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돼지난자의 체외성숙시 catalase와
xanthine
사이의 관계사수진
·
박춘근·
정희태* 양부근·
김정익강원대학교 동물자원학부， 강원대학교 수의학과*
Relationships between xanthine and catalase on in-vitro maturation in procine oOcytes.
S. J. Sa . C. K. Park . H. T. Cheong* . B. K. Yang and C. 1. Kim
Division of Animal Resource , Department of Veterinary Medicine*
Kangwon National University
ABSTRACT
The objectives of the present study were to examine the relationship between catalase and xanthine on the in vitro maturation of porcine oocytes. In oocytes cultured in medium with cata1ase and/or xanthine for 3 h , the proportions of GV-IV to GV-VI stages were higher in medium with none (61%) , catalase (53%) and catalase+xanthine (53%) than in medium with xanthine (42% ), The proportions of oocytes matured to M - II stage were significantly (P<0.05) higher in medium with contr ’ 01 (72%) , cata1ase (73%) or catalase+xanthine (70%) than in oocytes cultured with xanthine (54% ), The highest proportions of oocytes matured to M - II stage in medium with xanthine were obtained at 48 h of culture. The rates of degenerated oocytes were increased with culture periods , and were higher in medium without than with catalase. At 72 h of culture , the parthenogenetic oocytes were observed and increased with culture periods prolonged. At 48 h of culture , the proportions of oocytes matured to M - II stage were also higher in oocytes with than without cumu1us cells in medium with control (46 vs 23% , P<0.05) , catalase (39 vs 27%) , xanthine (33 vs 29%) and cata1ase+xanthine (49 vs 31 %), respectively. These results suggested that culture system with cata1ase and xanthine has beneficial effects on maturation of porcine oocytes in vitro.
Key words Porcine , oocyte maturation , catalase , xanthine , cumulus cells
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1 .
서 론산소는 생명체가 생명을 유지하기 위해서 없어서는 안될 존재로서 매우 소중한 것임에 틀림없다. 그러나， 산소는 생명체에게 제공하 는 그 유익성 이외에 세포의 과산화를 일으 걱 생명체에 악영향을 끼치는 양면성을 가지 고 있다. 1897년 최초로 산소에 의한 독성이 주장 (Bert， 1897) 된 이래로 1954년에 산소의 독성에 의한
free radical
이론이 대두되었다(
Gerschman과Fenn , 1954).
활성산소와 관련 된free radical
이론은 노화， 발암 등과 같은 많은 질환과 생체내 지절 및 단백질 등 주요 물질의 변성， 파괴의 원언을 셜명하는데 많 이 이 용되 어 왔다 (Gerschman，1981: Stadtman
과
Oliver , 1991: Liver
등，1991: Scott , 1980 ),
대 표적 인free
radical의 종류에 는superoxide anion(Oz-). hydroxyl radicalCOH) , singlet
oxygen(-Oz) 있다 (Haber와
Weiss , 1934: Merrill
등，
1981:
Misra와Fridovich , 1972).
이 러 한free
radical에 의해 일어나는 여러 가지 생체내 반응에는 세포 또는 세포 소기관의 막지 질 과산화에 의 한
microsome , mitochondria
등의 소기관 손상， 효소 단백질 중의 아미노 산 잔기의 산화를 통한 비가역적 불활성화，
핵산염기의 변형 빛 산화적 분해 절단을 통 한 손상， 생체 내로 첨입한 병원체에 대한 대식구의 방어과정에서 생겨나는 주위 조직 의 손상， 그리고
DNA
손상에 의한 세포의 암화 등이 있다(Clement
등，1985: Drew
등，1964:
Rueckert와Mueller , 1960).
