미생물학적 원유회수증진을 위한 미얀마 저류층에서 분리한 토착미생물에 의한 표면장력 감소특성 연구
조정희1)· 이종운1)* · 김현태2)
Study on Surface Tension Decrease by Indigenous Bacteria isolated from Petroleum Reservoir of Myanmar for Microbial Enhanced Oil Recovery
Jeonghee Jo, Jong-Un Lee* and Hyun-Tae Kim
(Received 3 July 2014; Final version Received 25 February 2015; Accepted 26 February 2015)
Abstract : For application to MEOR (microbial enhanced oil recovery) technology, the ability of biosurfactants, which were produced by indigenous bacteria isolated from a crude oil reservoir in Myanmar, to decrease surface tension was investigated. When various carbon sources were supplied to the bacterial isolates, Bacillus spp., designated as BS1 and BS2, showed high biomass growth and decrease in surface tension under glucose supply.
Effect of pH and temperature on variation of surface tension was examined under the conditions of 100°C and pH 2, 4, 7, and 11. As a result, the biosurfactant produced by BS1 exhibited stable variation of surface tension, showing relatively low effect under various conditions. The biosurfactants produced by each bacterial isolate were separated and purified, and BS1 and BS2 produced the yield of biosurfactant of 0.51 g/L and 0.26 g/L. CMC value of biosurfactants produced by BS1 and BS2 were 2.0 g/L and 0.5 g/L, respectively.
Key words : Indigenous bacteria, Microbial enhanced oil recovery, Biosurfactant, Surface tension
요 약 : 미얀마 저류층에서 분리한 토착미생물이 생성하는 생물계면활성제의 표면장력 감소 능력을 조사함으 로써 미생물학적 원유회수증진 기술에 대한 적용 가능성을 살펴 보았다. 탄소원의 종류에 따른 미생물의 생장과 표면장력 변화를 측정한 결과, 포도당을 탄소원으로 공급하였을 떄 Bacillus spp.인 BS1과 BS2가 높은 성장률을 보였으며 표면장력을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 고온과 pH 요인이 표면장력 변화에 미치는 영향을 평가하 기 위하여 배양액에서 미생물을 제거한 후 100°C의 온도 및 다양한 pH 조건에 노출시킨 결과, BS1의 생물계면활 성제가 전반적으로 높은 희석비율에도 안정적인 표면장력 변화를 보여 상대적으로 외부요인의 영향을 적게 받는 것으로 나타났다. BS1과 BS2가 생성한 생물계면활성제를 추출, 정제한 결과 각각 0.51 g/L, 0.26 g/L이 얻어졌고 CMC 값은 각각 2.0 g/L, 0.5 g/L로 나타났다.
주요어 : 토착미생물, 미생물학적 원유회수증진, 생물계면활성제, 표면장력
1) 전남대학교 에너지자원공학과 2) 한국지질자원연구원
*Corresponding Author(이종운) E-mail; [email protected]
Address; Department of Energy and Resources Engineering, Chonnam National University, Gwangju, Korea.
ISSN 2288-2790(online) Vol. 52, No. 1 (2015) pp. 56-67, http://dx.doi.org/10.12972/ksmer.2015.52.1.056
서 론
원유는 점도가 매우 높을 뿐만 아니라 저류층 내 복잡 한 모세관 구조에 존재하고 있다. 따라서 자연 압력을 이 용하거나 물을 주입하여 밀어내는 1차, 2차 원유 회수기술 적용 후에도 원유회수율은 전체 매장량의 최대 40-50%에
불과하다(Sen, 2008). 최근 들어, 1, 2차 회수기술 적용 후 저류층에 남아 있는 원유를 회수하기 위한 석유회수 증진(이하 EOR: enhanced oil recovery) 기술 개발이 각 광받고 있다. 3차 회수법이라고도 불리는 EOR은 저류 층에 잔류하는 원유의 회수율을 증가시키는 기술로 열 적, 화학적, 물리적, 미생물학적 원리를 이용한 다양한 방법을 사용한다. 일반적으로 EOR 기술의 주된 원리는 저류층의 투수율을 증가시키거나 또는 저류층 내 잔류하 는 원유의 포화도 또는 점도를 낮추거나 원유와 물 사이 의 계면장력을 감소시키는 것이다.
EOR 기술 중 미생물을 이용한 석유회수증진(이하 MEOR:
microbial enhanced oil recovery) 기술은 미생물의 대사작 연구논문
용에 의해 생성된 계면활성제(surfactants), 중합체(polymers), 용매(solvents), 산(acids), 가스 등의 부산물을 이용하여 잔류 원유를 추출하는 기술이다. 미생물은 모든 저류층 에 토착(indigenous) 생물로서 흔하게 존재하고 있어 저 류층의 특성 변화 및 원유 회수에 쉽게 적용할 수 있다 는 장점이 있다(Bass and Lappin-Scott, 1997).
