Study on the Chemopreventive Mechanism of Selenium in Terms of the Activation of p53 Tumor Suppressor and PTEN

256 책임저자：서영록, 󰂕 130-701, 서울특별시 동대문구 회기동 1

경희대학교 의과대학 약리학교실, 기초의과학연구소 Tel: 02-961-0674, Fax: 02-963-0674

E-mail: [email protected]

접수일：2007년 10월 31일, 게재승인일：2007년 12월 14일

Correspondence to：Young Rok Seo

Department of Pharmacology, Biomedical Science Institute, College of Medicine, Kyung Hee University, 1, Heogi-dong, Dongdaemun-gu, Seoul 130-701, Korea

Tel: +82-2-961-0674, Fax: +82-2-2-963-0674 E-mail: [email protected]

항종양 인자 p53 및 PTEN의 활성화를 중심으로 하는 항산화제 셀레늄의 암 예방 기전 연구

경희대학교 의과대학 약리학교실 기초의과학과 정화진ㆍ서영록

Study on the Chemopreventive Mechanism of Selenium in Terms of the Activation of p53 Tumor Suppressor and PTEN

Hwa Jin Jung and Young Rok Seo

Department of Pharmacology, Biomedical Science Institute, College of Medicine, Kyung Hee University, Seoul 130-701, Korea

Selenomethionine (SeMet) has been identified as one of the organic selenium compounds although the mechanism of chemopreventive action of SeMet was not clear yet. In our previous study, we suggested that p53 might be involved in chmopreventive effect of SeMet. Here, we investigated the implication of the p53 modulated by redox signal in response to SeMet in cancer prevention. We confirmed that the p53 accumulation was significantly increased in response to SeMet as dose-dependent manner. In addition, the differential localization of p53 protein was observed in nucleolus contrast with in redox factor 1 (Ref-1)-dominant negative cells indicating that p53 function for genomic stability might be modulated by redox signaling. On the other hand, PTEN known as a tumor suppressor with the inhibition of PI3K/Akt signaling pathway has no significant differences in the presence with SeMet suggesting that the chemopreventive mechanism of SeMet might be on PTEN-independent pathway. In our study, we suggested that p53 activation and localization in nucleolus might be a distinct cellular pathway of SeMet as one of the chemopreventive compounds. (Cancer Prev Res 12, 256-260, 2007)

Key Words: p53, PTEN, Selenomethionine

서 론

셀레늄은 지금까지 잠제적 암 예방 물질로서 암을 억 제하는 것으로 보고 되어 오면서, 여러 가지 유, 무기 셀 레늄 화합물들의 암 억제에 대한 화학예방학적 특성이 스크리닝 되었다.

그중에서도 특히 selenomethionine (SeMet)은 식용 셀레늄의 주요 성분으로서 미국 식약청 에서 권고하는 일일 권장량(recommended daily allowance, RDA)을 하루 50μg으로 정해 필수 영양소로 지정하고

있다(National Academy of Sciences, 1989). 실제 동물에 유 도된 종양 모델을 이용한 많은 연구가 이미 진행되었고 이러한 연구의 결과들은 화학예방 효과를 나타내는 활 성화 상태의 selenium species로 셀레늄의 대사체 중 하나 인 methylselenol을 보고하고 있다.

뿐만 아니라 본 연구자는 SeMet의 암 예방 기전 연구

를 통하여 SeMet에 의해 항종양인자 p53이 활성화된다는

사실을 보고한 바 있다. 특히 SeMet이 DNA 손상을 유발

하지 않고 p53을 활성화시키는 것을 발견하고 SeMet의

화학 예방 기전으로서 항 종양인자 p53의 중요성을 제시

하였다.

그러나 SeMet의 분자생물학적 암 예방 기전에 대해서는 아직 명확하지 않은 실정이다.

항 종양 인자 p53은 정상 세포에서는 적은 양으로 발 현되어 있다가 스트레스에 의해 일시적으로 과 발현되 어 전사 인자로서 스트레스에 반응하는 많은 유전자들 의 발현을 촉진하여 cell cycle arrest, apoptosis, DNA repair 와 같은 세포 반응을 유도하게 된다.

