STEAM R&E 연구결과보고서

STEAM R&E 연구결과보고서

(종이미세유체기술을 이용한 혈액검사에 대한 연구)

2016. 11. 30.

대덕고등학교

< 연구 결과요약 >

과 제 명 종이미세유체기술을 이용한 혈액검사에 관한 연구

연구목표

친수성을 갖는 종이 표면에 왁스를 패터닝하여 물이 흡수되는 방향과 속도 등을 조절하는 다양한 미세유체 채널을 갖는 종이칩을 제작하고, 피한방울을 이용해, 값싸고 신속하게 헤마토크릿 레벨(혈중 적혈구 농도, HCT) 검사 및 혈액 점도 검사를 할 수 있는 진단칩을 개발하고자 함.

연구내용

❍ 종이미세유체칩 개발에 관한 선행연구의 자료 조사:

Ÿ 종이미세유체칩 관련 이론, 재료, 제작방법, 칩의 종류와 형태 조사.

Ÿ 응용사례 조사.

❍ 종이유체칩의 설계, 제작 및 최적화

Ÿ 왁스 패턴의 선폭과 가열시간에 따른 종이내 왁스 흡수도 분석.

Ÿ 종이유체칩내 혼합식용합색소 액체내 색소분리 및 미세유체의 유동관찰:

미세유체 체널의 선폭, 형태, 혼합비율 변화에 따른 미세유체의 유동관찰 및 분석 방법 결정.

❍ 종이유체칩을 이용한 혈액검사

Ÿ 기존 혈액검사법에 관한 선행연구 조사.

Ÿ 헤마토크릿 및 혈액점도 측정용 미세유체칩의 설계, 제작 및 최적화.

Ÿ 혈액채혈 및 상용 장비를 통한 헤마토크릿 측정.

Ÿ JAVA 스크립트를 이용한 색도분석용 프로그램 개발.

Ÿ 혈중 적혈구농도에 따른 혈액 분리후 색도 측정 및 분석.

Ÿ 혈액점도에 따른 상대 유동길이 측정 및 분석

연구성과

❍ 고등학교 화학실에서 손쉽게 만들 수 있는 종이미세유체칩 프로토콜 개발.

Ÿ 소수성을 갖는 왁스 패터닝을 통해 크로마토그래피 종이내 유체의 흐름을 조절할 수 있는 미세유체칩을 직접 제작.

Ÿ 미세유체칩내 혈액분리후 색도분석을 위한 프로그램 개발.

❍ 아프리카나 북한 등 저개발국가의 국민들을 위해 값싸고, 간단히 혈액을 분석할 수 있는 적정기술의 예시 데모.

Ÿ 혈액이 구불구불한 미세유체 채널을 지나며 이동거리가 달라짐을 관찰하 고, 이를 이용하여, 헤마토크릿분석용 미세유체칩 개발 및 실제 혈액을 통해 유효성 검증.

Ÿ 점도가 높은 액제의 단위시간당 이동거리가 달라짐을 관찰하고, 이를 이용 하여 점도에 따는 혈액점도 측정용 종이미세유체칩 개발 및 실제 혈액을 통해 유효성 검증.

주요어 (Key words)

종이미세유체기술 (paper-microfluidics), 혈액검사칩(Blood diagnosis), 왁스패터닝 (wax patterning), 색도 분석 (colorimetric assay), 헤마토크릿 (hematocrit, HCT), 빈혈(anemia), 심혈관질병(Cardiovascular disease, CDV)

< 연구 결과보고서 >

Ⅰ

□ 연구목적

○ 적정기술을 통한 보다 값싸고 검사가 빠른 혈액 검사 키트의 개발

우리 연구팀은 아프리카와 같은 저개발국가의 국민을 위해 사용될 수 있는 적정기술로서의 종이미세유체칩을 이용한 혈액검사키트를 개발하는 것을 목표로 한다. 현재 상용화된 미세 유체채널(pdms등으로 제작된)은 인슐린 측정기, HIV(AIDS,후천성면역력결핍증), CVD(심혈관 병, cardiovascular disease) 등의 질병을 판단하는 키트로, 종이를 기반으로 하지 않는 키트이다.

이들은 종이미세유체 키트보다 효율성(제조 가격, 연구비용과 시간 등)이 낮아 현재 저개발국가에서 흔하게 사용되지 못한다. 따라서 그들도 의료 혜택을 누릴 수 있게 하고자 키트를 개발하기 위해 이 연구주제를 선정하였다.

빈혈(anemia)은 전세계 사람들의 25%^가 겪는 병으로 특히 아프리카, 동남아시아 등의 저개 발국가에서 흔하다. 빈혈의 판단 기준은 나이와 성에 따라 달라지며 빈혈은 혈중 헤마토크릿 레벨(‘혈중 헤모글로빈의 농도‘의 의학적 용어)이 다음과 같을 때를 일컫는다.

WHO에서의 빈혈의 판단기준^{ }

빈혈 중 철결핍성 빈혈(iron deficiency anemia, IDA)이 가장 흔하며^, 그 외의 원인에는 재생 불량성 빈혈, 용혈성 빈혈 등이 있다. 또한, 이들은 구토, 구각염(cheilosis), 스푼형 손톱 (koilonychia)등을 유발하여 심각하면 사망까지 이르게 한다. 최근에는 IDA 환자가 그렇지 않은 사람들보다 심혈관성 질환(cardiovascular disease, CVD)과 만성 신부전(chronic kidney disease), 당뇨병(diabetes)의 발병률이 더 높다는 연구 결과^를 통해 IDA의 심각성을 알게 되 었다.

대개 빈혈의 가장 중요한 원인은 개발도상국에서는 ‘영양 부족’이고, 선진국에서는 암의 발병 이다. 빈혈과는 반대로, 헤마토크릿 레벨이 정상 수치보다 높은 경우에는 진성다혈구증 (polycythemia vera, PV)이라고 부르는데 이것은 혈액 암의 일종이다. 진성다혈구증(PV)은 Low

serum erythropoietin(EPO, 에리스로포이에틴: 적혈구 생성 촉진 인자)의 분비로 인해 골수로부 터 적혈구(Red blood cell, RBC)가 과다 생산되는 현상^{ }이다. PV는 IDA처럼 헤모글로빈의 이 상으로 인해 발병하며 조기 진단을 통한 완치가 가능하다(이하 그림은 PV, IDA의 조기진료를 하므로써 완치 확률이 높아짐을 보여주는 그래프이다).

또, 서로 비례 관계인 혈액의 점도와 헤마토크릿 레벨은, 점도가 높은 피의 경우 심혈관계 질 환(cardiovascular disease)을 발생시킬 가능성을 증가시키며 polycythema vera (혈액암), pseudo polycythemia (가성 다혈증), 쇼크, 지방 색전증 등을 야기할 수 있다^{ }.

PV의 조기 치료가 완치로 이어지는 모습^

IDA의 조기치료가 완치로 이어지는 모습^

우리 연구팀은 헤마토크릿 레벨을 측정하는 키트를 제작하고 실험결과를 육안이 아닌 프로그 램을 이용하여 객관적으로 분석하고자 노력하였다. 이 키트를 활용하여 사람들이 값비싼 헤마 토크릿 레벨(HCT) 측정 기계 없이 질병의 유무를 손쉽게 판정하여 조기 치료가 가능하도록 돕 는 것이 우리연구의 목표이다.