EOR에 적용되는 계면활성제는 석유 산업에서 중요한 역할을 하는 화합물이며 그 종류는 크게 화학적 계면활 성제(chemical surfactant)와 MEOR에 적용되는 생물계 면활성제(biosurfactant)로 분류할 수 있다(Banat, 1995;
Singh et al., 2007). 화학적 계면활성제는 석유화학 제품 을 원료로 하여 합성된 물질로써 활용도와 범위가 넓기 는 하나 대부분이 환경에 대한 독성을 가지고 있고 생분 해가 쉽게 이루어지지 않는 단점이 있다. 반면 생물계면 활성제의 경우 미생물, 동물, 식물과 같은 생물로부터 얻 어지는 계면활성물질로써 저독성이며 생태계에서 분해 가 용이한 장점이 있어 최근 주목을 받고 있다(Makkar and Cameotra, 1999; Soudmand-asli et al., 2007; Brown, 2010; Armstrong and Wildenschild, 2012; Castorena et al., 2012; Ibrahim et al., 2013; Sarafzadeh et al., 2013).
미생물이 생성하는 생물계면활성제 또는 계면활성물 질(surface active agent)을 이용한 EOR 기법은 상당한 비율의 잔류 원유를 회수할 수 있는 유망한 선진 공법이 다. 계면활성제는 서로 혼합되지 않는 유체의 계면에서 표면장력과 계면장력을 감소시키는 양친매성 화합물로 서, 소수성(hydrophobic) 또는 불용성 유기화합물의 용 해도와 이동도를 증가시킨다(Ron and Rosenberg, 2001;
Mulligan, 2005). EOR 기술에서 생물계면활성제는 저류 층 내 모세관에 잔존하는 석유의 추출을 용이하게 하고 고체 표면의 습윤성을 증가시켜 추진수 등의 이동을 향 상시킨다. 또한 저류층 내에서 미셀(micell) 용액을 형성 하여 석유의 점성과 유동점을 낮추고 석유와 암반/물 사 이의 계면장력을 감소시키는 역할을 한다(Singh et al., 2007; Sen, 2008; Lee, 2010).
해외의 경우 이미 실험을 통해 MEOR 기술의 현장 적 용 가능성을 확인하였으며 미국 Phoenix 유전(Bass and Lappin-Scott, 1997), 미국 오클라호마 Bebee 유전(Coates et al., 1993), 페루의 Providencia 유전(Maure et al., 2005) 등에 대한 상업적 이용을 목적으로 MEOR 현장 적용 실험이 활발하게 진행되고 있다. 반면 국내의 경우 MEOR에 대한 구체적 기술개발에 관한 연구는 매우 부 족한 실정이다.
이 연구에서는 저류층 내 서식하는 토착미생물(indigenous bacteria)을 분리하여 미생물 종을 파악하고 미생물 생장 의 최적 조건을 도출하였으며 그에 따른 미생물의 생물
계면활성제 생성 여부를 파악하였다. 또한 생성된 생물 계면활성제를 대상으로 안정성 실험을 실시하고 생물계 면활성제의 추출 및 정제를 통해 MEOR 기술 적용성을 평가하고자 하였다.
연구방법
토착미생물 분리 및 동정
토착미생물 분리를 위한 시료는 2013년 5월 3일 미얀 마 Mandalay 주 Ngashandaung 지역의 Salin 분지 RSF-3 육상광구(20°34’ N, 94° 39’ E)에서 시추한 심 도 1,800 ft(약 549 m)의 TEST1 공, 심도 1,700 ft(약 518 m)의 TEST2 공으로부터 배출된 슬러지를 채취하 였고, 채취된 슬러지를 대상으로 토착 호기성 미생물과 계면활성물질 생성균(biosurfactant-producing bacteria) 을 분리하였다.
호기성 미생물은 멸균된 5 mM HEPES 용액 50 mL에 젖은 슬러지 5 g을 넣고 1시간 동안 150 rpm으로 진탕 (shaking)한 후 부유물을 자연 침강시켜 그 상등액 0.1 mL을 토착미생물의 접종물(inoculum)로 하여 NA(nutrient agar) 배지에 접종하고 3～5일간 25°C에서 항온배양하 였다. NA 배지의 조성은 다음과 같다: beef extract 3.0 g/L, peptone 5.0 g/L, technical agar 15.0 g/L.