이 와 같 이 일 반적 으로
free
radical의 생 성 과 antioxidant의 방어력 사이에 장해가 생겨 셰포손상을 일으키는 것을oxidative stress
상태 라고 하며, oxidative
stress는antioxidant
의 결 핍 이 나
free
radical의 양 이antioxidant
의 방어력 이상으로 많이 생성되었을 때 일 어날 수 있다 (Sies，
1985 ),
배양의 시스템에서 가스환경은 중요한 구 성요소중 하나이며， 일반적으로
5% COz , 95%
산소에서 배양을 실시한다 (Liu 등，1990.
난관내 의 산소농도는 대 기 중의 산소농도에 비 해 약 113정 도를 차지 한다( Fischer와
Bavister ,
1993 ),
높은 산소압력에서 배양된 수정란은 더 많은free
radical을 생 성 하게 되 고， 이 것 은 수정란의 발육에 악영향을 미치며， 산소 의 압력을 5~8%로 감소시키면 배반포 발달 율은 증가한다 (Li와 F~ote，1993 ), Free radical
의 작용은
superoxide dismutase , catalase ,
taurine
등과 같은 효소에 의해서 억제될 수있 다.
Superoxide dismutase , catalase , taurine
등은
free
radical의 제 거 제 로 작용하며,
소 수정 란의 체 외 발윤시 유용한 효과를 나타내 는 것으로 밝혀졌다 (Liu 등，1995).
그리고，superoxide
dismutase는 돼 지 의 체 외 성 숙과 수정시 유효한 영향을 미치는 것으로 밝혀졌 다 (Park 등，1997).
이와같이 superoxide dismutase와 난자발육의 유효성 사이의 상관 성은 보고되었으나 돼지난자의 체외성숙시 catalase의 작용은 아직 명 확히 밝혀 지 지 않 았다. 따라서， 본 연구의 목적은 돼지난자의 체외성숙시 항산화제인 catalase와 활성산소인
xanthine
사이의 관계를 검토하기 위해수행하였다.
ll.
재료 및 방법1.
난자의 준비실험에 공시한 난포란은 품종에 구분없이 도축 직후의 암돼지로부터 적출한 난소에서
m
ω[Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:29 PM
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채취하였다. 도축장에서 도살 직후 회수한 난소를 30~3tc 의 생리식염수(NaCl，
0.9%w/v penicillin 100.000 IU IL streptomycin 100 mg/L and amphotericin B
250μg/LSigma)
내에 넣어 2~3시간 이내에 실험실까지 운반 하였다. 난포의 발달이 잘된 난소를 선택하 여 생리식염수로 3~4회 셰척한 후 난포란을 채취하기 위하여 18-gage의 주사침이 장착된
10ml
주사기로 2~6mm 직경의 포상난포를연속적으로 찔러 난포액과 함께 난포란을 흡 엽하여
Test
tube에 넣어 20~30분간 그대로 두어 침전시킨 후 침전물만을 빼내어 페트리 디쉬 (petri dish) 내에서 기본배양액과 희석한 후 실체현미경하에서 난구셰포가 완전하고 세포질이 균일한 난자를 분리하였다. 채취한 난자는Hepes-buffered Tyrode ’ s medium(TLH)
에서 3 회.
maturation
medium 에서 1 회 세척 한 후.ma tura tion drop ( 50 t1 1 ) 내 에 107B
씩 의 난자를 넣은 다음mineral
oil로 덮고.5%
C02. 39
0c
배양기내에서 배양하였다.2.
체외성숙배양액본 실험에서 이용된 기본배양액은
TCM-199
에
3.02mM glucose. 2.5mM Ca-Iactate.
2.2mM Hepes. 0.2mM Na-pyruvate. 10%
fetal calf serum ( F CS).
50때 Imlgentamycin.
1μg/ml
FSH.
5μg/mlLH.
1μg/mlestradiol 17 (3
와10%(v/v)
돼지 난포액을 첨가한 것 이 이용되었다.3.
