서론
효소는 생체 내 여러 가지 화학 반응에 관여하는 생촉 매로서, 효소 고유의 기질 특이성, 광학 선택성을 가지고 있다. 이러한 효소 고유의 특성 때문에 효소 반응은 부반 응이 거의 없고, 반응 수율이 높은 장점이 있기 때문에 실제 산업 공정에 사용되고 있는 기존의 화학 촉매를 대 체할 후보로서 주목 받고 있다. 그러나 효소는 가용성 촉 매로 수용액 상에서 반응 후 회수, 재사용이 어렵고, 유기 용매 반응이나 효소의 최적 조건을 넘어서는 운전 조건 에서는 활성이 급격하게 저하되는 등 산업 공정에 이용 하기에는 한계점이 있다. 위와 같은 한계점을 극복할 수 있는 대안으로서 가장 널리 쓰이는 방법은 불용성 담체 를 이용한 효소 고정화이다. 일반적으로 고정화된 효소 는 고정화 되지 않은 효소에 비하여 활성이 감소하지만, 안정성이 증가하고 반응 후 회수가 쉽다는 장점이 있다.
최근 나노 기술의 발전과 함께 비표면적이 넒은 여러 가지 형태의 나노 물질이 효소 고정화 담체로서 각광받 고 있다. 특히 탄소 나노 튜브나 탄소 나노 입자와 같은 탄소계 나노 물질은 화학적으로 안정한 구조를 가지고, 표면에 기능기 유도가 비교적 쉬우며, 전기 전도성이 좋 은 장점이 있어 생물 전자 공학 분야에 이용되는 효소 고 정화 담체로 많이 연구되고 있다. 본 칼럼에서는 탄소계 나노 입자에 고정화된 효소의 여러 가지 응용 예를 소개 하고자 한다.
본론
1) 효소 고정화
효소를 고정화하는 방법은 크게 담체 표면에 효소를 물리적으로 흡착시키는 방법, 담체 표면에 유도된 기능 기와 효소 표면에 노출된 아미노산 잔기 사이의 공유 결 합에 의한 방법, 막 구조나 다공성 구조에 효소를 가두는 방법, 다양한 기능기를 가진 가교제를 이용하여 여러개 의 효소를 교차 결합시키는 방법 등이 있다[그림 1].
각 방법들의 장, 단점을 살펴보면, 흡착에 의한 효소 고정화는 비교적 쉽고 간단하게 효소를 고정화 할 수 있 지만, 쉽게 탈착될 수 있다는 단점이 있다. 공유 결합에
탄소계 나노물질을
이용한 효소 고정화 및 그 응용
2001 연세대학교 화학공학과 공학사 2010 서울대학교 화학생물공학부 공학박사
현 재 한국과학기술연구원 청정에너지센터 박사 후 연구원
민 경 선
한국과학기술연구원
청정에너지센터
[email protected]
의한 고정화는 가장 널리 쓰이는 방법으로서 결합력 이 강하여 효소의 유출이 거의 없고, 다중 결합에 의 해 효소의 rigidity가 증가하므로 안정성 향상을 기 대할 수 있다. 제한된 공간에 효소를 가두는 포괄/포 획법은 제한된 공간 내에서 효소의 unfolding이나 변성이 제한되어 안정성이 증가할 수 있으나 반응 기질과 생성물의 물질 전달이 저해 받는 단점이 있 다. 가교제를 이용한 교차 결합은 특별한 담체 없이 효소 그 자체만으로 고정화하는 효과를 기대할 수 있지만, 일반적으로 가교제의 독성 때문에 효소 활 성이 저하되는 문제점이 있다. 본 칼럼에서 소개하 는 효소 고정화는 기본적으로 공유 결합에 의한 것 으로 탄소계 나노 물질의 고유 특성인 전기 전도도 를 유지하기 위해 1-pyrenebutyric acid를 표면에 흡착시켜 공유 결합에 필요한 카르복실 그룹을 유도 하고, 간단한 활성과정을 거쳐 효소 표면에 노출된 아민 그룹과 펩타이드 결합에 의하여 탄소계 나노 물질에 효소를 고정화하였다.
