 nm에서 측정하였 다.
Tyrosinase 저해 효과 측정
Tyrosinase 저해 효과 측정은 Hearing(21)의 방법에 따 라 측정하였다. 반응구는 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 2.3 mL와 기질액 1.5 mM L-tyrosine 용액 0.4 mL의 혼합액에 mushroom tyrosinase(250 U/mL; Sigma- Aldrich Co., Louis, MO, USA) 0.1 mL와 시료 0.2 mL를 넣고 대조구에는 시료 대신 증류수를 0.2 mL를 첨가하여 37°C에서 20분간 반응시켰다. 반응액은 흡광도 475 nm에 서 측정하여 저해율(%)은 [1－(시료의 absorbance/대조구 의 absorbance)]×100으로 계산하였다.
Collagenase 및 elastase 저해 효과 측정
Collagenase 저해 효과 측정은 Wunsch와 Heidrich(22) 의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4 mM CaCl2를 첨가하여 4-phenylazo- benzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(0.3 mg/
mL)를 녹인 기질액 0.25 mL 및 시료용액 0.1 mL의 혼합액 에 0.2 mg/mL collagenase(Sigma-Aldrich Co.) 0.15 mL 를 첨가하였다. 대조구에는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨 가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% citric acid 0.5 mL 를 넣어 반응을 정지시킨 다음, 에틸아세테이트 2 mL를 첨 가하여 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. Elastase 저해 효과 측정은 Kraunsoe 등(23)의 방법에 따라 측정하였다.
반응구는 0.2 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 1 mL에 기질액 0.8 mM N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide 용액 0.1 mL 의 혼합액에 1.0 U/mL porcine pancreatic elastase(PPE;
Sigma-Aldrich Co.) 효소용액 0.1 mL와 시료 0.1 mL를 넣 고 대조구에는 시료 대신 증류수 0.1 mL를 첨가하여 37°C
에서 20분간 반응시켜 p-nitroaniline 생성량을 흡광도 410 nm에서 측정하였다.
수렴 효과 측정
Astringent 활성은 Lee 등(24)의 방법에 따라 측정하였 다. 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용 하여 원심분리 용기에 각각의 시료와 헤모글로빈 용액을 1:
1로 넣어서 진탕 혼합한 다음 2,000 rpm에서 원심분리 후 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 증 류수를 넣어 반응시켰다.
통계처리
모든 실험은 6회 이상 반복 측정하였고 자료의 통계처리 는 SPSS 23 for windows(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균±
표준편차(mean±standard deviation)로 표시하였고 분산 분석 Duncan’s multiple range test, one-way ANOVA를 실시하여 시료 간의 유의차를 P<0.05 수준으로 비교 분석하 였다.
결과 및 고찰
물레나물 추출물의 페놀 함량 측정
추출은 각 용매의 특성에 따라 시료에 함유된 생리활성 물질 및 기능성 물질을 분리하는 방법이며, 추출 시 사용되 는 용매의 설정은 생리활성 실험 전 단계에 중요한 영향을 미친다. 순수한 증류수를 이용한 열수 추출은 용매에 대한 유해성의 문제가 없고 수율이 높으며, 수용성 물질 추출에 많이 이용되고 있고, 극성 용매인 에탄올 추출의 경우 추출 후 정제가 쉬우며, 식물체의 타닌, 사포닌, organic acid 등 다양한 유용성분 추출에 주로 이용되고 있다(25). 식물체의 생리활성 물질로 알려진 페놀화합물 함량을 추출 용매별로 측정한 결과 Fig. 1A에서와 같이 메탄올, 물, 에탄올, 부탄 올, 아세톤 순으로 31.33, 29.75, 28.53, 11.11, 8.24 mg/g 의 총 페놀 함량을 나타내었다. 또한, 메탄올, 물, 에탄올을 추출 용매로 사용하였을 때 매우 높은 추출 수율을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 추후 진행될 생리활성 실험을 통하 여 물레나물 추출물을 미용식품, 건강기능식품 산업에 적용 가능한 소재로 개발하기 위하여 물, 에탄올을 추출 용매로 선정하여 진행하였다. 유기용매인 에탄올의 최적 추출 조건 을 찾기 위하여 농도를 0~100%로 설정하여 페놀화합물 함 량을 측정한 결과 Fig. 1B에서와 같이 90% 에탄올 추출물 에서 31.82 mg/g으로 총 페놀 함량이 가장 높은 추출 수율 을 나타내어 최적 추출 조건으로 확립하였다. 위의 결과에 따라 물, 90% 에탄올로 추출한 추출물을 실험의 재현성을 위해 페놀 함량을 50~200 μg/mL로 조절하여 항산화 효과, 미용 및 건강기능식품 활성을 검증하였다.