난자의 체외성숙배양실험
1 :
난자를 배양하는 동안ca talase (0 .1
mg/mD 와xanthine(
O.7mg/mD 의 첨가가GV 기 핵형의 발달에 미치는 영향을 검토 하기 위하여 무첨가구.
catalase. xanthine
또는
ca talase + xan
thine 이 첨가된 배 양액내 에 난자를 넣어O
또는 3시간동안 배양한 후 난자의 GV기 핵형을 관찰하였다.실 험
2 :
체 외 성 숙시catalase
빛 xanthine의 첨가가 돼지난자의 성숙에 미치는 영향을 검토하기 위해서 체외성숙 배양액내에O .1 mg/ml
catalase와0.7mg/ml
xanthine을 단독 또는 동시첨가한 다음 채취한 난자를 넣은 후5% C02. 39
0c
배 양기 내에서48
시간동안 배양한 다음 난자의 성숙상태를 관찰하였다. 난자의 배 양시 hormone은 배 양 전반기 24시간 동안에만 첨가하였으며，
배양 후반기 24시간 동안에는 제거하였다.
실험
3 :
xanthine 이 첨가된 배양액내에서 난 자를 체외성숙시킬 경우 catalase의 첨가가 난자에 어떤 영향을 미치는지를 검토하기 위 해 서xanthine
또는xanthine + ca talase
medium 에 서
48. 72. 96
벚 120시 간 동안 배양하면서 난자의 성숙율， 퇴행율 벚 단 위 발생 율 등을 관찰하였다.실험
4 :
난자의 체외성숙시 난구세포의 유 무와ca talase (O.1 mg/mD
빛xanthine( 0 .7
mg/mD 의 첨가가 어떤 영향을 미치는지 검토하기 위해서 난구세포 제거 또는 부착 란을 무첨 가구 catalase.
xanthine
벚ca talase + xan thine
첨 가구에 서 48시 간 동안 배양한 후 성숙율을 관찰하였다.4.
난자의 고정 및 관찰난자의 성숙배양 실험후
l%(w/v) hyalur-
m m
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onidase를 이용하여 난구세포를 제거한 뒤 기본배양액으로 2~3회 세척한 다음
slide
glass위 에 고정 하여
acetic
acid와 ethanol을1
:3으로 혼합한 고정액에 2~3 일간 고정하였 다. 그 뒤
1 %( w/v)
orcein으로 염색하여 위 상차현미경을 통해 난자의 성숙상태를 관찰 하였 다. 난자의 성 숙단계 는germinal
~esicle ( G V) , prophase H P- 1), metaphase H M - 1), anaphase I( A - 1), telophase I( T- 1)
과metaphase
IHM-II) 로 분류하였으며， GV단계에서의 핵 형변화의 단계는 총 6단계로 분류하였는데，
GV-I 은 하나의 핵만이 보이는 상태이고，
GV-II는 핵막과 핵소체가 보이는 시기，
GV-III는 핵주위에 섬유상 염색칠 덩어리가 분포하는 시 기
,
GV-IV는 핵 소체 가 사라지 는 시기， GV-V는 염색질의 응축이 얼어나는 시 기， GV-VI는 응축된 염색질 덩어리와 핵막이 존재하는 시기로 구분하여 나타내였다.
ID. 결 과
Table
1은 0시 간과 3시 간 동안 난자를 배 양하는 동안 GV기 핵형의 발달에 있어서 catalase와 xanthine의 영 향을 나타냈 다. 0시 간 배양의 경우 초기단계인 GV-I단계 (31%)
와 GV-IH23%) 단계의 비율이 높게 나타났 으나， 3시간 동안 배양했을 경우에는
GV-V
(11%) 단계와 GV-V단계 07%) 의 비율이 증 가하였다. 또한 3시간 배양한 경우
xanthine
의 단독챔 가는 무첨 가구，
catalase
벚catalase
와 xanthine의 동시첨가에 비해 핵단계의 발 달이 늦게 -나타났으나 유의차는 인정되지 않 았다.