2) 탄소계 나노 물질에 고정화된 효소를 이용한 바이오 센서
바이오 센서는 [그림 2]에서처럼 생물학적 요소 들을 이용하여 특정 시료를 검출하는 장치로서 세포, 효소, 항체들의 생물학적 요소와 transducer 또는 detector, 신호 처리와 관련된 electronics 세 부분으
로 구성되며 그 성능은 주로 민감도, 검출 한계, 반 응 시간 등으로 평가된다. 효소 반응을 이용한 바이 오 센서는 포도당 산화 효소를 이용한 혈당 측정 장 치가 가장 대표적이며 주로 의학용 진단, 환경 오염 모니터링 등에 이용 되는데, 본 칼럼에서는 탄소 나 노튜브에 tyrosinase(E.C. 1.14.18.1)를 고정화하여 만든 전극을 이용하여 인체 내 신경 전달 물질 중 하 나인 dopamine을 검출하는 바이오 센서를 소개하고 자 한다.
Tyrosinase는 활성 부위에 구리 이온을 가지고 있 는 산화 환원 효소 중 한가지로서 monophenol의 hydroxylation과 diphenol의 oxidation반응을 촉매 하며, 페놀, 크레졸, 카테콜, 도파민 등 여러 가지 페 놀계 화합물을 기질로 한다. Dopamine은 뇌 속 중 요한 신경 전달물질로 부족할 시 파킨슨씨 병을 일 으키는 것으로 알려져 있다. 파킨슨씨 병 진단과 관 련하여 뇌 조직 내 도파민 농도를 측정하는 방법의 개발이 매우 중요한데, 주로 전기 화학적 방법이 이 용된다. 전기 화학적 dopamine 측정 방법은 반응 시 간이 짧고 정확도가 높은 장점이 있으나 조직 내 존 재하는 다른 물질들에 의해 시그널이 영향을 받는 그림 1. 일반적인 효소 고정화 방법.
그림 2. 바이오 센서의 원리 및 구조.
단점이 있다. 특히 아스코르브산의 경우 도파민과 비슷한 potential 영역에서 산화 반응이 일어나므로 중요한 검출 방해 물질이라고 할 수 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 필자는 탄소 나노 튜브에 tyrosinase를 고정화한 후 전도성 고분자인 polypyrrole을 이용하여 3차원 전극을 개발하였고, 이 전극을 뇌 조직 내 다른 물질의 방해없이 선택적 으로 dopamine을 측정하는 바이오 센서 시스템에 적용하였다. [그림 3]에서 알 수 있듯이 개발된 바이 오 센서는 dopamine의 산화 전위에서 아스코르브산 에 대한 시그널을 전혀 보이지 않았으며 기존에 개 발된 다른 전극 시스템과 비교했을 때 민감도(467 mAM-1cm-2)가 높고 검출한계(5 µM)가 낮아서 매 우 성능이 좋은 바이오 센서라고 할 수 있겠다.
3) 탄소계 나노 물질에 고정화된 효소를 이용한 바이오 연료전지
연료전지는 화학적 에너지를 전기 에너지로 바꾸 는 장치로서 바이오 연료전지는 연료를 산화시키는 촉매로서 미생물, 효소, 세포 소기관 등을 사용하는 장치를 말한다. 효소 반응을 이용한 바이오 연료전 지는 1964년 포도당과 포도당 산화효소를 각각 연료 와 촉매로 이용한 바이오 연료전지가 처음 보고된
이후, 심장 박동기와 같이 생체 내 이식하는 전기 장 치의 출력원으로 사용될 수 있다고 여겨져 많은 관 심을 받고 있다.
일반적으로 바이오 연료전지는 화학적 연료전지 에 비해 낮은 수준의 출력을 보인다. 포도당 산화 효 소를 이용한 바이오 연료전지가 처음 보고된 이후 지난 수십 년간 효소 반응을 이용한 바이오 연료전 지의 출력을 높이기 위한 여러가지 노력들이 있었다.