□ 연구범위

○ 종이미세유체기술의 새로운 특징에 대해서 연구 개발

- 기존 종이크로마토그래피는 혼합된 물질 속에서 Rf(retardation factor)값 등을 통해 물질의 분류만 가능했다. 하지만 이는 전개용액의 종류에 막론하고 빠른 전개속도로 인해 정량 분석이 가능하 지 않다는 한계를 지녔다. 우리 연구팀은 이를 극복하고자 전개속도를 획기적으로 줄일 수 있는 지렁이 모양의 채널을 고안하였다. Whatman filter paper no. 4(Whatman International Ltd., 영국)에 지렁이 모양의 채널을 패널링하여 물질의 분류뿐만 아니라 정량분석도 가능하게끔 하여, 이를 기반으 로 HCT 측정 키트(hematocrit level, 혈중 적혈구 농도)를 개발하였다.

그림의 오른쪽에 진한 빨강색 꼬리가 보인다.

앞으로 이를 ‘색소 꼬 리점’이라고 정의한다.

○ 분석 프로그램에 적용되는 색도분석에 대한 연구

- 헤마토크릿 레벨이 다른 경우 지렁이 채널에서 나타나는 색소꼬리점의 길이가 달라져 전체 혈액이 흐른 길이에 대한 색소꼬리점의 길이를 측정하면 HCT레벨 측정이 가능하다. 그러나 육안으로 는 색소꼬리점(마젠타 빨강색에 가까움)과 전체피(주황색에 가까움)의 구분이 힘들어 객관적인 비율 을 산술하기 힘들다. 따라서 보다 객관적인 기준으로 HCT 레벨 측정이 가능하도록 전체 혈액이 흐른 길이에 대한 색소 꼬리점의 길이 비율을 측정하는 프로그램(Thresmage)을 개발하였다.

해당 채널은 실제 혈액을 투입한 모습으로 마젠타 빨강색의 Rf-HCT값은 0.52이다

Rf-HCT(%)=_전체 혈액이 흐른 길이

마젠타  빨강색의 길이

<Rf-HCT 값의 계산 방법>

Ⅱ. 연구 수행 내용

□ 이론적 배경 및 선행 연구

1. 종이미세유체학 (Paper microfluidics)의 원리

ü 종이는 마이크로미터 또는 나노미터의 작은 셀룰로스 섬유의 엉켜진 구조를 가지고 있고, 셀룰 로스는 물에 잘 젖는 성질을 가지고 있음.

ü 종이위에 소수성을 갖는 물질을 코팅 또는 패터닝을 하면, 물과 같은 극성액체는 셀룰로스 섬유부분을 따라 흐르는 성질이 생김.

ü 소수성을 갖는 물질은 왁스를 많이 이용하고, 마스크를 만들어 왁스를 뭍히거나, 프린터로 패터닝한 후 섭씨 100도 정도에서 패터닝하면, 왁스가 종이 내로 스며들어 소수성장벽을 만들 수 있음.

ü 종이미세유체기술은 물이 젖는 원리, 흐르는 물의 양, 젖는 속도 등 다양한 물리관련 이론이 필요하고, 종이표면을 처리하기 위한 화학적 지식은 물론, 물대신 혈액을 이용할 경우 다양한 생물학적 지식이 필요로 하는 융합연구임.

[그림 2.1] 종이 채널의 모식도^

[그림 2.2] 흰색부분이 왁스로 체널링된 부분(연구실에서 SEM으로 직접 촬영함)

[그림 2.3] 제작된 종이미세유체칩의 예시^

2. 종이미세유체학관련 최근 개발동향

ü 최근 다양한 종이미세유체를 이용한 연구들이 매우 활발히 진행되고 있음.

ü 종이의 재료는 크로마토그래피용, 필터용, 니트로셀룰로스등 다양한 재료가 사용되고 있고, 종이 미세유체칩을 만드는 방법은 반도체공정을 이용하는 법, 잉크프린터를 이용하는 법, 레이 저로 절단하는 법등으로 종이위에 왁스를 패터닝하는 방법등이 널리 이용되고 있음.

ü 미세유체의 유동을 관찰하기 위해 일반적으로 카메라를 통해 이미지를 사진 또는 동영상 촬영 후 색도 분석함.

[표 2.4] 종이미세유체칩의 종류와 제작방법^

□ 연구주제의 선정

○ 유튜브 동영상과 TED 강연을 통해 현재 종이미세유체학연구가 활발함을 확인하고, 하버드대학 교의 George Whitesides 교수님의 강연을 통해 아프리카와 같은 저개발국가를 위한 바이오응용 기술을 개발해보고 싶다는 생각을 갖게 됨.

○ R&E 연구사례를 조사해 본 결과 아직까지 종이미세유체기술에 관한 연구가 진행된 적이 없음.

○ KAIST 바이오및뇌공학과 정기훈교수님과 박문성 박사과정의 의견을 참고하여, 고등학교수준의 시설에서 종이미세유체기술을 구현할 수 있는 방법에 대해 자문을 받고, 연구방향을 결정함.

○ 현재 의료기기에 대한 적정기술의 개발이 크게 발전되지 않은 점을 통해 종이미세유체기술 기반 의료 기기 대용 적정기술 키트를 만들기로 함.

□ 연구 방법

○ 최종 키트 제작시의 큐링 방식의 선택

실험을 통해 기술을 익히고 있던 연초에는 논문을 따라 섭씨 150도에서 3분간 가열하는 큐링 방식을 택했다. 그러나 지렁이 채널의 경우에는 채널의 폭이 얇기에 오래 가열하면 좌우로 잘 번져서 3분도 매우 긴 시간이 되었다. 좌우의 번짐을 최소화하고 상하 번짐을 최대한 빠르게 하기 위해 핫플레이트 의 가열 온도를 섭씨 150도에서 150초 가열하는 방식을 택하였다.

우리 연구팀은 여름방학 2주간 KAIST 바이오포토닉스 연구실을 방문하여, 종이미세유체칩 관련 설계방법, 논문 읽는 법, 기존연구와 차이점 구분하는 법, 기술용어에 관한 이해, 연구를 진행하는 법, 샘플핸들링법등을 대학원생과 담당교수님께 지도 받았다.

□ 연구 활동 및 과정 ○ 연간 연구 계획표

5월 6월 7월 8월

목표 개발 키트 선정 (2~3개) 프린터 구매(amazon 이용)

KAIST 견학 연구 KAIST 견학 연구

기술 이해 기술 응용

기술 연구 중간발표

9월 10월 11월 12월

키트 디자인 마무리 작업 (상용화 준비 작업도 진행)

실험마무리 최종보고서 작성 최종발표

□ 연구내용

1. 채널 이해를 위한 채널 설계

(1) 실험 목적

본 실험의 목적은 채널의 두께, 크기 등의 특성에 따라 달라지는 유체의 흐름 및 채널이 hot plate 작업을 거친 후에 왁스의 번짐에 관한 내용들을 이해하기 위한 실험에 필요한 샘플 채널 을 설계하고 이를 프린팅 해냄에 있다.

(2) 실험 재료, 기구

Microsoft powerpoint, xerox colorcube 8870(KAIST), Whatman filter paper(20×20cm)

(3) 실험 방법

① *Design Rule에 맞추어 innet의 두께에 따라 차이를 둔 채널, innet의 크기와 두께에 차 이를 둔 채널, 채널 통로의 두께에 차이가 있는 채널 외의 기타 채널들을 구상한다.

*이하 매커니즘데로 채널을 power point로 디자인

미세 채널 및 Innet의 선 두께는?

입구와 출구의 크기의 내경은?

미세 채널의 폭은?

종이 채널의 전체 크기는?

② Microsoft powerpoint의 도형을 이용하여 채널이 들어갈 칩의 경계를 직사각형으로 그 려 넣는다. (옵션)

③ 칩의 경계 내부에 구상한 채널을 Microsoft powerpoint의 도형을 이용해 설계한다.