Table
2는 난자의 체 외 성 숙시catalase
및 xanthine의 첨가가 돼지난자의성숙에 미치는영향을 나타냈다. 실험결과，
mataphase-II
stage까지 의 성 숙율은 xanthine의 단독첨 가시 54%(61/114) 로
con trol 72 % (96/134) , ca talase 73% (97/132)
빛 catalase와 xanthine의 공동 첨가시 70%(80/115) 에 비해 유의적으로 낮 은 성숙율을 나타냈다(P(0.05L
Table
3은xanthine
이 첨 가된 배 양액 내 에 서48 , 72 , 96
벚 120시간 동안 난자를 체외 성 숙시 킬 경 우 catalase의 유무에 따른 난자 성숙율을 나타낸 것이다. 난자의 성숙율은 배양시간이 경과함에 따라 낮아졌으며 catalase의 첨가시81%(81/10 1), 57%(54/95) , 58%(55/95)
및 49%(49/100) 로 무첨가시74% (75/102 ), 61 % (56/92 ), 44% (45/103)
및 34%(32/94) 에 비해 약간 높은 성숙율을 나 타냈지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다.이 때， 성숙율의 감소는 난자의 과성숙에 의 한 퇴행과 단위발생이 그 원인으로 작용했 다. 한편， 퇴행난자의 비율은 시간의 경과와 함께 증가했으며， 120시간 배양시에는
catalase
첨가시
7%(7/10 1), 7%(7/95) , 12%(1/95)
빛 14%(4/100) 로 무첨가시
7%(7/102 ),
10% (9/92) , 18% (1 9/103) , 27%
(25/94) 에 비 해 퇴행난자의 비율이 유의적으로 낮았다(P<0.05L
단위발생난자는 배양후 72시간이경과한 후 처음 관찰되었으며
catalase
첨가 시6%(6/95) , 16% (1 5/95)
및30% (30/100)
로 무첨가시
1 %(1 /92) , 22%(23/103)
및 31%(29/94) 에 비해 높은 비율을 나타냈지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다.Figure
1은 48시 간동안 난구세 포의 부착 또는 제거된 난자의 성숙배양시 난구셰포의 영 향과catalase
및 xanthine의 첨 가에 따른 영향을 검토한 젓이다. 48시간 배양시 catalase와 xanthien의 단독 또는 공동첨 가시 control구에 비해 높은 성숙율을 나타냈으며，이때 난구세포 부착란이 제거된 난자에 비해 유의적으로 높은 성숙율을 나타냈다 (P(O.O l).
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Table 1. Effects of catalase and/or xanthine on nuclear phase of germinal vesicles at 0 and 3 h of culture in porcine oocytes
Periods of Conditions NO.of N o. ( %) of oocytes a t stage
culture of oocytes
(h) culture examined GV-I GV-ll GV-ill GV-N GV-V GV-VI
control 117 36(3 1) 27(23) 28(24) 1705 ) 3( 3) 6( 5)
3 none 110 26(8) 14(0) 29(20) 50(34) 16 (11) 10(17)
C 124 28(20) 8( 6) 28(20) 4H30) 14(10) 18 (1 3) X 110 33(23) 1H 8) 39( 2 7) 34(24) 15 (11) 10( 7)
C + X 118 21 (1 5) 16 (11) 29( 2 1) 43(3 1) 17 (1 2) 14(10)
C catalase (O .1 mg/m l). X xanthine (0.7mg/mD
Table 2. Effects of catalase and/or xanthine on in-vitro maturation of porcine oocvtes
Conditions No.of N o. of oocytes with
of oocytes
culture examined GV P- 1 M- 1 A-I T-I M-ll(%)
control 134 8 26 ? 96(72)a
C 132 12 21 97(73)a
X 114 15 35 2 6H54)b
C + X 115 6 27 80(70)a
G V germinal vesi c1 e. P-1 prophase-I stage. M -I metaphase- I stage
‘A- I anaphase- I stage. T-I telophase-I stage. M -II metaphase-II stage C catalase (O .1 mg/mD. X xanthine (O .7 mg/mD
a.b D ifferent letters are significan t1 y different (P< 0.05)