이러한 일련의 반 응은 스트레스에 대해 일시적이고 세포가 극복하게 되 면 다시 정상 상태로 유지되면서 p53의 역할이 끝나게 되어 짧은 반감기를 가지고 있다. 한편, 이러한 p53의 기 능은 최근 암 예방의 측면에서 중요한 DNA repair 기전 에 관여한다고 보고 되면서 p53의 활성화 기전에 관한 연구가 대두되고 있다.

p53의 활성화의 기전으로는 acetylation, phosphorylation 그리고 sumoylation과 같은 번역 후 조절 과정을 통해 유 도된다고 알려져 왔다. 최근, redox factor 1 (Ref-1)이 in vitro에서 p53 DNA와 결합하여 활성을 조절하는 조절자 로서 보고 된 바 있다.

Ref-1은 p53의 산화/환원 조절에 있어서 매우 중요한 역할을 하고 다양한 세포 내 신호 전달 경로에 관여한다고 알려져 왔다. 또한 Ref-1은 human AP endonuclease (Ape1)과 결합하여 다양한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 특히, 셀레늄 처리 시 Ape1과 Ref-1의 association은 산화/환원 조절을 통해 p53과 같은 전사 인자들을 활성화시키는 것으로 알려져 있다.

Ref-1 역시 특정 cycteine 잔기를 환원시킴으로서 p53의 산화/환 원 상태를 조절하는 것으로 알려져 있다.

한편, p53과 같은 항 종양 인자로서 PTEN은 PtdIns 3-kinase에 의해서 생성되는 PtdIns(3,4,5)P3을 탈인산화함 으로서 암세포에서 흔히 나타나는 PI3K의 활성을 억제 하는 것으로 알려져 있다.

최근 이러한 항 종양인자 PTEN은 PI3K-Akt signaling을 억제하고 p53의 degradation 을 유도하여 p53 protein stability를 조절하는 것으로 알려 져 있는 MDM2의 핵 내 localization을 억제함으로서 p53 을 보호하는 것으로 보고되면서 그 중요성이 대두되고 있다.

지금까지 몇몇 연구 그룹에서는 이러한 p53의 활성화 는 암 세포에서 항 종양인자로서 PI3K/Akt signaling을 억 제하는 것으로 알려져 있는 PTEN에 의해서도 조절된다 고 보고하고 있다. 또한 최근 연구에 따르면 PI3K/Akt에 의해서 조절 받는 Mdm2 역시 억제되면서 p53의 단백질 안정화가 증가한다는 결과를 보여준다. 그러나 셀레늄 의 암 예방 효과의 명확한 기전에 대해서는 현재에도 연 구가 계속 진행되고 있다. 따라서 본 연구자 그룹은 이 연구는 항산화게 셀레늄의 새로운 작용기전의 밝히고자

SeMet의 암 예방 기전을 redox modulation에 의한 항 종양 인자 p53과 PTEN의 조절을 중심으로 연구를 진행하였다.

재료 및 방법 1. 세포 배양

본 연구에 사용된 세포주는 인간 대장 유래 세포인 wild type p53 RKO cell line과 mutant p53 의 RKO-mp53 cell line과 인간 유방 유래 세포인 wild type p53 MCF-7과 mutant p53의 MCF-mp53으로 RKO와 RKO-mp53의 경우, 90%의 RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), MCF와 MCF-mp53의 경우, 90%의 DMEM (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS), 1%

의 penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)이 포함된 배지를 사용하여 배양하였다.

2. Western blot analysis에 의한 단백질 발현의 분석

PBS로 washing하고 세포를 수집한 다음 lysis buffer를 첨가하고 4

C에서 20분간 반응시킨 후 14,000rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 상층액의 단백질을 분리하였다.