0 10 20 30 40 50
Water Ethanol Methanol Acetone Butanol Solvent
Contents of phenolics (mg/g) .
d c e
a b
A
0
10 20 30 40 50
W 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentration of ethanol (%)
Contents of phenolics (mg/g) .
b
c d
d
a
de e ef f f
c
B
Fig. 1. The content of phenolic in extracts on various solvents (A) and ethanol concentration (B) from Hypericum ascyron L..
Means with different letters (a-f) above the bars are significantly different at P<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.
물레나물 추출물의 항산화 효과
항산화물질은 체내의 세포 내에서 해로운 반응을 일으키 는 free radical이 DNA를 공격하거나 지질을 산화시키기 전에 그들을 중화시켜 버린다(26). 따라서 항산화제는 인류 가 현재 관심을 집중하는 기능성 혹은 생리활성 물질의 하나 로서 식품의 변질을 방지하고 인체에서의 노화 방지, 성인병 예방 등의 기능을 할 수 있는 물질로 알려져 있다(27). 항산 화제는 반응성이 높아 체내 유해물질과 반응하여 세포 내 주요 물질들이 활성산소에 의한 연쇄반응을 막아 주어 세포 를 보호하는 역할을 한다. 다행히 체내에는 항산화 효소계인 superoxide dismutase(SOD), catalase, glutathione per- oxidase(GSH-Px), glutathione S-transferase(GST) 등 이 존재하며, 저분자로 항산화제 혹은 free radical scav- enger 역할을 하는 항산화 물질인 비타민 C, 비타민 E, β- carotene, carotenoids, flavonoids, 그리고 selenium을 비 롯한 몇 가지 무기질 등이 인체를 보호하는 것으로 알려져 있다(28). 물레나물 추출물의 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 2A에서와 같이 물레나물 물, 에탄올 추출물의 50, 100, 150, 200 μg/mL phenolic 농도에서 각각 농도 의존적으로 83.91, 86.90, 87.98, 88.64%와 90.71, 91.71, 91.63, 91.29%의 우수한 라디칼 소거능을 나타내었다. 물레나물 추출물을 이용하여 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 Fig. 2B에서와 같이 물레나물 물, 에탄올 추출물 모두 100 μg/mL phenolic 농도 에서 90% 이상인 90.45, 98.05%의 매우 높은 라디칼 소거 능을 나타내었으며, 수용성 항산화능을 나타내는 DPPH, ABTS 라디칼 소거능에서 매우 높은 활성을 확인하였다. 11 개의 이중 결합으로 구성되어 있어 높은 불포화 성질을 가지 고 있는 β-carotene은 peroxyl radical과 매우 쉽게 반응하 는데 불포화된 탄소 중 하나에 선택적 연쇄 절단되어 항산화 제로서 작용하는 성질을 이용하여 지용성 항산화능을 나타 내는 PF를 측정한 결과, Fig. 2C에서와 같이 물레나물 물, 에탄올 추출물의 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 각각 2.11~2.37 PF, 2.22~2.42 PF를 나타내어 positive con- trol로 사용한 BHT와 유사한 활성을 나타내었다. 물레나물
추출물을 이용하여 또 다른 지용성 항산화능을 나타내는 TBARS를 측정한 결과 Fig. 2D에서와 같이 물 추출물에서 는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 40.52~81.75%의 활성을 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 69.35~93.67%의 활성을 나타내었다.
따라서 물레나물 물, 에탄올 추출물 모두 수용성, 지용성 항 산화능에 매우 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으 며, positive control로 사용한 합성항산화제인 BHT와 유 사하거나 더 높은 활성을 나타내어 물레나물 추출물을 저분 자로 항산화제 혹은 free radical scavenger 역할을 하는 항산화 물질로 사용 가능성을 확인하였다.