계면활성물질 생성균은 멸균된 MSM(minimal salt medium) 배지 200 mL에 TES(trace element solution, 2 mL/L)와 미생물의 탄소원(carbon source)으로서 원유 (crude oil; 2%, v/v)를 첨가하고 배지의 pH를 7.0으로 조절한 후 위에서 말한 HEPES 추출액을 접종물로 하여 주입하였다. 일반적으로 세포의 성장을 억제하는 NaCl 성분을 배지에 주입하여 NaCl 성분에 내성을 갖는 미생 물을 분리하고자 배지 내 NaCl을 30 g/L의 농도로 조정 하고 완성된 배양액은 28°C, 100 rpm 조건에서 7일간 배양하였다. 미생물의 활성도를 높이기 위하여 위와 같 은 과정을 5번 반복하며 계대배양을 실시하였다. 계대배 양이 끝난 후, MSM 배지에 technical agar(15.0 g/L)와 원유(2%, v/v)를 첨가하여 고체 배지를 조성하고 배양된 액체 0.1 mL을 도말하였다. 이 후 배지에 형성된 여러 집락(colony)들을 외형별로 분리하여 LB(Luria Bertani) 배지에 배양하였다. MSM 배지, TES, LB 배지의 조성 은 다음과 같다.
MSM: NaNO3 2.0 g/L, KCl 0.5 g/L, Na2HPO4·H2O 1.0 g/L, KH2PO4 1.0 g/L, CaCl2 0.025 g/L, MgSO4 0.1 g/L, FeSO4·7H2O 0.001 g/L TES: FeCl3·6H2O 60 mg/L, ZnSO4·7H2O 600 mg/L,
MnSO4·H2O 200 mg/L, CuSO4·5H2O 590 mg/L, CoCl2·6H2O 60 mg/L, H3BO3 150 mg/L, Na2MoO4·H2O 15 mg/L
LB: peptone 10.0 g/L, NaCl 5.0 g/L, yeast extract 10.0 g/L
배양된 토착미생물 중 선명하게 다른 집락 형태를 보 인 미생물들을 분리하여 고체 배지에서 계대배양을 계속 수행하였다. 분리된 미생물의 동정(identification)은 대 전광역시 (주)마크로젠 대전지사 미생물분석센터에 의뢰 하여 16s rRNA 기법으로 수행하였다. 16s rRNA gene의 PCR 증폭은 518F (5’-CCAgCAgCCgCggTAATACg-3’) 와 800R (5’-TACCAgggTATCTAATCC-3’)의 universal primer를 이용하였다.
Clustal W software (Thompson et al., 1994)를 이용 하여 분리된 미생물과 밀접한 관련이 있는 16s rRNA gene들과 정렬하였으며, MEGA software (Tamura et al., 2007)를 통해 phylogenetic tree를 도시하여 유전자의 계 통학적 관계를 확인하고자 하였다.
Phylogenetic tree는 neighbour-joining method를 사용 하여 추정하였으며, tree topology는 100번의 bootstrap resampling analyses에 의해 통계학적으로 평가되었다.
탄소원에 따른 미생물의 생장 및 표면장력 변화 저류층 내 존재하는 토착미생물의 탄소원에 따른 생육 촉진 조건을 파악하고 미생물 생장과정에서 생성되는 부 산물인 생물계면활성제(biosurfactant)가 표면장력에 미 치는 영향을 파악하고자 아래와 같은 실험을 실시하였다.
실험에 사용된 탄소원은 수용성 또는 불용성의 각종 탄소원, 즉 포도당(glucose), 헥사데케인(hexadecane), 벤 젠(benzene), 원유를 사용하였으며, 이들 각 탄소원을 공 급하였을 때 미생물의 생육 촉진에 미치는 결과를 비교, 분석하였다. 배지는 미생물 분리에 사용하였던 TES 함 유 MSM 배지를 이용하였으며, 500 mL 플라스크에 MSM 250 mL과 TES 2 mL/L를 넣고 위에서 말한 각 탄소원(2%, w/v 또는 v/v)을 주입하였다. 이후 조성된 배지에 분리된 미생물을 접종하고 34°C, 120 rpm에서 96시간 동안 배양하였다. 각 탄소원에 따른 미생물의 생 장 여부는 UV-vis spectrometer (Shimadzu UV-MINI- 1240, Japan)를 이용하여 600 nm의 흡광도 조건에서 광 밀도(optical density)를 측정하여 판단하였다. 시료 채취 는 24시간 마다 실시하였고 모든 실험은 중복실험을 실 시하였다.
미생물의 대사산물인 생물계면활성제에 의한 표면장 력 변화는 배양액에서 원심분리(10,000 rpm, 4°C, 15분)
를 통하여 균체를 제거한 후, Du Nouy Ring 방법에 따 라 백금 링을 이용한 표면장력계(surface tensiometer; Itoh Seisakusho, 514-B2, Japan)를 사용하여 측정하였다(Bodour and Miller-Maier, 1998).
