The Study for the Correlation Between the Clinical Results and Neovascularigation and bFGF Expression in Disc Herniation
Chang-Hoon Jeon, M.D., Han Kyeom Kim, M.D.✽and Shin Young Khang, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, Ajou University School of Medicine Department of Pathology, Korea University School of Medicine✽ – Abstract –
Study Design : To study the correlation between the clinical outcomes and neovascularization and bFGF expression in the her- niated disc tissues.
Objectives : To study the difference of neovascularization and bFGF expression according to the types of disc herniation, and to study the correlation between the duration of radiculopathy, post-operative results and neovascularization and bFGF expres- sion in the herniated disc tissues.
Summary of Literature Review : Neovascularization has been found in herniated disc tissue. bFGF(basic Fibroblast Growth Factor) in the intervertebral disc has been implicated in the pathogenesis of injury and repair associated with granulation and neovascularization. There is no information on the relationship between clinical outcome and the neovascularization and bFGF expression in the herniated disc tissue.
Materials and Methods : Among 112 specimens, there are 48 cases in protrusion, 36 in extrusion and 28 in sequestration.
Hematoxylin-eosin stain and immunochemical stain with CD 31 and bFGF were used. For the evaluation of post-operative results, Kirkaldy-Willis method was used. The results were analyzed with Chi-square test and t-test.
Results : Statistically there is no correlation between the types of disc herniation, duration of radiculopathy and post-operative outcomes and neovascularization and bFGF expression.
Conclusions : The neovascularization and bFGF expression in herniated disc tissue are correlated with the injury of disc tissue.
There are no correlation with the clinical outcomes and neovascularization and bFGF expression in herniated disc tissues.
Key Word : Disc herniation, Neovascularization, bFGF.
Journal of Korean Spine Surg.
Vol. 7, No. 4, pp 514~520, 2000
Address reprint requests to Chang-Hoon Jeon, M.D.
Department of Orthopaedic Surgery, College of Medicine, Ajou University
#san 5 Wonchun-dong, Paldal-ku, Suwon, 442-749, Korea
추간판 탈출증의 추간판 조직에서 관찰되는 신생 혈관 및 bFGF 발현과 임상 증상과의 관련성
전창훈・김한겸
✽・강신영
아주대학교 의과대학 정형외과학교실, 고려대학교 의과대학 병리학교실✽
서 론
추간판 조직에서 관찰되는 미세 혈관의 근원은 아직 밝혀지지 않고 있으나 , 탈출된 추간판 조직이 경막외 공간에 노출되므로써 이물질로 인식되어 자가 면역 반 응이 일어나 만성 염증 반응이 발생하는 것과 관련이 있다고도 한다3 ). 이외에도 추간판 조직에 대한 섬유모 세포 성장인자를 이용한 면역학적 연구에서 탈출된 추 간판 조직내에서 섬유모세포 성장인자 ( F i b r o b l a s t Growth Factor, FGF)가 추간판 내에서 미세혈관의 형성 을 유도하고, 추간판 조직의 세포 배양에서 섬유모세포 성장인자가 연골조직에서와는 다른 반응을 보이며, 특 히 수핵과 섬유륜의 이행부에서는 추간판의 재생을 조 절하며, 섬유모세포 성장인자가 세포외기질로 침투하 여 모세혈관을 형성한다고 한다1 3 ). 탈출된 추간판 조직 내에서 섬유모세포 성장인자의 발현 유무는 신생혈관 의 형성 및 추간판의 재생이나 흡수에 중요한 관계가 있다고 추정되고 있으며, 탈출된 추간판 조직내에서 관 찰되는 신생혈관 및 섬유모세포 인자가 추간판 탈출증 환자의 임상증상과의 관련에 대한 연구는 드물다 . 본 연구의 목적은 추간판 탈출증에서 성별, 연령별 및 탈 출 정도에 따라서 신생 혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현의 차이를 연구하여 추간판 탈출증 환자의 하지 방 사통의 지속 기간과 수술후 증상의 호전 정도에 대한 신생 혈관의 형성과 섬유모세포 성장인자의 발현의 차 이를 비교 분석하였다.