물레나물 추출물의 α-glucosidase 저해 효과
당뇨병은 인슐린 의존형인 1형과 인슐린 비의존형 2형 당뇨로 나눌 수 있으며, 현재 전체 당뇨병 환자의 90% 정도 가 제2형 당뇨병에 해당한다고 조사되고 있다(29). 2형 당 뇨병의 치료는 주로 약물을 이용하여 혈당을 강하시키는 혈 당강하제를 사용한다. 식이를 통하여 흡수된 탄수화물을 단 당류로 분해시키는 작용을 하는 효소인 α-glucosidase는 체내로 흡수된 탄수화물 분해를 소장에서 억제하여 급격한 혈당의 상승을 막는 방법이다(30). 체내에 흡수된 탄수화물 을 분해하여 당뇨병에 영향을 줄 수 있는 효소인 α-gluco- sidase의 저해 효과를 측정한 결과 Fig. 3A에서와 같이 물 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 2.31~
43.47%의 저해 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 46.39~100.00%의 저 해 효과를 나타내었다. Positive control로 사용한 epi- gallocatechin gallate(EGCG)와 경구용 혈당강하제로 개발 하여 시판 중인 acarbose, 1-deoxynojirimycin, voglibose 등은 설사와 변비 등의 부작용이 있고 동시에 α-glucosi- dase의 완전 저해를 통해 당의 흡수율을 떨어뜨려 저혈당을 유발시키는 문제점이 있다(31). 이러한 이유로 인해 천연 식물 자원에서 새로운 혈당강하제의 개발이 절실히 필요한 실정인데 물레나물 물 추출물에서는 비교적 높지 않은 저해 효과를 나타내었지만, 에탄올 추출물에서는 100%의 매우
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
DPPH (%) .
Water extract Ethanol extract BHT
a a
a
b a
b
c a c
c a d
A
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL) ABTS radical decolorization (%) . Water extract
Ethanol extract BHT
a a
a
b b
b
c c
c
d c d
B
0 1 2 3
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Antioxidant protection factor (PF) . Water extract Ethanol extract BHT
a a a
b b
b c b c d c d
C
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
TBARS (%) .
Water extract Ethanol extract BHT
a a
a
b b
a
c bc a
d c a
D
Fig. 2. Antioxidant activity of water and ethanol extracts from Hypericum ascyron L.. (A) DPPH, (B) ABTS, (C) PF, (D) TBARS.
Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.
0 20 40 60 80 100
1 2 3 4
Phenolic content (μg/mL)
α-Glucosidase inhibition (%) .
Water extract Ethanol extract EGCG
a
b b
c a
d a
a
a a c c
A
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Xanthine oxidase inhibition (%) .
Water extract Ethanol extract Allopurinol
a
b
c c
a b
c
d
a
b bc c
B
Fig. 3. Inhibitory activity of water and ethanol extracts on α-glucosidase (A) and xanthine oxidase (B) from Hypericum ascyron L..
Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.
높은 저해 효과를 나타내어 시판 중인 혈당강하제와 비교하 였을 때 물레나물 추출물의 효능의 우수함을 확인하였으며, 부작용이 없는 천연물 소재의 α-glucosidase 저해제로 개 발 가능하다고 판단되었다.
물레나물 추출물의 XOase 저해 효과
Adenosine은 adenosine deaminase에 의해 IMP(inosine) 가 되고 IMP는 hypoxanthine과 D-ribose로 가수분해된 다. 이 hypoxanthine이 XOase에 의해 산화되어 xanthine 을 거쳐 uric acid가 된다. GMP 또한 가수분해되어 nucleo- side guanosine이 된 후 잘라져 free guanine이 형성되면
amino group이 가수분해에 의해 제거되어 xanthine이 된 후 XOase에 의해 uric acid가 된다(32). 체내에서 과도하게 생성된 uric acid가 배출되지 못하고 골절에 축적되면 심한 통증을 유발하는 통풍과 신장질환을 일으키며, 생물조직에 산화적 손상을 일으켜 염증, 동맥경화, 암 및 노화와 같은 여러 가지 질병을 일으킬 수 있는 superoxide radical을 생 성한다(33). Uric acid를 생성하여 통풍과 산화적 손상을 일으키는 XOase에 대한 물레나물 추출물의 저해 효과를 측 정한 결과 Fig. 3B에서와 같이 물 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 29.80~49.52%의 저해 효과를 나타내었고, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL phe-
0 20 40 60 80 100
1 2 3 4
Phenolic content (μg/mL)
Tyrosinase inhibition (%) .
Water extract Ethanol extract Kojic acid
a
b
b
bc
c
c d a
A
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Collagenase inhibition (%) .
Water extract Ethanol extract EGCG
a a a
b b
b c
b
c d
b c
B
0 20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Elastase inhibition (%) .
Water extract Ethanol extract EGCG
a
a b
b c c
d d
C
0
20 40 60 80 100
50 100 150 200
Phenolic content (μg/mL)
Astringent effect (%) .
Water extract Ethanol extract Tannic acid
a
b a
c
b c
d
a
D
Fig. 4. Inhibitory activity of water and ethanol extracts on tyrosinase (A), collagenase (B), elastase (C), and astringent (D) from Hypericum ascyron L.. Water extract has not shown activity on tyrosinase, elastase, and astringent. Means with different letters (a-d) above the bars are significantly different at P<0.05 by a Duncan’s multiple range tests.
nolic 농도에서 53.83~85.30%의 저해 효과를 나타내었다.