④ xerox colorcube 8870(KAIST)를 이용하여 Whatman filter paper(20×20cm)에 칩을 프린 팅 해낸다.

(4) 실험 결과

① innet의 두께에 따라 차이를 둔 채널

Design Rule

-미세 채널 및 입/출구를 위한 선의 굵기는?

그림 3.1의 칩과 같은 경우 각각의 입구(innet)의 두 께에 1.5pt, 2.25pt, 3pt, 4.5pt, 6pt로 차이를 두었다.

-입구와 출구의 내경은? 5mm -미세 채널의 폭은? 1~3mm 이내 -칩의 전체 크기는? 5×5(cm)

[그림 1.1] innet의 두께에 따라 차이를 둔 채널

실험 방법에 따라 5×5(cm) 크기의 칩 내에 각 innet의 두께에 따라 차이를 둔 채널 5개가 프린팅 되었다.

② innet의 크기와 두께에 차이를 둔 채널 Design Rule

-미세 채널 및 입/출구를 위한 선의 굵기는?

그림 3.2의 칩과 같은 경우 각각의 innet의 두께를 위 부터 2.25pt, 3pt, 4.5pt, 6pt로 차이를 두고 크기를 왼 쪽부터 1.5배씩 확장시켜나갔다.

-입구와 출구의 내경은? 위 채널을 각각 다르다.

-미세 채널의 폭은?

본 채널 같은 경우 유체가 흐를 채널의 통로가 존재 하지 않는다.

-칩의 전체 크기는? 5×5(cm)

실험 방법에 따라 5×5(cm) 크기의 칩 내에 각 innet의 두께와 크기에 차이를 둔 20개의 채널 이 프린팅 되었다.

③ 채널 통로의 폭에 차이가 있는 채널 Design Rule

-미세 채널 및 입/출구를 위한 선의 굵기는?

2.25pt

-입구와 출구의 내경은? 8mm -미세 채널의 폭은?

채널 통로의 폭을 위부터 0.9cm, 0.5cm, 0.2cm로 각각 차이 를 두었다.

-칩의 전체 크기는? 5×5(cm)

실험 방법에 따라 5×5(cm) 크기의 칩 내에 각 채널의 폭에 차이를 둔 3개 채널이 프린팅 되었다.

4) 이외의 design rule 없이 창의적으로 구상해낸 채널들

[그림 1.4] 유동의 빠르기를 측정하고자 눈금을 표기한

채널

[그림 1.6] sample zone의 교차점; channel bridge으로 채널에 흘린 안료의 교차지점에서의 균일 분배를

관찰하기 위한 채널

[그림 1.3] 채널 통로의 폭에 차이가 있는 채널 [그림 1.2] innet의 두께와 크기에

차이를 둔 채널

2. 핫플레이트 작업을 거친 후 종이미세유체칩의 특성 이해

(1) 실험 목적

이 실험의 목적은 핫플레이트 작업을 거쳐 완성된 종이미세유체칩(micro-fluidic chip) 채널 내 에서 액체의 유동이 원활하게 이루어지는지 확인해 봄에 있다.

(2) 실험 준비물

핫플레이트, 종이미세유체칩, 알루미늄 호일

(3) 실험 방법

㉠ 종이미세유체칩을 인쇄한다.

㉡ 핫플레이트에 알루미늄 호일을 깐다.

㉢ 알루미늄 호일 위에 micro-fluidic chip을 올려놓고 150°C에서 180s(3m) 간 가열한다.

㉣ 가열한 후의 왁스의 번짐과 액상의 유출에 대해 관찰한다.

→액상의 유출 관찰 방법

㉣-1. 증류수 + 물감의 색깔 있는 액체를 제조한다.

㉣-2. 채널에 일정한 크기로 액체를 떨어뜨려본다.

(4) 실험 결과

㉠ 핫플레이트 가열 후 왁스벽의 번짐 관찰

[그림 2.1]_ innet이 뚜렷한 채널(왼쪽-가열 이전)과 흐릿한 채널(오른쪽-가열후)

[그림 2.2] 총 합산 수치 위에서부터 (A), (B), (C), (D)

[그림 2.1]의 왼쪽 그림은 가열 이전의 채널 모습이고, 오른쪽 그림은 가열 이후의 모습이 다. 핫플레이트 가열 이후 왁스가 약간 번져있는 모습을 확인할 수 있다. [그림 2.2]를 통해 두 께의 변화를 더 확연하게 관찰할 수 있다. (A)는 hot plate 작업을 마친 채널의 총 두께, (B)는 작업 이전의 총 두께, (C)는 작업을 마친 내부 폭, (D)는 작업 이전의 폭이다.

[그림 2.3] 가열 전 후 채널 비교 모습 (왼쪽 가열 전, 오 른쪽 가열 후)

㉡ 유체의 이탈에 대한 관찰

[그림 2.4]_ innet 위에 물감을 바로 떨어뜨린 모습

[그림 2.5] 좌우로 왁스가 퍼져 유동이 관찰되지 않는 모습

[그림 2.4]와 같이 채널에 물감을 떨어뜨렸을 때 일부 채널에서는 왁스벽 밖으로 액체가 유출되는 모습이 관찰되었다. 핫플레이트에서 가열 시 바닥면이 고르지 않아 일부 구간에서 왁스벽이 종이 바닥까지 스며들지 못해 구멍이 뚫린 것으로 예상된다. 왁스벽이 얇을수록 액체의 유출은 더 심각했기에 향후 채널 제작 시 왁스벽의 두께를 너무 얇게 하면 안 된다는 것 또한 알게 되었다.

[그림 2.5]의 채널에서는 액체가 아예 통로를 따라 흐르지 않았다. 이는 채널의 통로 폭이 너무 좁음에 따라 왁스가 가열되면서 통로 내부(이를 좌우로 왁스 번진 경우라고 한다)를 막았기 때문이다.

(5) 고찰

본 실험을 통해 핫플레이트 가열 과정에서 왁스가 종이 바닥까지 잘 스며들 수 있도록 종이 미세유체칩을 바닥이 평평하지 않은 알루미늄 호일이 아니라 바닥면에 평평하게 밀착되는 종 이 위에서 굽기로 결정했다.

왁스의 핫플레이트 작업으로 인한 번짐 현상은 채널에서의 유체 흐름에 크게 영향을 주므로 가열 후 채널의 폭을 예상하기 위해 좀 더 자세히 실험해보기로 하였다.

3. 왁스 번짐의 자세한 이해

(1) 실험 목적

1차 실험을 진행하면서 왁스의 번짐으로 인해 얇은 채널 폭을 가진 채널에서 ‘막힘 현상(왁스가 번져서 유체의 흐름을 방해하는 현상_ 실험 2로부터)’이 관찰되었다. 따라서 향후 종이미세유체칩 제작 시 이런 번짐 현상이 일어나지 않는 채널의 폭을 결정하기 위해 다음 실험을 진행하고자 한다.

(2) 실험 재료, 기구

Hot plate, 종이미세유체칩, A4종이(알루미늄 호일의 대용), microsoft powerpoint, whatman filter paper

<20x20>, xerox colorcube 8870 (KAIST에서 빌림)

(3) 실험 방법

㉠ 종이 채널을 패널링한다.

㉡ Hot plate에 A4종이를 받친다.

㉢ 종이 위에 종이미세유체칩을 올려놓고 150°C에서 180s(3분) 간 가열한다.

㉣ 가열한 후의 왁스의 번짐에 대해 관찰한다.

㉤ 결과를 분석하여 수치화 시킨다.

(4) 실험 결과

가열 작업이 마치고나서 채널의 폭 너비 차이를 비교한다.