연구대상 및 방법
1. 연구대상
1 9 9 4년 6월부터 1 9 9 7년 6월까지 추간판 탈출증으로 수술받고 2 4개월 이상 추시가 가능하였던 1 1 2명의 환 자를 연구대상으로 하였다. 연령은 1 0 ~ 1 9세, 20~29세, 3 0 ~ 3 9세, 40~49세, 50~59세, 60~69세로 나누어 분류하 였다. 112명의 환자의 추간판 탈출증에 대한 진단은 이 학적 검사와 자기공명영상 검사를 실시하였으며 , M c C u l l o c h등1 0 )이 발표한 분류법에 따라서 돌출 추간판, 탈출된 추간판, 격리된 추간판으로 각각 진단한 후, 수 술시야에서 확진하였다 . 단, 산재사고나 교통사고 등 으로 보상 심리가 의심되는 경우는 연구 대상에서 제 외하였다.
2. 연구방법
전 환자는 1명의 정형외과 척추전문의에 의해서 수술 (부분 추궁판 제거술 및 추간판 제거술)이 시행되었다.
돌출 추간판 및 탈출 추간판 조직은 추간판에 칼로 창을 낸 후 적출하였으며, 격리된 추간판은 추간판 조직을 그 대로 적출하였으며 추간판 조직은 수술시 첫번째로 얻 은 조직을 연구대상으로 하였다. 모든 추간판 조직은 수 술직후 -70℃로 급냉하여 보관하였다.
추간판 탈출증 환자의 수술전 하지 방사통의 지속기 간은 3개월이내, 3개월에서 6개월, 6개월이상으로 나누 었으며, 수술후 결과는 수술후 6개월, 1년, 2년에 실시하 였다. 수술 후 예후평가는 Kirkaldy-Willis의 평가방법을 사용하여 그 결과를 분석하였다.
통계처리는 각 지표에 따라 Chi-square test, t-test를 사 용하여 p값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 의미가 있다고 판정하였다.
대조군으로는 부검시 적출한 신생아의 요추부 추간판 조직 12례를 대상으로 하였다(Fig. 4).
3. 조직학적 관찰
추간판 조직을 통상적인 H e m a t o x y l i n - e o s i n e염색법과 신생혈관을 관찰하고자 항 내피세포 항체(CD 31 : anti- endothelial cell antibody : CD 31) 및 섬유모세포인자 (basic Fibroblast Growth Factor : bFGF) 항체를 이용한 면 역 조직화학염색법을 이용하여 추간판 조직내의 혈관형 성을 관찰하였다. 염색방법은 다음과 같이 실시하였다.
1) Hematoxylin-eosine 염색법
7 0℃로 냉동시킨 조직을 실온에서 서서히 녹힌 후 Bö - in 용액에 3 0분에서 4 0분간 고정한 후 흐르는 물에 고정 액을 제거하고 Formalin 용액에 고정하였다. 저농도에서 고농도 알코올까지 이동하여 수분을 제거하고 탈 알코 올 과정과 X y l e n e으로 투명과정을 거친 후 연질 파라핀 부터 경질 파라핀까지 항온기에 침투시켜 파라핀 포매 블럭을 만들었다. 박절기로 조직을 얇게( 6±2㎛) 짜른 후, 각각의 조직은 4% neutral buffered solution으로 고정 하였으며, 다시 파라핀으로 고정하였다. 각각의 조직( 6
±2㎛)을 H e m a t o x y l i n - e o s i n e으로 염색하였다(Fig. 1).
2) 면역 조직화학염색
각각의 조직절편을 30분에서 60분간 56℃~60℃ 항온 기에서 가온시켜 조직을 슬라이드에 잘 부착시킨 후 60
℃ 항온기에서 충분히 건조시켰다. 이 후 Xylene으로 10
분간 3회에 걸쳐 탈파라핀시키고 증류수로 세척하였다.