Bio-Rad 사의 Bradford reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 를 이용하여 단백질 정량을 수행하고 동량의 전체 세포 내 단백질을 4∼12% gradient SDS-polyacrylamide gel로 분 리하고 electroblotting을 통해 nitrocellulose membrane으로 단백질을 transfer 시켰다. 10% skim milk를 함유한 TBS-T (0.1% Tween 20, Sigma, St. Louis, MO, USA)에 4

C에서 1시 간 이상 blocking을 실시하였다. 본 실험에서 사용된 p53 항체는 mouse anti-p53 monoclonal antibody (DO-1, Santa Cruz, CA, USA), PTEN 항체는 mouse anti-PTEN monoclonal antibody (A2B1, Santa Cruz, CA, USA), GAPDH 항체는 rabbit anti-Gapdh polyclonal antibody (Labfrontier, Seoul, South Korea)를 일차, horseradish peroxidase (Santa Cruz, CA, USA)에 결합되어 있는 rabbit immunoglobulin G 또는 mouse immunoglobulin G의 antibody를 사용하여 검출하였 다. 고정된 horseradish peroxidase 활성은 chemiluminescence (Pierce, Rackford, IL, USA)로 검출하였다.

3. Fluorescence microscope

Slide glass (Am Wöllerspfad, Germany)위에 세포를 배양

한 다음 formaldehyde (Sigma, St. Louis, MO, USA) 와 같은

fixative로 세포를 고정시켰다. 세포를 PBS로 세척한 후에

1시간동안 blocking 시키고, primary antibody를 37

C에서

1시간, FITC conjugate된 secondary antibody를 30분간 반응

시켰다. 한 번 더 세포를 PBS로 세척한 후에 형광현미경

Fig. 1. p53 protein expression in repsonse to selenomethionine (SeMet). In our previous study, p53 was activated in response to SeMet.⁴⁾ We confirmed that p53 protein expression was dose-dependently accumulated in the presence of SeMet.

Fig. 2. PTEN protein expression in the presence with SeMet.

PTEN known as a tumor suppressor has been reported to inhibit the phosphorylation of PI3 kinase and AKT to block the survival signal of tumor cells. In addition, PTEN has been documented to inhibit the translocalization of MDM2 into nucleus and induce p53 stabilization. We investigated whether PTEN involved in p53 accumulation via PTEN-mediated PI3K-Akt-MDM2 signaling pathway in response to SeMet using western blot. Our data showed that the expression of PTEN was not altered in response to SeMet implicating that p53 activation might be modulated by PTEN-independent pathway, although the activity of PTEN was needed to explore in the further study.

Fig. 3. Differential localization of p53 accumulation on nucle- olus in Ref-1 dominant negative cells. We investigated whether the localization of p53 was modulated by redox factor 1 (Ref-1) using fluorescence microscopy. Our data showed that p53 protein was localized in the nucleolus in Ref-1 dominant negative cells contrast with in Ref-1 wild-type cells implicating that the translocation of p53 protein between nucleus and nucleolus might be related to redox signaling pathway.

하 (Nickon, ECLIPSE E8, Japan)에서 관찰하였다.

결 과

1. SeMet 처리에 의한 항종양인자 p53의 발현 변화

본 연구에서 SeMet의 암 예방 효과를 항 종양인자 p53 의 활성화와 관련지어 연구하기 위해 DNA damage가 없 는 농도별로 SeMet을 처리한 결과 SeMet을 처리하지 않 은 경우에 비해 10, 20μM의 SeMet을 16시간동안 처리한 세포에서 p53의 발현이 현저히 증가하는 것을 관찰하였으며 이는 p53 단백질의 활성이 증가한 것을 암시 한다(Fig. 1).

2. SeMet 처리에 의한 항종양 인자 PTEN의 발현 변화

PTEN은 p53과 같은 항 종양인자로 알려져 있으며, PI3K/Akt의 inhibitor로 작용한다고 알려져 있다. 이러한 PTEN이 SeMet에 의해 p53의 활성화와 PI3K/Akt signaling 에 어떠한 역할을 하는지 알아보기 위하여 western blot을 수행한 결과, PTEN의 발현 변화는 큰 차이가 나타나지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 이것은 PTEN이 PI3K- Akt의 활성을 억제하고 MDM2의 인산화를 억제함으로 서 p53의 안정화를 유도하는데 있어서 SeMet에 의해서 영향을 받지는 않는다는 것을 보여준다. 그러나 PTEN은 항 종양인자로서 SeMet의 암 예방 기전에 중요한 target molecule이 될 가능성이 있기 때문에 이것이 PTEN의 활 성에도 영향을 미치는지 좀 더 연구해 볼 필요가 있다고 하겠다.