외부요인이 표면장력 변화에 미치는 영향
MEOR 기술을 적용하기 위해서는 미생물의 생장에 적합한 환경조건을 파악하는 것이 필수적인 요소이다.
저류층의 경우 온도와 압력 등의 물리적 요인과 pH 등 의 화학적 요인이 존재한다. 이러한 요인들은 미생물의 효소작용 및 대사작용 또는 생리적인 측면에 영향을 미 칠 수 있고 미생물이 분비하는 생물계면활성제의 기능을 저하시킬 가능성이 있다. 이러한 외부 요인에 대한 미생 물 생성 생물계면활성제의 안정성을 간접적으로 파악하 기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
pH 요인
탄소원에 따른 미생물의 생육촉진 조건 파악 실험 결 과, 생물계면활성제를 생성하여 표면장력을 감소시킨 미 생물을 대상으로 실험을 수행하였다. 배지는 위와 동일 한 MSM에 TES를 추가 주입한 배지를 사용하였고, 탄 소원은 가장 높은 미생물 생장률을 보인 포도당(2%, w/v) 을 사용하였다. 미생물 접종 후 34°C, 120 rpm 조건에서 96시간 동안 배양하였다.
96시간 배양 후 5 N HCl과 NaOH를 이용하여 배양액 의 pH를 각각 2, 4, 7, 11로 조절하였으며, pH가 조절된 시료를 서로 다른 희석비율로 희석 후 표면장력 값을 측 정하여 생물계면활성제에 미치는 pH의 영향을 확인하고 자 하였다.
온도 요인
pH 변화에 따른 표면장력 변화 실험과 동일한 미생물 을 대상으로 온도 요인에 의한 표면장력 변화 실험을 수 행하였다. 배지와 배양조건은 위에서 말한 pH 실험과 동 일하게 수행하였다. 96시간 배양 후 배양액을 100°C에 서 5분, 10분, 20분, 30분, 60분 동안 중탕시킨 후 상온 에서 식혀 다양한 희석비율로 희석 후 표면장력을 측정 하였다. 이 실험을 통해 생물계면활성제가 다양한 시간 동안 고온의 영향을 받았을 때 표면장력의 변화에 어떠 한 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
생물계면활성제 추출 및 정제
생물계면활성제는 독성이 낮고 환경친화적인 장점이 있는 반면, 높은 생산비용 때문에 실질적으로 사용하는 예는 드문 실정이다(Desai and Banat, 1997). 표면장력
(a) (b)
(c) (d)
Fig. 1. Process of biosurfactant extraction; (a) under pH not adjusted (left) and pH 2 (right), (b) biosurfactant precipitation after centrifugation, (c) extraction of biosurfactant by solvent, and (d) dried biosurfactant.
감소를 유도한 미생물의 대사 부산물이 생물계면활성제 인지의 여부를 파악하기 위하여 아래와 같은 추출 및 정 제 과정을 거쳤다.
MSM 배지에 TES와 포도당(2%, w/v)을 주입하고 표 면장력을 감소시킨 미생물 종을 접종한 후 34°C, 120 rpm 조건에서 96시간 동안 배양하였다. 배양된 배지를 원심분리(10,000 rpm, 4°C, 15분)하여 미생물을 제거한 후 상등액을 분리하였다. 원심분리된 상등액에 HCl을 가하여 pH 2로 조절한 후 4°C에서 12시간 동안 방치하 였다. 이후 생성된 침전물을 다시 원심분리(10,000 rpm, 4°C, 15분)하여 배지와 생물계면활성제를 완전히 분리 하였다. 상등액 분리 후 남은 침전물은 증류수를 이용하 여 세척한 후 증류수에 녹아있는 생물계면활성제를 용매 (chloroform : methanol = 65 : 15)를 이용하여 추출하였다.
분액깔때기를 이용하여 하부층(chloroform 층)을 취하여 동결건조한 후 침전물의 질량을 측정하였다(Fig. 1).
임계미셀농도(Critical micelle concentration) 생물계면활성제와 같은 양친매성 화합물은 용액 내 화 합물의 농도가 희석되어 일정 농도에 도달하면 그 후 표 면장력이 급격히 증가하기 시작한다. 표면장력이 급격히
증가하는 시점의 생물계면활성제의 농도를 임계미셀농 도(이하 CMC: critical micelle concentration)라고 하며, 이는 생물계면활성제의 효과를 평가하는 지표로 활용할 수 있다.