내재성 p e r o x i d a s e를 억제하고자 3% 과산화수소( H2O2) 와 M e t h a n o l을 섞은 용액으로 1 0분에서 1 5분간 처리한 후 증류수로 3분간 세척하였다. Phosphate buffered solu- tion(PBS)으로 5분간 3회에 걸쳐 반복 세척하였다. 비특 이성 반응을 억제하고자 정상 goat 혈청으로 2 0분에서 3 0분간 처리한 후 1차 항체로 실온에서 1시간에서 2시 간정도 감작시켰다. 이후 PBS로 5분간 3회에 걸쳐 세척 하였다. 2차 항체로 20분에서 30분간 반응한 후 5분씩 3 회에 걸쳐 PBS로 세척하였다. Labelled serum으로 20분 간 처치 후 P B S로 세척하였다. AEC (3amino-9-Ethyl- Carbazone) 용액으로 처리한 후 다시 PBS로 세척하였다.
H e m a t o x y l i n과 Eosine 염색법으로 대조 염색을 실시하 였다.
항 내피세포 항체(Anti-endothelial cell antibody : CD 31, D a k o p a t tⓇ, Copenhagen, Denmark)는 1 : 1 0 0의 농도로 염색 하여 신생혈관을 관찰하였고(Fig. 2), 섬유모세포 성장인
로 염색하여 탈출된 추간판 조직내의 신생혈관의 형성 에 대한 섬유모세포인자의 발현을 관찰하였다(Fig. 3).
4. Hematoxylin-eosine 염색과 면역 조직화학적 4. 염색판독
Hematoxylin-eosine염색의 판독과 섬유모 세포 성장인 자를 이용한 면역 조직화학염색의 판독은 현미경으로 판독하였으며 , 혈관형성이 관찰되고 면역염색상 갈색 에서 적색으로 염색되는 것에 한해 양성으로 판독하였 다. 조직의 관찰은 2명이 환자의 임상기록 및 수술 결과 에 대해 숙지되지 않은 상태에서 동시에 조직표본을 관 찰하여 혈관형성에 대해 결과가 일치하는 경우에 한해 양성으로 하였으며, 면역 조직 화학 염색한 조직은 3차 례에 걸쳐 별도로 관찰하여 판독후 결과가 일치하는 경 우에 한하여 양성으로 판독하였다.
Fig 1. Low magnification view of herniation disc tissue show- ing granulation tissue with blood vessels.
Fig 2. Herniated disc tissue stained with positive reaction for CD 31.
Fig 3. Herniated disc tissue stained with positive reaction for FGF.
Fig 4. Neonatal intervertebral disc specimen.
결 과
추간판 탈출증으로 수술치료 받은 환자의 연령 분포 는 16세에서 65세였으며, 연령 분포는 30세에서 39세 사 이가 가장 많았으며(Table 1), 남자는 69명, 여자 43이었 다(Table 2). 조직학적 염색 판독 결과 성별 및 연령에 따 른 신생혈관 및 섬유모세포 성장인자의 발현의 차이는 통계학적으로 의미가 없었다(Table 1, 2).
돌출 추간판 조직은 48례, 탈출 추간판은 36례, 격리된 추간판은 2 8례였다(Table 3). 탈출된 추간판 조직의 정 도에 따른 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현의 차이는 없었다(Table 3).
탈출된 추간판의 특징적 임상증상인 하지 방사통의
지속기간과 신생혈관 및 섬유모세포 성장인자의 발현 의 관련성은 통계적 의미가 없었다(Table 4).
수술후 결과 판정은 2년 후에 실시하였으며, 그 결과 는 매우 우수 54례, 우수 49례, 양호 5례, 불량 4례였다.
수술치료후 각 결과에 따른 신생혈관 및 섬유모세포 성 장인자의 발현과는 차이가 없었다(Table 5).