Table 3. Effect of catalase on in-vitro maturation of porcine oocytes in medium with xanthine
Periods of Presence NO.of No. (%) of
culture of oocytes oocytes oocytes oocytes
(h) catalase exanined matured * degenerated parthenogenetic
48 + 101 8H8 1) 7( 7) O( 0)
102 75(74) 7( 7) O( 0)
72 + 95 54(57) 7( 7) 6( 6)
92 56(6 1) 9 (1 0) H 1)
96 + 95 55(58) 11 (2) 15(16)
103 45(44) 19(8) 23(22)
120 + 100 49(49) 14 (1 4) 30(30)
94 32(34) 25(27) 29(3 1)
* Oocytes at the metaphase II stage were c1 assified as mature
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90
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70
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* *
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6 5 4 3 2
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mφμF ·#m」「파m-= 띠 」ζ(〕control
Culture conditions
Fig 1. Effect of cumulus cells in medium with catalase and/or xanthine 48 h after in-vitro maturation CC cumulus cells. C catalase. X xanthine
* P<O.0 1. differnce between with and without cumulus cells
재 하는 활성 산소이 다. 이 러 한
free
radical의 독성 작용은superoxide dismutase , catalase ,
taurine
등에 의해서 억제될 수 있으며， 소수정 란의 체 외 발육시 유용한 효과를 나타내 는 것으로 밝혀졌다 (Liu 등，
1995). superoxide
dismutase와 난자발육 사이의 유효성은 보고 되었으나， 돼지난자의 체외성숙시 catalase와 의 작용은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 따 라서 본 연구에서는 돼지난자의 체외성숙시 항산화제 인 catalase와 활성 산소인
xanthine
사이의 관계를 검토할 목적으로 수행하였다.
돼지난자의 초기 핵형변화와
catalase ,
xanthine의 영향을 검토하기 위해서 0시간 빛 3시간 동안 난자를 배양한 결과， 시간경 과와 함께 핵형발달이 진전되었고，xanthine
챔가구에서 핵형의 발달이 저조하게 나타났
z
찰
산소는 생명체의 생명유지를 위해 필수적 인 존재이지만， 세포 및 셰포소기관의 과산 화를 일으켜 조직을 손상시키는 독성효과를 나타낸다(
Clement
등.1985: Drew
등，1964:
Rueckert와
Mueller , 1960).
포유동물의 모든 셰 포는superoxide anion ( 02-) , hydrogen
peroxide(
H202) 와 같은 활성산소에 의한 손상의 위험에 노출된다. 일반적으로 안전한 화합물에서는 전자가 2개씩 쌍이 되어 자기 moment를 소설하고 있지만， 쌍을 이루고 있 지 않는 여분의 전자가 들어가 있는 경우에 이것을 부대전자라 부르며， 생체에서 문제가 되는 것은 산소원자나 분자에 부대전자가 존
N.
고[Provider:earticle] Download by IP 118.70.52.165 at Monday, December 20, 2021 8:29 PM
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으나 유의차는 없었다.
일반적으로 난포로부터 채취한 난자는 체 외성숙후 체외수정 벚 배양에 이용되고 있는 데， 이와같이 난포로부터 체취한 난자는
48
시간 내에서 체외성숙배양이 이루어지고 있 다 (Moor 등，
1990 ),
앞의 실험에서， 체외성숙 배양액내에 xanthine 아 첨가되었을 경우 성 숙율이 유의적으로 낮아지는 결과가 나타났 으며,
이 배 양체 계 에 catalase를 첨 가하므로 서 xanthine의 독성효과를 없앨 수 있을 것 으로 추측된다.xanthine의 첨 가된 배 양액 내 에 서
48 , 72 ,
96
및 120시간 동안 체외성숙시키는 동안 catalase의 영향을 검토한 결과， 시간이 경과 함에 따라 성숙율은 낮아졌으며catalase
첨 가에 따른 유의차는 없었다. 돼지난자는 체 외에서 43~46시간동안 배 양하므로서metaphase-
II기까지 도달하게 된다 (Edwards ，
1965).