Positive control로 사용한 allopurinol은 1966년 미국에서 의료용 약물로 사용 허가되어 지금까지 고혈압 요산 수치 조절, 통풍 요산 수치 조절 등의 목적으로 사용되고 있지만, 가려움, 발진, 구토, 신장 문제 등의 부작용으로 인해 끊임없 이 부작용에 대한 문제점이 제기되어 왔다. 따라서 물레나물 추출물의 XOase 저해 효과가 allopurinol보다 높은 효능을 나타내어 체내에서 핵산계 물질에 의한 uric acid 생성량을 낮추어주는 역할을 수행할 수 있을 것으로 판단되었다.
물레나물 추출물의 tyrosinase 저해 효과
멜라닌(melanin)은 여러 동물의 피부나 눈 등의 조직에 존재하는 흑색 또는 갈색 색소를 총칭한다. 특히 멜라닌은 사람의 피부색을 결정하는 중요한 요소로써 인종에 따라서 멜라닌 발현 유전자가 다르고, 이에 따라 멜라닌 세포의 양 이 조절되어 피부색이 결정된다(34). 피부에서 멜라닌의 기 능은 자외선 차단 기능으로서 피부의 체온을 유지해주고 자 외선으로부터 피부를 보호해 주지만, 과도한 멜라닌 생성은 기미, 주근깨, 피부 반점 형성에 원인이 되며, 더 나아가 피부 암 유발에 기여한다(35). 현재 화장품 분야에는 이러한 멜라 닌 형성과정의 불균형으로 인한 색소 침착을 막기 위하여 tyrosinase 억제를 target으로 하는 물질들을 개발 중이며 대표적으로 kojic acid를 들 수 있다. 멜라닌 형성과정의 불
균형으로 인한 색소 침착을 일으키는 tyrosinase 저해 효과 를 측정한 결과 Fig. 4A에서와 같이 물 추출물에서는 저해 효과가 나타나지 않았고, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/
mL phenolic 농도에서 62.56~89.59%의 저해 효과를 나타 내었다. Positive control로 사용한 kojic acid는 미백성분 으로서 그 탁월함이 인정되어 화장품에 지속해서 사용되어 왔다. 물레나물 에탄올 추출물에서 kojic acid보다 높은 ty- rosinase 저해 효과를 나타내어 tyrosinase 저해제 또는 화 장품 첨가물로 사용 가능성을 확인하였다.
물레나물 추출물의 collagenase 및 elastase 저해 효과 자외선에 의해 세포 사이를 채우는 성분인 교원질과 탄력 질의 합성이 감소하게 되면 다양한 기질 단백질 분해 효소이 자 피부 노화의 주원인인 collagenase와 elastase가 활성화 되게 된다. 피부 진피층의 90% 이상으로 구성되어 있는 col- lagen과 3~4% 정도를 차지하고 있는 elastin을 분해하는 효소를 저해시켜서 주름과 같은 피부 노화를 억제할 수 있다 (36). 피부 진피층을 구성하는 collagen을 분해하여 피부 주름을 생성시키는 효소인 collagenase의 저해 효과를 측정 한 결과 Fig. 4B에서와 같이 물 추출물에서는 50~200 μg/
mL phenolic 농도에서 28.53~84.76%의 저해 효과를 나타 내었으며, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 65.17~98.46%의 저해 효과를 나타내었다. 구조
단백질인 elastin은 피부 노화가 진행됨에 따라 생성량이 감소하고, 피부 노화 정도에 따라 type-1 collagenase의 생합성이 증가하여 진피 내 교원섬유 및 탄력섬유와 같은 기질 단백질의 분해를 유도하여 피부탄력을 떨어뜨리고 피 부 주름의 생성을 야기한다(37). 인체의 중성구 과립구 내에 존재하는 elastase는 피부탄력성 섬유(elastin)를 분해하는 효소로 elastase의 저해는 피부 주름의 개선을 의미한다 (38). 인체의 피부탄력을 유지해주는 elastin을 분해하여 피 부 주름을 생성시키는 효소인 elastase의 저해 효과를 측정 한 결과 Fig. 4C에서와 같이 물 추출물에서는 저해 효과가 나타나지 않았고, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 47.98~75.59%의 저해 효과를 나타내 었다. 물레나물 에탄올 추출물은 collagenase와 elastase 저해 효과 실험에서 positive control로 사용한 EGCG보다 높은 저해 효과를 나타내어 피부 노화를 억제할 수 있는 기 능성 소재로 개발 가능성을 확인하였다.