대조군인 신생아의 요추부 추간판 조직에서는 신생혈 관의 발현과 섬유모세포 성장인자의 발현은 관찰할 수 가 없었다(Table 6).
고 찰
탈출된 추간판 조직의 변연부에서 발견된 신생혈관은 탈출된 추간판 조직의 특징적인 조직학적 소견이라고 알려져 있다1,15). 척추 강 내로 탈출된 추간판이나 격리된 추간판 조직의 약 66.7%에서 섬유연골 분절에서 혈관형 성과 함께 반흔 조직의 내생이 발견되었다는 보고도 있 다. 이외에도 격릭된 추간판 조직의 변연부에서 신생혈 관 형성이 관찰되었다고 보고도 있으며7,8), 이런 현상은 Table 1. The correlation with age distribution and the expres-
sions of CD 31 and bFGF.
Age
CD 31 FGF*
＋ － ＋ －
10 ~ 19 5 6 6 5
20 ~ 29 18 7 16 9
30 ~ 39 22 14 19 17
40 ~ 49 11 8 12 7
50 ~ 59 8 6 8 6
60 < 69 2 5 2 5
Chi-Square test : p>0.05, p*>0.05
Table 2. The correlation with the gender and the expressions of CD 31 and bFGF.
Gender CD 31 FGF*
＋ － ＋ －
Male 48 21 46 23
Female 18 25 17 26
Chi-Square test : p>0.05, p*>0.05
Table 3. The correlation with the types of disc herniation and the expressions of CD 31 and bFGF
Type CD 31 FGF*
＋ － ＋ －
Protrusion 27 21 26 22
Extrusion 21 15 21 15
Sequestration 18 10 16 12
Chi-Square test : p>0.05, p*>0.05
Table 4. The correlation with the duration of radiculopathy and the expressions of CD 31 and bFGF.
D. Sx (Mo) CD 31 FGF*
＋ － ＋ －
0 ~ 3 30 16 25 21
3 ~ 6 25 21 27 19
> 6 11 9 11 9
t-test : p>0.05, p*>0.05
Table 5. The correlation with the post-op results and the expressions of the CD 31 and bFGF.
Prognosis CD 31 FGF*
＋ － ＋ －
Excellent 33 21 31 23
Good 28 21 26 23
Fair 2 3 3 2
Poor 3 1 3 1
Chi-Square test : p>0.05, p*>0.05
Table 6. Control group.
No. CD 31 bFGF
＋ － ＋ －
12 cases 0 12 0 12
치유기(healing stage)에서 뚜렷이 보이는 흡수 과정의 하 나라고 설명하고 있다8). Yasuma 등은 탈출된 추간판 조 직에서 혈관형성을 보고하면서 이런 미세 혈관의 근원 은 불확실하다고 하였고, 첫째 추간판내에 미리 존재하 였던 혈관이 추간판과 함께 탈출되었거나, 또는 추간판 탈출증이 일어난 이후에 새롭게 형성된 혈관일 수도 있 다고 하였다1 6 ). 이런 혈관형성은 추간판 탈출이후에 새 로 생긴 혈관이며, 경막외 혈관과 연관지어 나타날 수 있다고 보고하고 있다8,9). Gospodarowicz6)는 섬유모세포 성장인자가 혈관 형성의 유도체이며, 내피세포 배양에 서 생성된 섬유모세포 성장인자의 1/3은 세포외 기질과 결합하므로써 이런 요소에 대한 저장 장소의 역할을 한 다고 보고하였다 . 섬유모세포 성장인자의 세포반응도 추간판의 세포외 기질내의 단백질 분해작용과도 관련 이 있을 수 있으며, 섬유모세포 성장인자가 세포외기질 로 침투하는 모세혈관 내피세포로 유도된다고 하면서 존재하고 있는 섬유모세포 성장인자의 양에 따라 발전 정도가 관계가 있다는 보고도 있다6). 섬유모세포 성장인 자는 신생 혈관의 형성을 촉진하는 작용 외에도 다른 생 리학적 작용은 손상된 조직의 성장인자의 재생, 성장 및 발전에 관여한다5). 섬유모세포 성장인자의 생화학적 기 능에 대한 연구에서 시험관내에서 섬유모세포 성장인 자를 주입시켜 신생혈관형성이나, 세포에서 섬유증식 을 유도하므로써, 신생혈관의 형성이나 창상치유시 섬 유모세포 성장인자의 역할을 증명하였다12).