전자 전달 매개체를 도입하여 효소 반응이 일어나는 활성 부위와 전극간 전자 전달 효율을 높이거나, relay unit을 이용하여 효소의 redox center를 재구 성 하는 등의 여러 가지 시도들이 있었으며 최근 들 어서는 나노 물질을 이용하여 효소의 redox center 와 전극 표면을 직접 연결하는 등의 새로운 시도들 이 있었다. 이러한 노력들에도 불구하고 바이오 연 료전지의 낮은 출력은 여전히 실질적인 사용의 가장 큰 장애 요인으로 지적되고 있다. 필자는 바이오 연 료전지의 낮은 출력을 개선하기 위한 방안으로서 전 극 내 효소 고정화 양에 관심을 두었다. 비표면적이 넓은 나노 사이즈의 담체를 이용하면 고정화 할 수 있는 효소 양이 크게 증가하고, 이를 이용하여 연료 를 산화시키는 전극을 구성하면 효소 반응의 기질인 연료를 더 많이 더 빠르게 산화 시킬 수 있으므로 바 이오 연료전지의 출력이 개선될 것이라는 생각을 가 지고, 탄소 나노튜브에 포도당 산화효소를 고정화 그림 3. Current response of the tyrosinase/SWNT/polypyrrole
composite electrode (- - ) ascorbic acid (—) dopamine in air-saturated blank buffer.
그림 4. 포도당 산화효소를 이용한 바이오 연료전지.
한 후 전도성 고분자인 polypyrrole을 이용하여 3차 원 전극을 구성하였고 이를 포도당 연료전지 시스템 에 적용하였다.
그 결과 [표 1]에서 볼 수 있듯이 기존의 포도당 을 연료로 하는 바이오 연료전지가 단위 면적당 수 십 마이크로 와트 수준의 출력을 보인데 비해 상대 적으로 낮은 농도의 연료를 사용했음에도 불구하고 훨씬 높은 수준의 출력을 보임을 확인할 수 있었다.
출력이 증가함과 동시에 바이오 연료전지의 half-life 역시 크게 향상되었음을 확인할 수 있었는데, 이는 고정화 담체로 사용된 탄소 나노 튜브가 표면에 고 정화된 포도당 산화 효소간 활성 저하를 유발하는 unfavorable interaction을 저해하기 때문으로 확인 되었다(Langmuir 22:5833-5836).
4) 탄소계 나노 물질에 고정화된 효소를 이용한 생물 전환 공정
탄소계 나노물질에 고정화된 효소는 앞서 살펴본 bioelectronics 분야 이외에 특정 화학물질을 생산하는 생물 전환 공정에도 적용될 수 있다. 필자는 탄소 나노 입자에 고정화된 tyrosinase를 이용하여 전기 효소적 방법으로 L-DOPA(L-3,4-hydroxyphenylalanine)을 합성하는 공정을 개발하였다.
L-DOPA는 신경 전달물질인 dopamine의 전구 체로 dopamine과 달리 blood brain barrier를 통과 할 수 있기 때문에 파킨슨씨 병의 치료제로 사용된다.
현재 L-DOPA는 주로 asymmetrical hydrogenation 방법에 의해 생산되고 있다. 그러나 이 방법은 공정
이 복잡하고, 비싼 귀금속 촉매가 필요하며, 무엇보 다 전환율과 광학 선택성이 낮은 단점이 있어 그 대 안으로 최근 미생물을 이용한 공정과 효소를 이용한 공정이 연구되고 있다. 미생물을 이용한 L-DOPA 생산 공정에서는 tyrosine으로부터 pyruvate, ammonia, phenol 등을 전환할 수 있는 Tpl 활성을 지닌 미생물들을 배양하여 2차 대사 산물로 L- DOPA를 생산한다. 그러나 미생물을 이용한 공정은 미생물 성장에 필요한 탄소원을 지속적으로 공급해 주어야 하고, 미생물 배양에 필요한 시간까지 고려 하여 전체적인 운전 시간(10일 이상)이 길고, 배양 액으로부터 생산물을 분리, 정제하는 공정이 복잡하 며, 전환율 역시 낮다는 단점이 있다. 또 다른 대안 으로서 tyrosinase를 이용한 공정이 연구되고 있는 데, 앞서 언급했다시피 tyrosinase는 monophenol을
GOx-epHOPG MP-11-epHOPG Glucose (2 mM) 3.7 <6 1
Modified GC Modified GC Glucose (40 mM) 53.9 <14 2
GOx/SWNT/Ppy Tyrosinase/CNP/Ppy Glucose (1 mM) 157.4 29 3
1. Biosen. Bioelectron. 24:3103-3107 2. Electrochem. Comm. 9:989-996 3. Biotechnol. Bioprocess Eng. 15:371-375
표 1. 포도당 산화효소를 이용한 바이오 연료 전지의 성능 비교
Anode Cathode Fuel Power(μ W/cm
2) Half-life(h) Ref.