CMC는 측정된 표면장력 값에 대한 생물계면활성제의 농도를 대수(logarithm)로 변환할 때 나타나는 추세선의 교점으로 확인할 수 있다(Sheppard and Mulligan, 1987).
동결건조를 통하여 추출된 생물계면활성제를 0.001～10 g/L 범위의 다양한 농도로 phosphate-buffer saline(PBS:
10mM KH2PO4/K2HPO4 and 150mM NaCl with pH adjusted to 7.0)에 용해시킨 후, 용액의 표면장력을 측정 하여 CMC를 확인하였다.
결과 및 해석
토착미생물 분리 및 동정
호기성 조건에서 NA 배지와 MSM 배양액을 사용하 여 토착미생물을 분리 및 동정한 결과를 Table 1에 나타 내었다. 이 때 Table 1에서 괄호 안의 명칭은 후속 실험 을 위하여 임의로 부가한 것이다.
배양 결과, NA 배지에서 성장한 호기성 미생물은 11종,
Table 1. Indigenous bacteria isolated from the crude oil production sludge
Growth media Isolated bacteria
Nutrient agar medium
Acinetobacter sp. Agromyces sp.
Arthorobacter sp. Bacillus sp. (BS3)
Brevibacillus sp. Dietzia sp.
Kocuria sp. Microbacterium sp.
Paenibacillus sp. Pseudomonas sp. (PS1) Pseudomonas sp. (PS2)
Minimal salt medium Bacillus sp. (BS1) Bacillus sp. (BS2)
Pseudomonas sp. (PS3)
Fig. 2. Phylogenetic trees of the isolated Bacillus spp. (upper) and Pseudomonas spp. (lower) based on 16s rRNA sequencing analysis.
Table 2. Growth of bacterial isolates and reduction of surface tension on different carbon sources after a period of 96-h culture
Bacteria Carbon sources Surface tension (dyn/cm) Optical density (at 600 nm) BS1
Glucose
43.5 ± 1.4 1.156 ± 0.015
BS2 36.8 ± 0.4 0.318 ± 0.128
BS3 70.8 ± 1.1 0.150 ± 0.005
PS1 69.0 ± 1.4 1.411 ± 0.129
PS2 70.8 ± 0.4 1.429 ± 0.033
PS3 68.8 ± 1.1 1.498 ± 0.122
BS1
Hexadecane
66.3 ± 1.1 0.095 ± 0.001
BS2 50.0 ± 2.8 0.278 ± 0.043
BS3 69.8 ± 0.4 0.255 ± 0.008
PS1 58.5 ± 0.7 0.129 ± 0.024
PS2 66.0 ± 0.0 0.118 ± 0.050
PS3 67.3 ± 0.4 0.095 ± 0.010
BS1
Benzene
74.3 ± 1.1 0.177 ± 0.017
BS2 35.3 ± 2.5 0.252 ± 0.067
BS3 71.5 ± 0.7 0.040 ± 0.001
PS1 69.0 ± 1.4 0.017 ± 0.002
PS2 70.3 ± 0.4 0.022 ± 0.011
PS3 71.5 ± 0.0 0.022 ± 0.001
BS1
Crude oil
60.5 ± 1.4 0.100 ± 0.006
BS2 58.5 ± 2.1 0.157 ± 0.037
BS3 64.5 ± 0.0 0.154 ± 0.034
PS1 60.8 ± 1.1 0.112 ± 0.017
PS2 63.0 ± 2.8 0.132 ± 0.011
PS3 63.0 ± 2.8 0.355 ± 0.025
원유를 첨가한 MSM 배지에서는 3종, 도합 14종의 슬러 지 내 토착미생물이 분리되었다. 분리된 미생물 중 Pseudomonas spp.와 Bacillus spp.가 각각 3종으로 가장 많이 분리되었다. 미생물 동정 결과 Pseudomonas spp.
의 PS1과 PS2는 Pseudomonas stutzeri와 99%, PS3은 Pseudomonas balearica와 98% 일치하는 것으로 나타났 으며, Bacillus spp.의 BS1과 BS2는 Bacillus subtilis와 99%, BS3은 Bacillus megaterium과 99% 일치함을 보였 다. Pseudomonas spp.와 Bacillus spp.의 계통수(phylogenetic tree)는 Fig. 2와 같다.
Pseudomonas spp.와 Bacillus spp.의 경우, 일반 자연 환경에 널리 존재하는 미생물로서 생물계면활성제를 생 성하여 표면장력을 감소시키는 작용을 한다고 보고된 바 있다(Pornsunthorntawee et al., 2008). 이 연구에서도 Pseudomonas spp.(PS1, PS2, PS3)와 Bacillus spp.(BS1,
BS2, BS3)를 대상으로 하여 미생물 생장촉진 조건 및 미생물에 의한 표면장력 감소 여부를 파악하였다.