[그림 3.1] hot plate 작업을 안한 반원 채널(上), hot plate 작업을 한 반원 채 널 (下)

hot plate작업을 한 채널의 폭이 더 두꺼운 이유는 왁스가 작업 중에 옆으로 번졌기 때문이다. 실험에서 얻어진 채널의 폭 너비를 측정하여 [표 3.2]에 정리하였다. 이때 큐링 이전 채널의 폭 너비는 채널 디자인 시 ppt에서 지원하는 길이 단위(pt)를, 큐링 이후 채널의 폭 너비는 우리가 일상적으로 더 친숙하게 사용하는 길이 단위(mm)를 사용하였다. (단위에 변화를 준 이유는 실험자가 만들고자 하는 채널의 폭 너비를 mm로 예측하면 ppt에 입력해야 하는 채널의 폭 너비는 pt단위로 알려주는 수식을 만들어내고자 함이다.)

큐링 이전 채널의 폭 너비 큐링 이후 채널의 폭 너비

6pt 14.4mm

4.5pt 11.6mm

3pt 10.2mm

2.25pt 7.4mm

1.5pt 6.5mm

[표 3.2] 채널의 크 기 비교 분석

* SI 단위로 1pt는 0.3528cm이다

[표3.2]의 값을 excel에 입력하여 다음과 같은 추세선과 추세선의 일차함수를 얻을 수 있었다.

_{  } _{ }  ( x=큐링 이전 채널의 폭 너비, y=큐링 이후 채널의 폭 너비)

(5) 고찰 및 토의

우리 연구팀은 본 실험의 결과를 통해서 큐링(프린팅과 핫플레이트 가열 작업) 후 왁스의 번짐 현상을 확실하게 이해하였다. 실험결과 얻어진 수식을 이용하면 채널 제작 시 큐링 후의 채널 폭을 미리 예측 할 수 있기 때문에 채널 디자인 시 입력해야 하는 채널 폭이 명확해져 종이미세유체칩의 제작 실패율을 낮출 수 있다. 실제로 추후 제작된 모든 채널은 이 수식을 적용하여 채널의 폭이 계산되었고 빈혈여부 의 판단 시 사용된 지렁이 채널도 이를 이용하여 제작하였다.

4. 인공혈액의 식용색소(적혈구 대용)의 농도에 따른 Rf값 비교

(1) 실험목적

인공혈액의 빨강색 수채화 물감(적혈구 대용) 농도에 따른 빨강색 물감의 Rf값을 비교한다.

이 실험의 실제 목적은 사람의 혈액으로 실험하기에 앞서 종이미세유체칩에서의 Rf값을 통 해 적혈구의 농도를 비교할 수 있는지 그 가능성을 확인하는데 있다.

(2) 실험재료

Isopropanol, 빨간색 수채화 물감(적혈구 대용), 파란색 식용색소(혈장 대용), 식염수, 마이크로피펫

(3) 실험방법

㉠ 채널을 디자인 할 때에는 채널 안쪽 폭을 0.358cm으로 한다(큐링 예측값에 의해 큐링 작업 이후 3mm).

㉡ 빨간색 물감 용액과 파랑색 색소 용액은 다음과 같이 제조한다.

(Isopropanol은 분말을 섞기 위해 사용했으며 중탕하여 실험에 사용되기 전에 모두 기화시킴)

빨간색 물감 용액 (10ml 제조) 파랑색 색소 용액 (10ml 제조)

Shami 물감 1.6g(pigment 0.5g) 식용색소 0.5g

(si-al) sodium chloride 9.7ml (si-al) sodium chloride 9.7ml Isopropanol 2㎕ (si-al) Albumin from human serum

coeffizent solution (3.025㎕) Isopropanol 2㎕

*sigma aldrich(si-al)사의 sodium chloride solution은 5M 농도

*Albumin은 인간 혈장에 포함되는 단백질으로 실제 혈액에 유사하게 제조하고자 추가함 *coeffizent solution은 수채화 분말의 CdSe(용해가 거의 안되는 성분을 용해시키기

위해 극소량 첨가)

㉢ ㉡에서 만든 빨간색과 파란색용액을 다음과 같은 비율로 섞어 헤마토크릿 농도가 서로 다른 인공혈액을 제조한다.

용액 빨강색 물감/파랑색 색소

A 30㎕/70㎕

B 35㎕/65㎕

C 45㎕/55㎕

㉣ ㉢에서 제조된 용액을 각각 20㎕만 피펫팅하여 Innet(채널)에 각각 투여한후 충분히 기다린다.

㉤ ㉣에서 나온 결과를 토대로 Rf값 (_전체용액이 이동한 길이 빨간색용액이 이동한 길이 ) 을 계산한다.

(4) 실험 결과

0.384 0.442 0.597

(5) 고찰

빨간색 물감의 농도가 진한 용액일수록 빨간색 물감의 Rf값이 커짐을 알 수 있었다.

이를 통해 혈액 내 적혈구의 농도를 종이미세유체칩에서의 Rf값을 이용하여 비교할 수 있을 것으로 기대할 수 있게 되었다. 우리 팀은 실제 혈액으로 적혈구의 Rf값을 측정한 후 정상인의 Rf값과 비교하여 빈혈여부를 판단하는 키트를 제작하기로 하였다. 정상인의 Rf값보다 낮은 수치가 나오면 빈혈이라고 판단을 내릴 수 있을 것이다.

그런데, 실제 사람의 혈액은 붉은색으로 적혈구와 혈장이 분리될 경우 그 경계면의 확인이 육안으로는 애매한 부분이 있을 것으로 예상되어 이에 대한 대책으로 실험결과를 스마트폰으로 촬영한 후 적혈구의 Rf값을 바로 수치로 알려주는 프로그램을 제작하기로 하였다.

5. 헤마토크릿 레벨(HCT) 측정에 효과적인 채널제작에 대한 연구

(1) 실험 목적

본 실험은 전체 혈액이 이동한 길이와 적혈구가 이동한 길이를 비교할 때 경계부분이 모호하여 분석에 어려움이 있으므로 HCT측정에 효과적인 채널을 제작해보고자 한다.

(2) 실험 준비물

초록색 식용색소, 증류수, 튜브(15ml, 두개), 약수저, 질량 측정기, 마이크로 피펫 (Eppendorf Research® pipette (10-100 μL)

(3) 실험 방법

① 튜브에 각각 초록색 식용색소 0.1g, 0.5g을 첨가한다. 15ml 눈금에 맞도록 DI(증류수)를 첨가해준다. (색소는 정량 투여를 위해 질량 측정기에 포장지를 올려놓고 약수저로 식용색소를 모은다)

② microsoft powerpoint으로 지렁이 모양의 키트를 디자인한다. 단, 큐링 공법을 고려하여 유체가 흐르기 위한 최소한 채널폭을 맞춘다.

[그림 5.1] 왼쪽에서부터 microsoft powerpoint을 통해 점이 없는 원채널(1),점의 밀도가 매우 큰 채널(2), 지렁이 모양의 채널(3)을 디자인한 모습

③ 모든 채널을 핫플레이트에 올려놓고 섭씨 150도에서 150초간 가열한다.

④ 큐링이 완성된 채널에 마이크로피펫으로 20μl씩 투여한다.

⑤ 반응이 완전히 끝날 때까지 기다린다(약 30분).

(4) 실험 결과

① 점의 밀도가 매우 큰 채널은 점이 없는 원채널(대조군)과 차이점이 거의 보이지 않았으며 농도에 따른 경향성 또한 관찰되지 않았다.