Tolonen등14)은 추간판 탈출증시 추간판 조직에서 신생 혈관에 대한 섬유모세포 성장인자의 발현과 연령과는 통계학적으로 관련이 없었다고 보고하고 있다. 그러나 젊은 연령층의 환자에게서 추간판 세포와 관련된 섬유 모세포 성장인자의 면역 반응이 더 나타날 수 있다고 하 면서 이것은 젊은 연령층의 환자에게서 더 강한 세포반 응 능력과 관련이 있다고 하였으나 어떠한 증거도 제시 하자 못하였다1 4 ). 저자의 연구에서 탈출된 추간판 조직 에 대해 신생혈관 및 섬유모세포 성장인자의 발현과 환 자의 연령별, 성별은 통계학적으로 의미가 없었다.
추간판 조직에서 섬유모세포 성장인자를 이용한 연구 에서 섬유모세포 성장인자에 의해서 추간판의 수핵과 이행부에서 추간판의 치유가 될 수 있다고 하였다1 3 ). Tolonen 등14)은 추간판 조직의 미세 혈관에서 섬유모세 포 성장인자의 존재가 확인됨으로써 이것은 추간판 손 상의 결과로 신생 혈관이 활성화된 것으로 예상된다고 보고하였다. 탈출된 추간판 조직이나 격리된 추간판 조 직의 세포에서 팽윤된 추간판의 세포보다 섬유모세포 성장인자의 수준이 높다고 보고되었으며, 그 결과 이런 성장인자가 내피세포의 증식을 일으킨다고 한다6). 본 연
생혈관 및 섬유모세포 성장인자는 추간판 조직의 탈출 된 정도에 따라서는 그 발현 정도가 차이가 없었다.
탈출된 추간판 조직의 변연부에서 신생혈관의 존재 유무와 임상증상의 지속기간 등에 대해서는 저자들마 다 서로 다른 결과를 보고하고 있다2,3). Chitkata는2)탈출 된 추간판 조직의 변연부에서 관찰되는 신생혈관 형성 의 존재 유무에 영향을 미치는 요소 중의 하나로 탈출된 추간판의 기간이 관련이 있으며, 증상 지속기간이 1개 월 이내인 경우에서 12.5%, 6개월 이상에서는 82%에서 혈관형성이 있다고 보고하고 있다. 다른 연구 결과에서 는 신생혈관의 형성은 재활성화 및 치유현상을 반영하 는 것으로, 이런 현상은 질환 진행 과정의 기간과는 관 계가 있으며, 연령이나 성별 등의 요소는 추간판 조직내 의 변연부 신생혈관의 검출속도(detection rate)에 영향을 주지 않는다고 한다2). 이외에 혈관 형성의 정도는 수술 전까지 임상증상의 기간과, 추간판 조직의 퇴행성 정도, 투약방법과 관련이 있다는 보고하였다8). 그러나 혈관형 성이 동반된 염증반응의 유무는 질환의 지속기간과는 관계가 없다는 보고도 있다3). Moore 등11)도 격리된 추간 판과 탈출된 추간판 조직에서 발견된 혈관 형성과 증상 지속기간, 치료 결과와는 관계가 없었다고 보고하였고, Eckert 등4)도 추간판 조직에서 관찰되는 혈관 형성과 임 상 결과와는 특별한 관련이 없었다고 하였다. 저자들의 연구에서도 탈출된 추간판 조직에서 발견된 신생혈관 의 존재 유무는 하지 방사통의 지속 기간, 수술 후 결과 와는 관계가 없었다.