탄소원에 따른 미생물의 생장 및 표면장력 변화 다양한 탄소원의 공급이 미생물의 생장 및 표면장력의 변화에 미치는 영향을 확인하였다. 96시간까지 미생물 을 배양한 후 미생물의 생장과 표면장력의 변화를 측정 한 결과를 Table 2에 나타내었다.
96 시간 경과 후, 초기 73.5 dyn/cm이었던 표면장력은 대부분 50 dyn/cm 이상으로 여전히 높은 값을 보였으나, BS1은 탄소원으로 포도당을 주입한 시료에서 43.5 dyn/
cm의 낮은 표면장력 값을 나타내었다. 또한 세균 생장의 경우에도 대부분의 경우 0.355 이하의 낮은 광밀도 값을 보였으나, 포도당을 공급받은 BS1은 광밀도 1.156으로 높은 생장률을 나타내었다. 같은 Bacillus sp.인 BS2의
(a)
(b)
(c)
Fig. 3. Variations in cell growth and surface tension of (a) BS1, (b) BS2, and (c) BS3 over a period of 96-h culture when supplied with various carbon sources (solid: surface tension, open: cell growth;
diamond: glucose, square: hexadecane, triangle:
benzene, circle: crude oil).
경우 포도당과 벤젠을 탄소원으로 이용하였을 때 각각 36.8 dyn/cm, 35.3 dyn/cm의 낮은 표면장력 값을 보였 다. 반면 다양한 탄소원을 공급받았을 경우 광밀도는 0.157～0.318로 나타나 다른 것들과 큰 차이를 보이지
않았다. BS3은 BS1, BS2와 비교하였을 때 뚜렷한 표면 장력 감소를 보이지 않았다(Fig. 3).
포도당을 탄소원으로 주입하였을 때 높은 표면장력 감 소율을 보인 BS1과 BS2는 최초 73.5 dyn/cm의 표면장 력에서 96시간 경과 후 각각 43.5 dyn/cm, 36.8 dyn/cm 를 나타내어 40.8～49.9%의 표면장력 감소율을 보였다.
이는 미생물에 의해 생성된 생물계면활성제가 배지의 표 면장력을 감소시키는 효과를 유도한 것으로 판단된다.
Pseudomonas spp.의 경우 PS1, PS2, PS3 모두 탄소 원으로 포도당을 주입하였을 때 다른 탄소원에 비하여 월등히 높은 미생물 생장을 보여(1.411～1.498) 포도당 을 산화하며 생장에 필요한 에너지를 효과적으로 얻는 것을 알 수 있었으나, 반면 표면장력 감소는 뚜렷하게 나 타나지 않은 것을 확인하였다(Fig. 4). 이는 실험에 사용 한 Pseudomonas spp.가 포도당을 영양분으로 효과적으 로 이용하기는 하나, 그 대사산물로서 생물계면활성제를 거의 생성하지 않기 때문으로 여겨진다.
이상의 결과를 바탕으로 하여 Bacillus spp.인 BS1과 BS2를 후속 실험의 대상으로 선정하여 생물계면활성제 의 특성 평가 실험을 진행하였다.
외부요인이 표면장력 변화에 미치는 영향
적정 탄소원 실험을 통해 생물계면활성제를 생성하는 미생물을 파악하고 표면장력의 감소를 관찰한 결과, 6종 의 미생물 중 BS1과 BS2가 생물계면활성제의 생성 가 능성이 확인되었다. 이를 대상으로 pH 및 온도 등 외부 요인이 표면장력 변화에 미치는 영향을 파악하였다.
pH 요인
96시간 동안 미생물을 배양한 후 배양액의 pH를 다양 하게 변화시키고 희석비율을 달리하여 배양액의 표면장 력을 측정하였다. BS1의 경우 pH 2, pH 4, pH 7, pH 11로 조절된 시료의 표면장력은 일정 희석비율에 도달 할 때까지 급격한 증가를 보이지 않았다(Fig. 5(a)). 특히 pH 2 또는 pH 11 등의 강한 산성이나 알칼리 조건에서 도 생물계면활성제에 의해 감소된 표면장력의 증가가 pH 7인 중성 조건의 표면장력 증가와 큰 차이를 보이지 않아 넓은 범위의 pH 조건에 영향을 크게 받지 않은 생 물계면활성제인 것으로 판단된다.