[그림 5.2] 점이 없는 원채널

[그림 5.3] 점의 밀도가 큰 채널

② 지렁이 모양의 채널에서는 반응이 완료되면 색소가 끝부분에 모여 진한 꼬리를 형성하였으며(앞으로 이를 ‘색소꼬리점’이라고 정의한다) 또한 이는 농도에 따라 길이가 달라짐을 관찰할 수 있었다.

[그림 5.4] 식용색 소 0.1g을 섞은 용 액을 투여한 모습 (0.11cm)

[그림 5.5] 식용색 소 0.5g을 섞은 용 액을 투여한 모습 (0.59cm)

(5) 고찰

본 실험을 통해 지렁이 모양의 채널이 혈액내 적혈구 농도(HCT)를 측정하기에 가장 효과적임을 알 수 있었고, 지렁이 모양 채널에서 나타난 전체 용액길이에 대한 색소꼬리점의 길이(Rf-HCT)를 측정하므로써 혈액 내 적혈구 농도를 비교할 수 있고 이를 통해 빈혈 여부를 판단 할 수 있을 것으로 기대된다.

6. 종이미세유체채널을 이용한 적혈구 농도(HCT, hematocrit level) 측정

(1) 실험 목적

본 실험의 목적은 종이미세유체채널을 이용해 제작한 종이로 적혈구 농도를 측정하는데 있 다.

(2) 실험 준비물

혈액, 증류수(DI), 원심분리기, VACUETTE® K2EDTA Tubes(5개), Vacutainer® Lithium heparin(3개), 디자인 및 분석 프로그램(microsoft powerpoint, corelDRAW Graphics suite, adobe creative cloud, thresmage, Whatman Chromatography No.4, Eppendorf Research®

pipette (10-100 μL) (3) 실험 방법

① 종이미세유체채널 키트는 지렁이 채널을 베이스로 디자인을 한다.

② 왁스 프린터로 채널을 대량으로 복사하고 최적의 체널링 조건을 찾는다(섭씨 200도에서 45초 가열하는 것이 가장 번짐률이 적고 왁스 침전률이 빠른 최적의 조건임)

③ 건강한 사람의 혈액 20ml를 채혈하여 ‘VACUETTE® K2EDTA Tubes, Greiner Bio-One’에 보관한다(EDTA와 Heparin은 항응고제로 혈액의 응고를 방지를 지연시키는 역할을 한다).

④ 원심분리기에 채혈통을 고정시키고 2500rpm(분당 회전속도)으로 약 5분간 원심분리 작업 을 진행하여 혈장과 혈구 등을 분리한다.

[그림 6.1] 왼쪽에서부터 원심분리된 혈액, 혈장, whole blood

⑤ 원심 분리된 혈액을 이용하여 빈혈 혈액(IDA), 빈혈 주의 혈액(SI), 정상 수치의 혈액을 제 조한다.

빈혈 혈액(IDA) 빈혈 주의 혈액(SI) 정상 혈액

혈구 혈장 혈구 혈장 혈구 혈장

30 70 40 60 50 50

⑥ ⑤에서 제조한 혈액을 키트에 투여한다.

[그림 6.2] 왼쪽은 희석시키는 모습, 오른쪽은 희석시키지 않은 혈액을 투 여했을 때 나타나는 문제점

⑦ 혈액의 잘 흐르지 않은 채 응고하여 ⑤에서 제조된 혈액에 증류수를 2배의 부피로 첨가 하여 채널에 투여하기로 한다.

⑧ ⑤에서 제조된 혈액의 농도를 묽힌다.

1/3배로 희석된 빈혈 혈액(IDA) 1/3배로 희석된 빈혈 주의 혈액(SI) 1/3배로 희석된 정상 혈액

빈혈 혈액(IDA) 증류수 빈혈 주의 혈액(SI) 증류수 정상 혈액 증류수

60 120 60 120 60 120

⑨ 키트[그림 4-1-(3) 개량 키트 참조]에 희석된 혈액을 투여하고 완전히 키트와 반응할 때 (평균 30분) 까지 기다린다.

[그림6.3] 혈액을 채널에 투여한 모습

⑩ 직접 제작한 안드로이드 기반(자바스크립트) 소프트웨어 프로그램(thresmage)을 스마트폰 에서 실행하여 결과물을 촬영해서 전체 혈액이 흐른 길이에 대한 적혈구가 모여 만들어 진 꼬리점의 길이의 비율(Rf-HCT)을 얻는다.

(4) 실험 분석 결과 (헤마토크릿 레벨 표-희석된 혈액 사용)

- 빈혈 혈액 (anemia) (HCT-30%)

빈혈 주의 혈액(severe) (HCT-40%)

정상 혈액 (normal) (HCT-50%)

회차 IDA-1차 IDA-2차 SI-1차 SI-2차 NOR-1차 NOR-2차

실험 결과

Rf-HCT

(%) 28% 32.5% 42% 43% 51% 49.25%

*<Rf-HCT는 _전체 혈액이 흐른 길이 적혈구가 형성한 꼬리점의 길이

이다>

* 실험을 통해 얻어진 Rf-HCT값은 실제 혈액의 HCT값과 최대 3% 오차율을 보였다.

*본 실험은 혈액을 키트에 투여했을 때 [실험 4]의 식용색소 혼합용액처럼 색소꼬리점이 생성 (적혈구가 꼬리 형성)될 것이라는 가정 하에 진행되었다.

(5-2) 실험 분석 결과 (헤마토크릿 레벨 표-희석되지 않은 혈액 사용)

[그림 6.5] 희석시키지 않은 혈액들을 키트에 흘린 모습

빈혈을 확인하고자 할 때 혈액과 증류수를 1:2 부피비로 섞어서 키트에 투여하는 것은 분명히 번거로운 일이기 때문에 희석되지 않은 혈액(이동거리가 너무 작아 분석이 어려울 것으로 예상 했었음)으로도 동일한 Rf-HCT이 얻어지는지 확인해보았다.

[그림 6.9] <DI 희석 안함> 정상 혈액을 키 트에 투여한 모습- (Rf-HCT=49.95%)

[그림 6.7] <DI 희석 안함> 빈혈 혈액(IDA)을 키 트에 투여한 모습- (Rf-HCT=32.6%)

위에서 알 수 있듯이 프로그램을 이용하면 농도를 증류수로 희석하지 않은 경우도 농도를 희 석한 경우와 큰 오차 없이 비슷한 값이 얻어진다. 따라서 실제 빈혈여부를 판단 시 환자의 혈 액 농도를 묽혀서 사용하지 않아도 된다.

다음은 연구에 참여한 학생의 혈액을 란셋으로 채취한 후 키트에 투여했을 때의 결과이다.

Rf-HCT이 혈액 응고제가 들어간 결과값 들과 큰 차이가 없으므로 혈액응고제가 실험결과에 준 영향은 크지 않다고 판단할 수 있다.

[그림 6.6] 실험6 이후 즉석으로 란셋(lancet, 28G)을 통해 채혈한 혈액을 HCT 키트에 투여한 모습- (Rf-HCT=51.8%)

(6) 고찰

실험 6-2에서 키트로부터 산출된 Rf-HCT와 혈액의 HCT값이 3%이내의 오차로 일치하므로, 이 HCT 키트를 이용하여 환자가 빈혈인지, 정상인지를 적은 오차율로 판정할 수 있다. 무엇보다 이 키트의 가격은 총 0.02원도 안 된다(실제 적혈구농도를 측정하기 위해서는 원심분리기 등이 필요하며 가격이 30만원이 넘어간다. 병원에서 측정하는 경우 100만원이 넘는 기계들이 사용 된다). 따라서 우리 연구팀이 개발한 오차율이 작은 이 HCT 키트는 개발도상국에서 사용되기 에 충분한 적정기술이라고 생각한다.