물레나물 추출물의 astringent 효과
향장제품의 피부에 대한 수렴작용으로는 화학적 수렴작 용과 물리적 수렴작용의 두 가지로 구분이 되는데 화학적 수렴작용은 타닌과 같이 단백질 응고작용을 하는 물질에 의 해 과잉의 피지나 땀의 분비를 억제하여 땀샘과 모공이 일시 적으로 수축되는 작용을 말하는 반면, 물리적 수렴작용은 차가운 물을 피부에 사용하거나 에탄올의 휘발로 피부 온도 를 저하시켜 땀샘과 모공을 일시적으로 수축시키는 것을 말 한다. 화장품에 있어서 수렴제는 얼굴 부위에 확대된 모공을 수축시키는 기능을 하여 일시적으로 탄력과 당김을 주어 감 각적인 만족감과 더불어 화장을 잘 받게 해주는 기능 등으로 피부를 긴장시켜 정돈하기 위해 사용된다. 또, 각질층에 수 분, 보습성분을 보유하는 것 외에 수렴작용과 피지분비 억제 작용을 하며 산뜻한 사용감을 가지고, 화장의 지워짐을 방지 하여 주는 기능이 있다. 즉 일시적으로 피부 단백질을 끌어 당기고 과잉의 피지나 땀의 분비를 억제하는 작용이 있는 것으로 지성피부의 사람과 여름철에 많이 쓰인다(39). 물레 나물 추출물을 이용하여 피부에 대한 수렴작용을 나타내는 astringent 효과를 측정한 결과 Fig. 4D에서와 같이 물 추출 물에서는 효과가 나타나지 않았고, 에탄올 추출물에서는 50~200 μg/mL phenolic 농도에서 9.26~88.23%의 효과 를 나타내었다. 또한, 물레나물 에탄올 추출물 150~200 μg /mL phenolic 농도에서 positive control로 사용한 타닌산 보다 높은 astringent 효과를 나타내어 화학적 수렴작용 효 과가 우수한 것을 확인하였다.
요 약
본 연구는 물레나물(Hypericum ascyron L.) 추출물을 사 용하여 항산화, 미용식품 및 기능성식품 활성 등의 생리활성 효능을 평가하였다. 물레나물로부터 phenolic 화합물을 추
출하기 위하여 물과 90% 에탄올로 추출하였을 때 각각 29.75, 31.82 mg/g의 페놀 함량을 나타내었다. 물레나물 추출물의 DPPH, ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과 물과 에탄올 추출물 100 μg/mL phenolic 농도에서 각각 86.90, 91.71%의 DPPH 전자공여능과 90.45, 98.05%의 ABTS 전자공여능을 나타내었다. Antioxidant protection fac- tor(PF)는 물과 에탄올 추출물 50 μg/mL phenolics 농도에 서 각각 2.11, 2.22 PF를 나타내었다. TBARS는 200 μg/
mL phenolics 농도에서 물 추출물은 81.75%, 에탄올 추출 물은 93.67%의 높은 항산화능을 나타내었다. α-Glucosi- dase 저해 효과를 측정한 결과 200 μg/mL phenolics 농도 에서 물 추출물은 43.47%, 에탄올 추출물은 100.00%의 매 우 높은 저해 효과를 나타내었다. Xanthine oxidase 저해 효과를 측정한 결과 물과 에탄올 추출물 200 μg/mL phe- nolics 농도에서 각각 49.52, 85.30%의 저해 효과를 나타내 었다. 미백 효과를 측정하는 tyrosinase 저해 효과를 측정한 결과 에탄올 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서만 89.59%의 저해 효과를 나타내었다. 주름개선 효과를 측정 하는 collagenase, elastase 저해 효과를 측정한 결과 물 추출물에서는 200 μg/mL phenolics 농도에서 collage- nase 저해 효과 측정에서만 84.76%의 저해 효과를 나타내 었고, 에탄올 추출물에서는 200 μg/mL phenolics 농도에서 각각 98.46, 75.59%의 저해 효과를 나타내었다. 수렴 효과 를 측정하는 astringent 효과를 측정한 결과 에탄올 추출물 200 μg/mL phenolics 농도에서만 88.23%의 astringent 효 과를 나타내었다. 위의 결과에 따라 물레나물 추출물의 항산 화, 당분해 억제, 항통풍, 미백, 주름개선 및 수렴 효과를 확인하였고, 기능성 소재로 이용 가능하다고 판단되었다.
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