그림 5. 전기효소적 L-DOPA 합성.
hydroxylation하는 cresolase 활성을 가지고 있어 L- tyrosine을 L-DOPA로 전환시키지만 동시에 diphenol을 oxidation하는 catecholase활성을 가지고 있어 L-DOPA를 다시 DOPAquinone으로 산화시 키게 된다. 이러한 연속 산화를 막기 위하여 아스코 르브산, NADH, NH4OH과 같은 환원제를 사용하여 DOPAquinone을 L-DOPA로 다시 전환시키지만, 회분식 반응기에서는 시간이 지남에 따라 DOPAquinone을 재전환 시킬 수 있는 환원제 농도 가 낮아져 결국 DOPAquinone이 반응기 내부에 축 적되고, 전체적인 L-DOPA 생산 수율이 크게 향상 되지 못하는 단점이 있다. 필자는 기존의 효소 반응 에 의한 L-DOPA 생산 공정의 단점을 보완하기 위 하여 전극에서 공급되는 전자가 반응의 부산물인 DOPAquinone을 다시 L-DOPA로 환원시킬 수 있 다는 점에 착안하여 [그림 5]와 같은 전기 효소적 L-DOPA 생산 공정을 개발하였다.
보다 효율적인 전자 전달을 위해 tyrosinase가 고 정화된 탄소 나노 입자와 화학적 방법으로 중합된 polypyrrole을 이용하여 만든 전극을 cathode로 사 용하였으며 전극 내 탄소 나노 입자는 효소 고정화 담체이면서 동시에 전자 전달 매개체 역할을 할 것 으로 기대하였다. 결과적으로 [표 2]에서 알 수 있듯 이 전기 효소적 방법을 이용한 L-DOPA 생산 공정 은 기존의 방법들에 비해 매우 높은 전환율을 보임
을 확인할 수 있었고, 이는 tyrosinase의 catecholase 활성에 의해 L-DOPA가 DOPAquinone으로 산화 되는 속도에 비해 DOPAquinone이 cathode로부터 공급받은 전자에 의해 L-DOPA로 재전환되는 속도 가 훨씬 더 빠르기 때문인 것으로 밝혀졌다.
결론
지금까지 탄소계 나노 물질에 고정화된 효소를 바 이오 센서와 바이오 연료전지, 생물 전환 공정에 적 용하는 예를 살펴보았다. 탄소계 나노 물질은 비표 면적이 넓어 단위 면적당 효소의 loading density를 높일 수 있는 고정화 담체이면서 동시에 전기 전도 도가 높은 특성이 있다. 따라서 탄소계 나노 물질에 고정화된 효소와 전도성 고분자인 polypyrrole을 이 용하여 3차원 전극을 제작한 후 바이오 센서나 바이 오 연료전지에 적용했을 때, 민감도, 검출한계, 단위 면적당 출력 등의 성능이 크게 향상됨을 확인하였다.
또한 이 시스템을 전환 공정 중 한가지인 전기 효소 적 L-DOPA 생산 공정에 적용한 경우, 기존의 L- DOPA 생산 공정들이 가지는 한계점을 모두 극복 하고, 생산성과 전환율이 크게 향상되어 실제 산업 적 스케일로 L-DOPA를 생산할 수 있는 새로운 전 략이 될 수 있음을 확인하였다.
Asymmetrical 합성 44 1
Erwinia herbicola 배양 1800 7.34 2
고정화된 tyrosinase 이용 34 44.9 3
전기 효소적 방법 47.3 95.9 4
1. Catal. Comm. 5:641-634 2. J. Biotechnol. 114:303-306 3. Enzyme Microb. Tech. 22:261-268 4. J. Biotechnol. 146:40-44
표 2. 반응 유형에 따른 L-DOPA 생산성 및 전환율 비교