7. 헤마토크릿 키트 분석 프로그램(Thresmage)의 개발 (1) 제작 목적

이 프로그램 제작 목적은 보다 객관적인 기준에서 HCT키트의 Rf-HCT값을 분석하기 위함에 있다.

HCT 레벨 분석프로그램(thresmage)의 magent-red(#ff00ff) 색소 꼬리점의 측정 기준

;{

/tanh (Hypebolic Tangent) 함수를 RGB 중앙값에 R값을 대응시킴 return Math.tanh(v * 6 / 255 - 3 + (18 / 5 - 3)) * 128 + 128;

};

*이하는 UI 인터페이스를 기재하지 않은 thresmage(Js.)의 실행 스크립트입니다.

(function(){

var$=function(query){

returndocument.querySelector(query);

};

//캔버스, 이미지, 슬라이더 등 각종 변수 설정 var canvas =$('canvas');

var ctx = canvas.getContext('2d');

var input =$('input[type=file]');

var currThreshold =10;

var statusView =$('#stat');

var img;

var isLoading =false;

var imageData =undefined;

var data =undefined;

var manuloc = jQuery('#manuloc');

/*

* autoThreshold 함수: 임계값을 자동으로 설정함

* (동작하긴 하나, 그것이 임계값이라기에는 부적절함)

*/

varautoThreshold=function(){

if(!imageData) return currThreshold;

var data = imageData.data;

var newThres = [currThreshold, 999];

for(var i =0; i <100; i++){

//경계의 임계값이 4개 정도로 잡힐 때와 가까 운 값으로 설정

var len =Math.abs(calculateEdge(i / 100).edge.length-4);

if(newThres[1] > len){

newThres = [i, len];

} }

return newThres[0];

};

/*

* threshold 함수: R값 0 ~ 255를 x -3 ~ +3 에 대응 시키고,

* 이 결과값을 다시 0 ~ 255에 대응시켜 반환

*/

//tanh (Hypebolic Tangent) 함수를 RGB 中 R값에 대응시킴

returnMath.tanh(v *6 / 255-3+ (18 / 5-3))

*128+128;

};

/*

* drawImage 함수: 이미지를 캔버스에 그리고 빨간색 이외의 색 제거,

* 색의 대비를 높임

*/

vardrawImage=function(){

isLoading =true;

statusView.innerHTML ='이미지 처리중...';

canvas.width= img.width;

canvas.height= img.height;

ctx.drawImage(img, 0, 0);

imageData = ctx.getImageData(0, 0, canvas.width, canvas.height);

//이미지를 그린 후 이미지의 RGB 값을 얻어옴.

var data = imageData.data;

for(var i =0; i < data.length; i +=4) { //매 픽셀마다

var r = data[i];

var g = data[i +1];

var b = data[i +2];

//빨간색이 아닌 색들을 전부 걸러냄 if(!(r > g +25&& r > b +25)){

data[i +3] =0;

}if(r >200& g >200& b >200){

data[i +3] =0;

}

// threshold 함수를 호출시켜 RGB 中 R을 쌍 곡선 탄젠트 함수에 결과로 변경

// -> 색의 대비를 높여줌 data[i] = threshold(data[i]);

}

//자동으로 임계값 설정 currThreshold = autoThreshold();

//적혈구 비율 계산 시작 calculate();

isLoading =false;

};

varbrightness=function(i){

//색상의 광도를 얻어옴

return (0.2126* imageData.data[i] +0.7152*

imageData.data[i +1] +0.0722* imageData.data[i +2]) / 255;

};

/*

* calculateEdge 함수: 이미지의 경계를 파악하고 해당 경계점에 파란 점을 찍음

*/

varcalculateEdge=function(thres, context){

if(imageData ===undefined) return;

var data = imageData.data;

var minX =undefined;

var maxX =undefined;

var edge = [];

for(var i =0; i < data.length; i +=4){

//매 픽셀마다

var x = (i / 4) % imageData.width;

var y =Math.floor((i / 4) / imageData.width);

if(data[i +3] !==0){

if(minX ===undefined|| minX > x) minX

= x;

if(maxX ===undefined|| maxX < x) maxX

= x;

//현재 픽셀의 광도가 설정한 임계값 낮고, 우측 픽셀의 광도가 설정한 임계값보다 높으면 if(brightness(i) > thres && brightness(i +4) < thres && data[i +7] !==0){

//경계로 인식하고 목록에 추가 edge.push(x);

if(context){

//파란 점 그리기 context.fillStyle ='#00f';

context.fillRect(x, y, 1, 1);

} } } } return { minX: minX, maxX: maxX, edge: edge,

middle: edge[Math.floor(edge.length / 2)]

};

};

/*

* calculate 함수: 적혈구의 비율을 계산

*/

varcalculate=function(){

ctx.putImageData(imageData, 0, 0);

var output = calculateEdge(currThreshold / 100, ctx);

var minX = output.minX;

var maxX = output.maxX;

var edge = output.edge;

var middle = output.middle; //경계의 중앙값 manuloc.range('set value', middle / canvas.width*100);

if(edge.length>2){

edge.pop();

edge.unshift();

}

if(edge.length===0){

statusView.innerHTML ='실패: 위치 값 설정 잘못됨';

}else{

statusView.innerHTML ='결과: '+ ((maxX - middle) / (maxX - minX) *100) +'%';

ctx.fillStyle ="#555";

//경계의 중앙값, 시작점, 끝점에 선을 그림 ctx.fillRect(middle, 0, 1, canvas.height);

ctx.fillRect(minX, 0, 1, canvas.height);

ctx.fillRect(maxX, 0, 1, canvas.height);

} /*var avg;

if(edge.length === 0){

statusView.innerHTML = 'Failed';

}else{

avg = edge.reduce(function(prev, curr){

return prev + curr;

}) / edge.length;

statusView.innerHTML = 'Result: ' + ((maxX - avg) / (maxX - minX) * 100) + '%';

}*/

};

//UI part

jQuery('.ui.accordion').accordion({

exclusive: false });

//임계값 슬라이더 설정 jQuery('#threshold').range({

min: 0, max: 100, start: 10, step: 1,

onChange: function(event){

if(isLoading){

return;

}

if(img !==undefined){

currThreshold =event;

calculate();

}

});

//직접 입력 슬라이더 설정 manuloc.range({

min: 0, max: 100, start: 10, step: 1,

onChange: function(event){

if(isLoading){

return;

}

if(imageData !==undefined){

ctx.putImageData(imageData, 0, 0);

var output = calculateEdge(currThreshold / 100, ctx);

var minX = output.minX;

var maxX = output.maxX;

var middle =event / 100* canvas.width;

//직접 조절시에는 초록 선을 그림 ctx.fillStyle ="#0f0";

ctx.fillRect(middle, 0, 1, canvas.height);

ctx.fillRect(minX, 0, 1, canvas.height);

ctx.fillRect(maxX, 0, 1, canvas.height);

statusView.innerHTML ='결과 (직접 조절

됨): '+ ((maxX - middle) / (maxX - minX) *100) +'%';

} } });

//유저가 이미지를 선택했을 경우 input.onchange=function(event){

var files =event.target.files;

var file;

if(files && files.length>0) file = files[0];

if(file ===undefined) return;

img =newImage();

img.onload=function(){

//이미지 입력이 끝나면 drawImage 함수 호출 drawImage();

};

var reader =newFileReader();

reader.onload=function(e){

img.src= e.target.result;

};

reader.readAsDataURL(file);

//이미지를 읽어옴 };

})();

[그림 6.4]

http://legacy.khinenw.tk/thresmage/에서 ‘정상 혈액 2차 실험 키트(NOR-2차)‘를 분석하는 모습

8. 점도를 임의로 조정한 용액 제조 및 유동성 측정

(1) 실험 목적

혈액과 점도가 비슷한 용액, 그보다 점도가 높은 용액, 낮은 용액을 제조하여 혈액에 관한 실험 전 종이미세유체 채널에서 그 유동성을 측정한다. 또한 점도와 유동성의 반비례 관계가 종이미세유체 채널에서도 성립함을 확인한다.