본 연구 결과 탈출된 추간판의 정도에 따른 신생혈관 및 섬유모세포인자의 발현의 차이는 없었으며, 성별, 연령별, 방사통의 지속 기간 및 수술 후 예후와도 신생 혈관 및 섬유모세포인자의 발현의 차이는 없었지만, 탈 출된 조직의 구성 성분에 따라 신생혈관 및 섬유모세포 인자의 발현의 차이에 대한 연구가 필요할 것으로 사료 되었다.
결 론
본 저자는 112명의 추간판 탈출증 환자의 추간판 조직 에 대해서 신생혈관과 섬유모세포 성장인자의 발현과 임상증상과의 관련성을 비교 분석한 결과 다음과 같은 결과를 얻었다. 탈출된 추간판 조직에서 신생혈관과 섬 유모세포 성장인자의 발현은 추간판의 손상과는 관계 가 있다고 사료된다. 탈출된 추간판 조직에서의 신생혈 관과 섬유모세포 성장인자의 발현은 탈출된 추간판의 정도나 성별, 연령, 환자의 하지 방사통 기간 및 수술 후
본 연구의 결과로 보아 추간판 조직에서 관찰되는 신 생혈관과 섬유모세포 성장인자의 역할에 대하여 더 많 은 연구가 시행되어져야 할 것으로 사료된다.
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연구 계획 : 탈출된 추간판 조직에서 관찰되는 신생혈관 및 섬유모세포 성장인자와 임상 증상과의 관련성에 대해 연 구한다.
연구 목적 : 추간판 탈출증의 탈출 정도에 따라서 신생 혈관과 bFGF의 발현의 차이를 연구하며, 추간판 탈출증 환자 의 하지 방사통의 지속 기간과 수술후 증상의 호전 정도에 대한 신생 혈관의 형성 및 bFGF의 발현과의 관련성을 연 구한다.
대상 및 방법 : 112명의 환자의 수술시 적출한 추간판 조직을 대상으로 하였으며, 돌출 추간판 조직은 48례, 탈출 추 간판은 36례, 격리된 추간판은 28례 였으며, 각 조직은 Hematoxylin-Eosion 염색, 항 내피세포 항체 및 섬유모세포인 자 항체를 이용한 면역 염색을 실시하였다. 추간판 탈출증 환자의 수술후 호전 정도는 Kirkaldy-Willis의 평가 방법을 사용하였으며, 통계는 Chi-square test, t-test를 사용하였다.
결 과 : 추간판 탈출증 환자의 추간 판 조직에서 환자의 성별 및 연령에 따른 추간판 조직에 대한 신생 혈관과 bFGF 의 발현의 차이는 없었다. 추간판 탈출증의 탈출 정도에 따른 신생혈관 및 bFGF의 발현의 차이점은 없었다. 하지 방 사통의 지속 기간과 신생혈관 및 bFGF의 발현과의 상관 관계는 통계학적 의미가 없었다. 추간 판 탈출증 환자의 수 술후 예후와 추간판 조직내의 신생혈과 및 bFGF의 발현은 그 관련성이 통계학적 의미가 없었다.
결 론 : 추간판 탈출증 환자의 추간판 조직에서 관찰된 신생 혈관과 bFGF의 발현은 추간판 손상과는 관련이 있다고 사료된다. 탈출된 추간판 조직에서의 신생 혈관과 bFGF의 발현은 추간판 탈출증 환자의 임상 증상 및 수술후 회복정 도와는 관련성이 없다고 사료되며, 추간판 조직에서 신생 혈관과 bFGF의 역할에 대해서 더 많은 연구가 시행되어져 야 할 것으로 사료된다.
색인단어 : 추간판 탈출증, 신생혈관, 섬유모세포 성장인자 국 문 초 록
※ 통신저자 : 전 창 훈
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