3. SeMet 처리 시 Ref-1 redox signaling이 p53 기 능에 미치는 영향

본 연구팀의 기존연구에서는 p53의 활성화가 ref-1

redox factor의 활성화에 의한 것이라는 것을 밝혔었다.

따라서 이러한 ref-1의 dominant negative 형질을 가지고

있는 세포주인 65-5를 사용하여 p53의 localization의 변화

를 확인해 보았다. 그 결과, Ref-1 wild-type인 세포의 경우 p53 protein이 nucleus 내에 그대로 존재하는 반면, 65-5 세 포의 경우, 셀레늄처리에 의한 p53의 nucleolus accumulation 이 관찰되었다(Fig. 3). 이는 ref-1 signaling 의존적인 p53의 활성화 기전이 p53의 translocation에 중요함을 암시해준 다. 따라서 SeMet 처리에 의한 p53 활성화 증가의 결과는 기존 redox signaling과 연관되어 있을 가능성을 제시한다 고 할 수 있다. 따라서 본 연구를 통해 SeMet의 암 예방효 과에 대한 새로운 시각으로 redox singling과 p53의 func- tional activation의 작용 기전을 제시할 수 있겠다.

고 찰

셀레늄은 human health에 필수적인 영양소로 알려져 있으며 암 예방에 효과를 갖고 있다는 사실이 오래전부 터 보고 되어 왔다. 이것은 여러 동물 실험들을 통해서도 그 효과가 증명되고 있다.

그러나 흥미롭게도 대부분 의 연구들이 셀레늄 화합물에 의해 유도되는 세포 반응 에 초점을 맞추고 있고 그것의 기전에 대해서는 거의 연 구가 되어 있지 않고 있는 실정이다. 현재 다양한 화학 구조를 갖고 있는 여러 셀레늄 함유 화합물들이 in vitro 에서 cell proliferation을 억제한다고 보고되고 있다.

본 연구자 그룹에서는 그 중에서도 특히 Selenomethionine (SeMet)은 organic selenium compound 중 하나로 DNA 손상 을 야기 하지 않고 p53의 활성화를 유도한다는 사실을 보고하였다.

이 연구는 SeMet의 암 예방 기전의 첫 연구 로 이러한 세포 반응이 SeMet의 암 예방 효과의 기전으 로 그 가능성을 제시할 수 있지만, 화학예방학적 대사 경로에 대한 연구의 필요성이 있다.

최근 p53은 SeMet에 의해서 발현이 증가하고 이것이 지금까지 알려진 phosphorylation, sumoylation 및 acetylation 과 같은 기전이 아닌 SeMet에 의한 p53의 산화/환원 (redox) 조절을 통해 유도된다는 사실이 보고 된 바 있다.

그러나 redox signaling에 의한 p53의 활성화에 기초한 SeMet의 암 예방 기전에 관하여는 거의 연구되고 있지 않고 그 기전 연구가 암 예방 치료에 매우 중요한 의미 를 가지고 있기에 본 연구에서는 SeMet에 의해 유도되는 항 종양 인자 p53의 활성화와 이에 관련된 target으로 PTEN의 cross-talk을 중심으로 SeMet의 암 예방, 치료 기 전에 대해 연구하였다.

우선 본 연구에서는 실제 SeMet에 의해서 p53 활성화 가 유도되는지 확인하기 위해 SeMet을 저 농도에서 처리 한 후 p53의 발현 양을 확인한 결과, 처리하지 않은 세포 보다 10, 20μM로 처리한 세포에서 현저한 증가를 나타

나는 것으로 관찰되었다(Fig. 1). 이러한 결과는 최근 본 연구 그룹에서 SeMet의 redox modulation에 의해서 활성화 된다는 보고의 결과와 일치하는 것으로4) SeMet의 암 예 방 기전으로서 redox modulation에 따른 항 종양 인자 p53 의 활성화의 측면에서 연구를 더 진행하고자 하였다.