(2) 관련 이론

㉠ 점도

점도의 사전적 정의를 살펴보면 ‘유체의 흐름에서 어려움의 크기를 나타내는 양’을 말한다. 즉 끈적거림의 정도를 표시한다. 다음 제시된 레이놀즈 수에 의하면 유속은 점도와 반비례한다.

(단, υ = 유속, d = 유로의 지름, ρ = 유체의 밀도, η = 유체의 점성계수, ν = η/ρ = 유체의 동점성 계 수)

종이미세유체키트에서의 점도(viscosity)와 시간당 이동거리의 관계식은 다음과 같다.

  



 cos

(단, 장력: γ, 점도: μ, 모세혈관 벽과 유체의 접촉각도: θ, 이동거리: x, 시간: t, 모세관 반경: r) 이다. 즉, 시간당 이동거리 



 이다^.

㉡ 정상인 혈액과 동일한 점도의 용액 제조

건강한 사람의 평균적인 혈액점도는 3~5cP로 물의 1.8배 정도이다. 그리고 글리세롤은 순도 99%일 경우 물의 1150배 정도의 점도를 지니고 있다. 따라서 다음 식이 성립한다.

물의 점도 : 혈액의 점도 = 1 : 1.8 → 혈액 점도 = 1.8 × 물의 점도 물의 점도 : 글리세롤의 점도 = 1 : 1150 → 물의 점도 = _



글리세롤의 점도

혈액의 점도 = _^{글리세롤의 점도}_ × 1.8 = _{}^ × 글리세롤의 점도 혈액의 점도 = _



 × 글리세롤의 점도

위의 식에 따라 혈액의 점도는 글리세롤 점도의 _^ 배이므로 글리세롤을 증류수로 640배 희 석하여 혈액과 동일한 점도의 용액을 제조하기로 한다. 이외 피의 점도가 높아짐에 나타나는 hyper blood syndrome의 기준이 되는 정상인의 4배 점도 혈액, 매우 묽다 판단되는 0.1배의 점도 용액, 묽다 판단되는 0.2배의 점도 용액, 약간 위험하다 생각되는 2배의 점도 용액을 제조 하기로 한다.

(3) 실험 준비물

PT bottle(15ml) 5개, 99% 글리세롤, 정제수, 피펫, 식용 색소(R), 동일한 채널 5개, 스톱워치 (4) 실험 방법

㉠ 다음과 같은 비율로 용액을 제조한다.

용액 증류수 글리세린 상대적 점도

용액1 12ml 0.075ml 정상 피의 점도×4

용액2 12ml 0.0375ml 정상 피의 점도×2

용액3 12ml 0.02ml 정상 피의 점도

용액4 12ml 0.00375ml 정상 피의 점도×0.2

용액5 12ml 0.001875ml 정상 피의 점도×0.1

㉡ ㉠의 각 용액에 0.05g의 식용색소를 넣고 잘 섞어준다. (유체의 이동을 비교적 자세히 확 인하기 위해 첨가한다.)

㉢ 밑의 그림과 같이 선 굵기 3pt, 채널 폭 0.5cm, 칩의 전체 크기 5×5(cm)인 채널을 microsoft power point 프로그램의 도형을 이용해 제작한다.

(혈액의 유동성을 보다 용이하게 관찰하기 위해 일자형 채널로 제작하였으며 그 옆에 눈금자를 배치했다.)

㉣ 핫플레이트에서 180°C로 2분 40초 가열하여 채널을 완성한다.

㉤ ㉠에서 제조한 용액을 각 채널에 30㎕씩 흘리고 1분, 2분, 3분 동안 흐른 길이를 측정한다.

(5) 실험 결과

[그림 8.2]는 5가지 용액을 같은 플레이트 위에 동일 양 떨어뜨린 모습이다. 왼쪽부터 오른쪽으 로 갈수록 점차 점도가 낮아지는 것을 육안으로도 확인할 수 있다. 용액 제조가 성공적이었음 을 알 수 있는 사진이다.

[그림 8.1] 5가지 용액의 모습

[그림 8.2] 5가지 용액을 플레이트에 떨어뜨린 모습

종이미세유체칩의 채널에서 액체를 떨어뜨렸을 때의 유동 결과는 다음 표와 같다.

정상 혈액점도의 0.1배 용액

정상 혈액점도의 0.2배 용액

정상 혈액 점도의 용액

정상 혈액 점도의 2배 용액

정상 혈액 점도의 4배 용액

1분 1.6cm 1.4cm 1.2cm 1.2cm 1.2cm

2분 2.6cm 2.4cm 2cm 1.8cm 1.6cm

3분 3.2cm 3cm 2.5cm 2.3cm 2.0cm

[표 8.3] 점도가 서로 다른 용액을 떨어뜨리고 1분, 2분, 3분이 지난 후의 길이

[그래프 8.4] 점도에 따라 1분간 이동한 평균 유동 거리

[그래프 8.4]은 각각의 액체를 흘리고 0-1분간 이동한 거리, 1-2분간 이동한 거리, 2-3분간 이 동한 거리를 산술평균한 값을 이용하여 그린 그래프이다. 이 그래프를 통해 종이미세유체채널 에서 용액의 점도와 유동성의 반비례 관계는 변하지 않는다는 것을 확인 할 수 있었다. 그래프 에서 접선의 기울기가 점차 작아지고 있는 것으로 보아 용액의 점도가 증가할수록 액체의 유 동성이 낮아지는 정도가 더뎌지는 것으로 보인다.

(6) 고찰 및 토의

유체의 점도와 유속 관련 식에 의하면 점도가 낮을 때에는 접선의 기울기가 비교적 작고 점도 가 높아질수록 그 기울기가 커지게 된다. 하지만 본 실험에서의 데이터에 의하면 그 반대가 되 어버렸다. 그 원인을 실험 시 주변 환경과 관련하여 파악해 보았다. 두 채널 중 한 채널의 위 치가 에어컨과 비교적 가까운 곳에 위치하여 액체의 증발 및 유동에 영향을 주었던 것으로 생 각되며, 본 실험을 할 때 밑에 종이와 같은 것을 두고 액체를 흘리게 되면 뒤의 저항 때문에 액체가 유동하지 않다 후에 한꺼번에 밀려와 유동하는 일이 있어 두 물체 위에 채널을 두어 띄운 상태에서 실험을 했다. 그런데 그 둘의 높이는 완벽하게 일정하지 않았다. 이는 채널에 경사면을 생성시키게 되었고 이것이 액체의 유동속도에 영향을 준 것으로 판단된다.

9. 점도가 서로 다른 혈액의 제조 및 유동성 측정

(1) 실험 목적

정상 피와 점도가 비슷한 용액, 그보다 점도가 높은 용액을 제조해 종이미세유체 채널에서의 특정 시간 당 이동거리를 측정한다.

(2) 준비물

사람 혈액 약 50ml, PT bottle, 마이크로 피펫, 종이미세유체 채널, 원심 분리기, 항응고제, 증 류수

(3) 실험 과정

㉠ 밑의 사진과 같이 선의 굵기 _{ }



pt, 폭 3mm 전체 크기 1.5×2(cm)인 종이미세유체칩을 제 작한다.