반면, BS2의 경우 pH 2, pH 4, pH 7, pH 11로 조절된 시료의 표면장력은 낮은 희석비율에도 급격한 증가를 보 였다(Fig. 5(b)). 이는 pH 변화에 표면장력을 감소시키는 생물계면활성제가 그 능력을 쉽게 잃어 표면장력의 증가 를 불러 일으켰음을 나타낸다. 위에서 기술한 다양한 탄 소원 실험에서 포도당을 공급하였을 때, BS2는 BS1에
(a)
(b)
(c)
Fig. 4. Variations in cell growth and surface tension of (a) PS1, (b) PS2, and (c) PS3 over a period of 96-h culture when supplied with various carbon sources (solid: surface tension, open: cell growth;
diamond: glucose, square: hexadecane, triangle:
benzene, circle: crude oil).
(a)
(b)
Fig. 5. Effect of pH on variation of surface tension (a: BS1, b: BS2).
비하여 높은 표면장력 감소율을 보였으나(BS1: 43.5 dyn/cm, BS2: 36.8 dyn/cm), 증류수 희석에 의해 표면장 력이 쉽게 증가하는 것으로 나타나 BS1이 생성한 생물 계면활성제에 비하여 그 능력과 안정성이 부족하며
MEOR 기술 적용에는 적합하지 않을 것으로 판단된다.
온도 요인
다양한 시간 동안 고온의 환경에 노출되었을 때 표면 장력 변화를 확인하기 위하여, 채취한 배양액을 100°C 의 물에 5분, 10분, 20분, 30분, 60분 동안 중탕한 후 희 석비율을 달리하여 표면장력을 측정하였다. BS1의 경우 5분, 10분, 20분, 30분, 60분 동안 중탕한 시료의 경우 고온에 노출 시간이 길수록 낮은 희석비율에서 표면장력 이 급격하게 증가하는 부분이 발생하는 결과를 보였다 (Fig. 6(a)). 특히 모든 조건에서 희석배율이 증가함에 따 라 표면장력이 점진적으로 증가하는 경향을 볼 수 있었 으며, 이는 pH 변화에 비하여 고온 조건이 생물계면활성 제의 능력을 한층 쉽게 감소시키는 요인임을 나타내는 것으로 판단된다.
BS2의 경우 모든 시료가 고온의 외부 온도에 노출되 는 순간 생물계면활성제의 능력이 소멸되어 급격한 표면 장력의 증가를 유도하였다(Fig. 6(b)). 이는 pH 요인 실 험에서 나타난 것과 동일하게 BS2의 경우 생물계면활성
(a)
(b)
Fig. 6. Effect of high temperature (100°C) on variation of surface tension(a: BS1, b: BS2).
(a)
(b)
Fig. 7. Effect of the biosurfactant concentration on the PBS surface tension. (a) Surface tension of the crude biosurfactant from BS1 dissolved in PBS at different concentration. (b) Surface tension versus logarithm of biosurfactant concentration.
제의 안정성이 BS1에 비하여 많이 떨어짐을 나타내는 것이다.
생물계면활성제 추출 및 정제
표면장력 감소율이 높은 BS1과 BS2 그리고 표면장력 감소가 일어나지 않은 BS3을 대상으로 하여 생물계면활 성제를 추출하였다. 최종적으로 동결 건조된 생물계면활 성제의 질량을 측정한 결과, BS1 0.51 g/L, BS2 0.26 g/L의 수율을 얻었으며 표면장력 감소가 발생하지 않은 BS3은 생물계면활성제가 검출되지 않았다.
이상에서 보여진 미생물 생장속도, 표면장력 감소 능 력, pH 및 고온 노출 시간에 대한 안정성, 생물계면활성 제 생산량 등의 결과로부터 BS1이 MEOR에 적용하기 에 매우 유망한 미생물인 것으로 판단된다.
임계미셀농도(Critical micelle concentration) 저류층에서 분리된 Bacillus spp. 2종(BS1, BS2)에 의 해 생성된 각각의 생물계면활성제 농도와 농도에 따른 표면장력 사이의 관계를 파악하여 CMC를 측정하였다.
동결 건조된 생물계면활성제를 PBS(phosphate-buffer saline) 에 0.001～10 g/L 범위의 농도로 용해시킨 후 표면장력 을 측정하였다.
BS1에 의한 생물계면활성제의 경우, 농도에 따라 표 면장력이 점진적으로 증가하는 것이 확인되었다(Fig.
7(a)). 생물계면활성제의 농도를 대수(logarithm)로 변환 한 결과, 2.0 g/L의 생물계면활성제 농도에서 추세선의 교점이 나타났다(Fig. 7(b)). 이를 통해 BS1에 의한 생물 계면활성제의 CMC는 2.0 g/L로 확인되었다. BS2에 의 한 생물계면활성제의 경우, BS1과 마찬가지로 표면장력 이 점진적으로 증가하였으나(Fig. 8(a)), 대수 변환 결과 0.5 g/L에서 CMC 값을 보였다(Fig. 8(b)).