SeMet에 의한 항 종양 인자의 활성화에 관련된 기전을 밝히고자 최근 p53의 단백질 안정성에 관여하는 것으로 알려진 PTEN의 발현 양상을 확인하였다. PTEN은 항 종 양 인자로서 growth factor의 secondary messenger인 PI3K를 탈인산화시켜 불활성화 상태를 만드는 것으로 알려져

있다.

이렇게 탈 인산화된 PI3K는 downstream인 Akt

를 인산화시키지 못하고 p53의 degradation에 관여하는 것으로 알려진 MDM2의 인산화도 유도되지 못해 MDM2 의 핵 내 진입을 억제하게 된다. 따라서 PTEN은 MDM2 로 인한 p53의 degradation이 억제시켜 p53의 기능적 활성 화를 유지할 수 있게 하는 것으로도 보고 되고 있다.

이러한 PTEN이 SeMet에 의해서 유도되는 p53의 활성화 에 관여하는 것인지 알아보기 위해 SeMet 처리 후 PTEN 의 발현을 확인한 결과, PTEN의 단백질 발현은 변화가 없는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 PTEN이 SeMet에 의해 조절 받지 않고, PI3K-Akt-MDM2의 signaling 이 p53의 활성화에 영향을 주지 않는다는 것을 알 수 있 다. 즉, p53의 활성화는 PTEN과 독립적인 기전을 통하여 유도된다는 것을 의미한다고 하겠다.

한편, SeMet에 의해 유도된 p53의 발현 증가가 redox modulation에 의한 것으로 기능적 측면에서 어떠한 의미 를 갖는지 알아보기 위하여 redox factor 1인 Ref-1의 dominant negative cell인 65-5 세포를 이용하여 p53의 localization을 확인해 보았다. 그 결과, Ref-1이 정상인 세 포에서는 p53의 발현이 핵 (nucleus)과 nucleolus에 동시에 관찰되었다. 반면, Ref-1 dominant negative cell인 65-5 세포 에서는 p53이 핵 (nucleus) 에서 발현되기는 하나 nucleolus 에 여전히 축적되어 관찰되었다(Fig. 3). 이러한 현상은 Ref-1의 기능이 p53의 활성화 뿐 만 아니라 핵과 nucleolus 사이의 translocation에도 매우 중요한 역할을 하고 있음 을 알 수 있다. 즉, SeMet에 의해 활성화되는 것으로 알려 져 있는 Ref-1에 의해서 p53의 localization이 조절될 수 있 음을 의미한다고 할 수 있겠다.

지금까지 셀레늄이 암 억제 효과를 갖는다는 연구 결

과는 많이 보고 된 바 있지만 이것이 어떠한 기전으로

나타나는지에 관해서는 거의 알려진 바가 없다. 본 연구

에서는 이러한 연구의 일환으로 이전 연구에서 제시하

였던 p53의 활성화 기전을 연구하고자 하였으며, 그 일

환으로 p53의 조절자로 알려져 있는 PTEN의 관련 여부

에 관한 연구를 진행하였다. 또한, p53의 활성화가 기능 적으로는 어떠한 의미를 갖는지에 관하여 조사하였다.

결론적으로 SeMet에 의해 유도되는 p53의 발현 증가는 PTEN에 의한 signaling pathway 조절과는 독립적인 기전 으로 유도되는 것으로 보여 지고 이와 관련된 다른 기전 의 발굴 및 연구가 필요하다고 사료된다. 또한 redox dependent한 cellular mechanism이 존재하는 것으로 보여 진다. 본 연구의 결과들은 앞으로 SeMet의 암 예방 및 치 료를 위한 약제 개발에 중요한 연구 자료를 제공할 수 있으리라 생각되어 진다.

감사의 글

논문 작성에 도움을 준 경희대학교 기초의과학과 권 지영에게 감사드리며, 이 연구는 한국학술진흥재단의 지원을 받아 수행하였다(KRF-2004-015-C00552).

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