㉡ 인쇄한 채널을 180°C로 2분 40초 가열하여 큐링작업을 완성한다.

㉢ 혈액을 3ml씩 3병 채혈한다.

㉣ 그 중 두 병은 항응고제를 첨가한 후 원심분리기를 이용해 혈구와 혈장을 분리한다.

㉤ 적혈구의 농도를 다음과 같이 다르게 하여 혈액의 점도를 조절한다.

㉤ 각각의 용액과 증류수를 1 : 1 비율로 섞는다. (혈액 그 자체만으로는 종이미세유체채널에 서 이동하지 않아 유속 측정이 불가능하기 때문이다.)

㉥ 채널에 ㉤에서 만든 용액을 20μl 흘린다.

㉦ 각 용액이 간 거리를 일정 시간을 두고 측정한다.

용액 용액제조방법 혈액의 적혈구 농도

용액1(정상) Whole Blood 그대로 사용 46%(병원 검사 결과 값)

용액2(hyperviscosity) 원심 분리된 혈구와 혈장 중 혈장 성분

만 1/3을 제거 ^

×  56%

용액3(polycythema 가능) 원심 분리된 혈구와 혈장 중 혈장 성분

만 2/3을 제거 ^

×  71%

(4) 실험 결과

혈액에서 점도와 관련하여 가장 많은 상관관계가 있는 것은 적혈구 양, 헤마토크릿 수치이다.

이러한 연유로 이번 실험에서는 헤마토크릿 수치를 이용해 점도를 조절하였다. 원래 정상적인 몸 상태를 가지고 있는 사람의 헤마토크릿 수치는 성인 여성 기준 42%에서 47%정도로 이때 다른 곳에 이상이 없다면 정상적인 혈액의 점도가 나오게 된다. 하지만 헤마토크릿 수치가 증 가하게 되면 점도는 증가하게 된다. 이를 고려해 각각의 _

전체

적혈구× 가 46인 정상의 혈액, 56인

hyperviscosity로 여겨지는 혈액, 71인 hyper viscosity이면서 polycythema가 가능한 혈액으로 그 비율을 조절했다.

[표9.1]은 각 용액이 채널에서 이동할 때 10초 간격으로 이동한 거리이다.

정상 56%(_^적혈구_전체 × ) 71%(_^적혈구_전체 × )

10s 3 1 0.5

20s 4 1.5 1

30s 5 1.5 1.2

40s 5.5 2.5 1.4

50s 6 3 1.4

60s 7 3.5 1.4

70s 7.4 3.5 1.6

80s 7.8 4 1.6

90s 8 4.1 1.7

100s 8.2 4.1 1.7

110s 8.5 4.2 1.8

120s 8.7 4.3 1.8

130s 9 4.5 1.8

[표 9.1] 점도가 다른 혈액+증류수를 키트에 떨어뜨렸을 때 각 시간당 이동한 거리

[그래프 9.2] 점도를 달리한 혈액+물의 시간 당 이동거리

[그림 9.3] 용액 1의 130초 이동거리

[그림 9.4] 용액 2의 130초 이동거리

[그림 9.5] 용액 3의 130초 이동거리

위 그래프를 살펴보면 용액1, 2, 3이 동일 시간 동안 이동거리는 명확하게 차이가 난다. 이 중 에서도 그 차이를 가장 극명하게 볼 수 있는 부분은 130초에서이다. 각각의 용액들이 130초 동안 키트에서 이동한 거리는 용액1 9cm, 용액2 4.5cm, 용액3 1.8cm 이다. 점도가 높을수록 같은 시간 동안 이동한 거리가 줄어드는 것을 관찰 할 수 있었다. 이 실험을 통해 종이미세유 체칩으로 혈액의 점도를 측정할 수 있고 이를 통해 질병의 유무를 좀 더 쉽게 판단할 수 있음 이 확실해졌다. 130초 동안 이동한 거리가 8cm근처이면 정상 점도, 4cm 이하면 높은 점도, 1cm 이하면 매우 위험한 점도로 판단하면 된다. 그러나 더 많은 실험을 통해 데이터를 일반화 해야하는 과제가 남아있다.

(5) 고찰 및 토의

위 실험을 진행할 때 가장 당황스러웠던 점은 혈액의 원액을 본 키트에 떨어뜨렸을 때 흐르지 않았다는 것이다. 지난 실험에서 진행했던 혈액의 점도를 모사한 용액과 달리 진짜 혈액을 떨 어뜨렸을 때는 그 점도가 더욱 진했던 것인지 액체는 종이를 타고 흘러내려가지 못했다. 키트 에서 흐르게 하기 위해 증류수와 혈액을 1:1비율로 섞어 보다 점도를 낮춘 후 키트에 흘렸더니 훨씬 용액이 잘 흘렀으며 그 점도에 따른 차이 역시 변함이 없었다. 물론 실제 혈액의 점도를 측정하고자 할 때 사람의 피와 동량의 증류수를 섞어 키트에 떨어뜨려야 하는 불편함이 있을 수 있다. 그러나 가격적인 면의 장점이 매우 우수하므로 이것이 큰 문제는 아닐 것이라고 판단 된다. 또한, 종이미세유체칩 키트 자체에 용액을 흘렸을 때에는 밑바닥으로 용액이 새어나갔으 나 이를 방지하기 위해 키트 뒷면에 테이프를 붙여 용액이 새어나가지 못하게 했다. 결과는 매 우 성공적이었고 아래로 새어나가는 것 없이 실험을 진행할 수 있었다.

Ⅲ. 연구 결과 및 시사점 □ 연구 결과

○ 헤마토크릿 레벨 측정키트(HCT키트, 지렁이 모양 채널)로 측정되는 R-HCT(실험값)값이 실제 혈액의 헤마토크릿 레벨(HCT)과 3%내의 오차로 측정되었다. 이를 통해, 본 연구팀은 이 값싼 키트(0.02원 미만)는 저개발국가에 적정기술로 사용되기에 충분히 적절하다고 결론지었다. 또한, 혈액의 점도를 간단한 채널을 통해 쉽게 확인해볼 수 있음을 확신할 수 있었다.

□ 시사점

○ 본 연구를 통해 빈혈은 여러 가지 질병과 연관되어 사망에 이르게까지 하지만 본 연구에서 제작된 키트로 저개발국가 사람들이 조기진단을 받아 조기치료로 사망률을 줄일 수 있게 하고자 함.

○ 혈중 적혈구의 용적률을 측정할 수 있는 초저가/초간단 헤마토크릿 레벨 측정용 종이미세유체칩, 혈액 점도를 측정할 수 있는 초처가/초간단 혈액점도 측정용 종이미세유체칩을 개발하는 좋은 계기가 되었다.

Ⅳ. 홍보 및 사후 활용

○ 희석하지 않고 환자가 바로 혈액을 투여하면 Rf-HCT값이 나오도록, 응고현상을 방지하기 위한 추가적인 기술 연구(Innet 부분에 Heparin 또는 ETDA등의 항응고제 코팅 등)를 진행하고자 함. 이를 통해, 3%의 오차라도 줄이기 위해 정확도가 높은 키트 개발을 하고자함.

○ 논문 개제 및 과학전람회 논문 발표 및 특허를 출원할 예정.

○ 내년 과학중점 고등학교에서 열리는 ‘과제연구대회‘에서 HCT키트를 통한 진성다혈구증 (Polycythemia, PV) 측정 실험까지 진행하여 본 키트의 저개발국가에서의 실용성을 더욱 높이고 자함.

Ⅴ. 참고문헌

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