CMC 측정 결과 BS1에 의한 생물계면활성제가 BS2 보다 높은 CMC 값을 보여 상대적으로 안정한 생물계면 활성제로 확인되었다.
(a)
(b)
Fig. 8. Effect of the biosurfactant concentration on the PBS surface tension. (a) Surface tension of the crude biosurfactant from BS2 dissolved in PBS at different concentration. (b) Surface tension versus logarithm of biosurfactant concentration.
결 론
MEOR 기술의 효과적 적용을 위하여 저류층 내 토착 미생물을 분리하였으며 이들을 대상으로 생장촉진 조건 과 미생물에 의해 생성된 생물계면활성제의 존재 여부와 특성 등을 파악하였다.
미얀마 Ngashandaung 지역의 Salin 분지 RSF-3 육상 광구에서 채취한 슬러지 시료를 이용하여 호기성 조건하 에서 Bacillus spp. 3종(BS1, BS2, BS3), Pseudomonas spp. 3종(PS1, PS2, PS3)을 포함하는 총 14종의 균주를 분리하였다. 분리된 14종의 미생물 중 표면장력 감소 효 과가 이미 보고된 바 있는 Bacillus spp.와 Pseudomonas spp.를 선택하여, 탄소원에 따른 미생물의 생장과 표면 장력 변화를 측정하여 각 미생물의 생육촉진 조건과 생 물계면활성제 생성 여부를 조사하였다. 실험 결과, BS1 과 BS2에 탄소원으로 포도당을 주입한 경우 활발한 생
장이 발생하였고 각각 43.5 dyn/cm, 36.8 dyn/cm의 낮 은 표면장력을 보였다. 이는 기존의 화학합성 계면활성 제의 표면장력이 25～50 dyn/cm의 값을 나타낸다는 점 을 감안할 때 효과적인 계면활성 능력이라고 할 수 있다 (Kim et al., 1995).
표면장력을 감소시킴으로써 생물계면활성제 생성균으 로 간주되는 BS1과 BS2를 대상으로 하여 다양한 pH와 고온(100°C) 노출 시간 조건 하에서의 생물계면활성제 에 의한 표면장력 변화를 관찰한 결과, BS1의 표면장력 의 변화가 BS2에 비해 점진적으로 증가하는 결과를 보 여 외부 영향을 적게 받는 것으로 나타났다. 또한 생물계 면활성제를 직접 추출하였을 때에도 BS1(0.51g/L)이 BS2(0.26 g/L)보다 단위 배지 부피당 향상된 수율을 나 타내었다. 각각의 생물계면활성제의 CMC 값이 BS1 2.0 g/L, BS2 0.5 g/L의 값을 보여 BS1에 의한 생물계면활 성제가 상대적으로 높은 안정성을 가진 생물계면활성제 인 것으로 판단된다. 이러한 결과와 미생물 생장속도 및 표면장력 감소 능력 등을 종합적으로 감안할 때 BS1이 MEOR에 효과적으로 적용할 수 있는 미생물인 것으로 판단된다.
BS1과 BS2는 99% 신뢰도에서 모두 Bacillus subtilis 종이며 실험에 사용된 다른 3 가지의 종(Pseudomonas stutzeri, P. balearica, B. megaterium)에 비하여 한층 향 상된 표면장력 감소 능력을 보이는 것으로 나타났다. 한 편 같은 종임에도 불구하고 BS1이 BS2에 비하여 더욱 효과적인 결과를 유도하였는데 이는 아종(subspecies) 단계에서 두 미생물의 능력이 확연히 구별될 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서 추후 효과적인 MEOR 기술 적 용을 위해서는 저류층의 토착미생물에 대한 세밀한 접근 이 필요한 것으로 보인다.
사 사
이 연구는 2013년 한국지질자원연구원의 ‘BT/NT 융 복합 석유가스 증진회수 기술 개발’ 사업의 지원에 의해 수행되었다.
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조 정 희
2010년 전남대학교 공과대학 지구시스 템공학과 공학사
2012년 전남대학교 대학원 에너지자원 공학과 공학석사
현재 전남대학교 대학원 에너지자원공학과 박사과정 (E-mail; [email protected])
김 현 태
현재 한국지질자원연구원 석유해저자원연구부 책임연구원 (本 學會誌 第51券 第6号 參照)
이 종 운
1988년 서울대학교 공과대학 자원공학 과 공학사
1990년 서울대학교 대학원 자원공학과 공학석사
1997년 서울대학교 대학원 자원공학과 공학박사
현재 전남대학교 에너지자원공학과 교수 (E-mail; [email protected])