따 라서， 48시간 경과 이후에는 과성숙에 의해 퇴행과 단위발생란이 출현하기 때문에 성숙 율이 낮아지는 결과가 나타난 것으로 보인 다. 120시 간 동안 배 양한 경 우 catalase의 첨 가에 의해 퇴행난자의 비율이 유의적으로 낮 게 나타났는데， 이러한 결과로부터 체외성숙 시 catalase가 난자의 노화를 방지 하는데 효 과적 인 작용을 할 것으로 추측된다.한편， 난구셰포 제거 또는 부착란을 48시 간 동안 성 숙배 양할 때 catalase와
xanthine
의 단독 또는 공동첨 가시 contr이 구에 비 해 높은 성숙율을 나타냈으며， 난구세포 부착란 이 유의적으로 높은 성숙율을 나타냈다. 이 와같은 결과는 xanthine의 높은 농도가 난자 의 성숙을 억제하지만， catalase의 첨가에 의 해 xanthine의 독성이 중화되는 것으로 생각 된다. 또한， 난구세포논 난자의 성숙에 필수 적인 영향을 주는 것으로 생각되며， 앞으로 이들 난자의 수정능력과 발달능력에 대한 연
구가 필요하리라 생각된다.
V. 요
。 t -,
본 연구는 돼지난자의 체외성숙시 항산화 제 인 catalase와 활성 산소 인
xanthine
사 이 의 관계를 검토하기 위하여 수행되었으며， 난핵 포기의 핵상변화와 난자의 성숙배양시catalase
와 xanthine의 역 할 및 상호작용과 난자의 성숙， 노화에 미치는 영향을 관찰하였다. 돼 지난자를
O
또는 3시간 동안 체외배양했을 경우 시간이 경과함에 따라 핵발달이 진전되 었고， 3시간 배양한 경우 xanthine의 단독첨 가시 타 실험구에 비해 핵형발달이 저조했으 나 유의차는 인정되지 않았다. xanthine의 단 독첨가 (54%) 는contro l( 72%) , catalase {7 3%)
빚 catalase와 xanthine의 공동첨 가시
(70%)
에 비해 유의적으로 낮은 성숙율을 나타냈다
(P(0.05).
xanthine 이 첨가된 배 양액내에서 난자를 체외성숙시키는 동안 catalase룰 첨가 했을 경우 난자의 성숙율은 배양시간이 경과 함에 따라 낮아졌으며， catalase의 첨가시로 무첨가시에 비해 약간 높은 성숙율을 나타냈 지만 유의적인 차이는 인정되지 않았다. 퇴 행난자의 비율은 시간의 경과와 함께 증가했 으며,
120시 간 배 양시 에 는catalase
첨 가시 무청가시에 비해 유의적으로 낮았다(P(0.05)'
단위발생난자는 72시간 경과 후 처음 관찰되 었으며，
catalase
첨가시 무첨가시에 비해 높 은 비율을 나타냈지만 유의적인 차이는 인정 되지 않았다. 난구셰포 제거 또는 부착란을 48시 간 배 양시 catalase와 xanthien의 단독 또는 공동첨가가 control구에 비해 높은 성숙 율을 나타냈으며， 난구셰포 부착란이 제거된 난자에 비해 유의적으로 높은 성숙율을 나타경
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냈다 (P(O.O l)
.
이와같은 결과에서， 난구세포 는 난자의 성숙에 필수적이며， 난구셰포의 제 거 시 난자의 노화방지 에 catalase가 효과적 으로 작용할 것으로 추측된다. 또한，catalase
의 첨가는 돼지난자의 체외성숙시 효과적인 것으로 나타났지만， 앞의 실험과 관련하여 난자성숙후 세포질의 활성 mechanism과 IVF 후의 난자능력에 대한 보다 자세한 연구 가 요구된다.
