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©The Korean Society of Food Science and Technology
한방처방제추출물의 항산화 및 항염증 활성
이성규*·이은주·박우동·김종부·최상원1
(주)엔유씨전자 바이오연구소, 1대구가톨릭대학교 식품영양학과
Antioxidant and Anti-inflammatory Activities of Extracts from Korean Traditional Medicinal Prescriptions
Sung Gyu Lee*, Eun-Ju Lee, Woo-Dong Park, Jong-Boo Kim, and Sang-Won Choi1 Bio Research Institute, NUC Electronics Co. Ltd.
1Department of Food Science and Nutrition, Catholic University of Daegu
Abstract Water and ethanol extracts of 16 different Korean traditional oriental prescriptions used widely for prevention of degenerative arthritis were prepared and their total phenolic and total flavonoid contents were quantified. Additionally, antioxidant and anti-inflammatory activities of water, ethanol and enzyme-treated extracts were determined by in vitro assays. Total phenolic and total flavonoid contents of three extracts from the 16 different medicinal prescriptions varied from 10.03-78.03 and 0-16.24 mg/g, respectively. Among the three extracts of 16 different medicinal prescriptions tested, ‘Mahangeuigamtang’ showed the potent full term for DPPH (RC50=71.26, 27.33, 63.00µg/mL) and full term for ABTS (RC50=21.11, 27.45, 152.11µg/mL) radical scavenging activities, and its water and ethanol extracts exhibited significant cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitory activity (49.10 and 69.06%, respectively). Ethanol and enzyme-treated extracts of ‘Euieuiintang’ exerted the strongest COX-2 inhibitory activity (68.23 and 75.05%, respectively). ‘Mahangeuigamtang’ and ‘Euieuiintang’ may be useful as potential therapeutic agents for treatment of degenerative diseases, such as inflammation and aging.
Keywords: traditional medicinal prescriptions, total phenolic content, total flavonoid content, free radicals, COX-2
서 론
생체 내에서는 에너지 생산을 위해 산화과정 중에 상당량의 활 성산소들이 생성되며, 활성산소가 순간적으로 다량 발생되거나 만성적으로 활성산소가 발생하게 되면 세포 구성성분과 강하게 반응하여 세포와 조직에 손상을 가하고 지속적인 손상은 DNA 변성, 지질 산화, 단백질 분해 등을 초래하게 된다(1-3). 이러한 활성산소에 의한 세포의 손상을 방지하는 물질에는 superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GPX), catalase(CAT), glu- tathione reductase, glutathione-S-transferase 등과 같은 항산화 효소 와 L-ascorbic acid, β-carotene 및 α-tocopherol 같은 비효소적 항 산화물질이 존재한다(4). 최근 합성항산화제의 독성 및 안전성이 문제시되면서 천연 유래의 보다 안전하고 효과적인 항산화물질 의 개발이 활발히 이루어지고 있다(5).
염증반응은 체내에서 발생한 산화적 스트레스에 의해 촉진되 는데, 산화적 스트레스는 세포사멸 뿐만 아니라 퇴행성 질환을 일으키는 특정세포의 유전자 발현을 증가시켜 염증 반응을 개시 하거나 약화시킨다. 유해한 자극 감염 및 외상 등에 의해 염증이 발현되면 세포막 인지질로부터 arachidonic acid(AA)가 유리된 후
cyclooxygenase(COX)의 작용을 거쳐 prostaglandin(PG)류의 다양 한 염증반응의 매개체들을 생성한다(6). COX에는 2가지 isozyme 이 존재하며, COX-1은 위, 신장을 비롯한 여러 조직에 발현되어 조직의 항상성을 유지하는 반면, COX-2는 염증성 자극에 의해 단시간에 유도되는 발현현상을 나타내기에 이를 효과적으로 저 해하는 물질은 부작용 없는 염증치료제로 널리 사용할 수 있다.
최근 천연을 선호하는 소비자의 기호성 증대와 더불어 사회 전 반적인 웰빙 열풍을 타면서 한약 및 생약재 중 함유되어 있는 생 리활성물질을 건강기능식품의 신소재로 개발하려는 시도가 많이 이루어지고 있다. 이러한 천연물 소재에는 항암, 항고혈압, 항당 뇨 및 항산화성 단백질, 아미노산, 비타민 뿐만 아니라 페놀산, 시남산, 레스베라트롤, 리그난, 플라보노이드 및 탄닌 등의 폴리 페놀화합물이 잘 알려져 있다(7).
우리 나라를 비롯한 동양권에서는 예로부터 다양한 종류의 질 병 치료를 위해 한약 및 생약재의 혼합물인 한방처방제를 사용 하여 왔으며, 오랜 기간의 경험을 근거로 생리활성 효능이 검증 되어 있고, 부작용이 적기 때문에 많이 이용되고 있다. 이러한 한 방처방제는 단일 약재가 아니라 여러 가지 한약 및 생약재로 구 성되기 때문에 다양한 성분의 복합적인 효과로 광범위한 효능을 나타낼 수 있다(8,9). 그러나 한방처방제는 다양한 생약 종류별 특이한 구성성분으로 이루어져 있어 생약들의 배합비와 추출방 법에 따라 기능성 효능이 달라질 수 있다(10).
따라서, 본 연구는 현재 민간 및 한방에서 관절염 치료 생약 처방제로 널리 사용되고 있는 16종의 복합처방제로부터 항산화 및 항염증 작용을 나타내는 한방처방제의 발굴을 통하여 새로운 관절염치료제 개발에 필요한 기초적인 자료를 제공하려고 한다.
*Corresponding author: Sung Gyu Lee, Bio Research Institute, NUC Electronics Co. Ltd., Daegu 702-503, Korea
Tel: 82-53-665-5062 Fax: 82-53-353-7018 E-mail: [email protected]
Received May 3, 2011; revised July 14, 2011;
accepted July 20, 2011
재료 및 방법
실험재료
본 실험에 사용된 한방처방제는 동의보감, 상한론, 동의수세보 원 및 이간방 등의 한의학 관련 서적과 민간처방에서 관절염 치 료 처방제(거풍한습, 소풍청열, 풍습신동)로 널리 사용되고 있는 16가지 한방처방제를 사용하였으며(Table 1), 모든 약재는 2010년 대구 약전시장에서 국내산 한약재를 구입하였다.
시약
본 실험에 사용한 DPPH, ABTS, potassium persulfate, L-ascor- bic acid, β-glucosidase, indomethacin, aluminium nitrate, potas- sium acetate 및 quercetin는 Sigma Chem. Co.(St. Louis, MO, USA)로부터, tannic acid, arachidonic acid, phosphoric acid는 Wako Pure Chem. Ind. Ltd.(Osaka, Japan)로부터, 그리고 COX inhibitor screening assay kit는 Cayman Chem. Co.(Ann Arbor, MI, USA)로부터 각각 구입하여 사용하였다. 그 외 모든 시약은 분석용 특급 시약을 사용하였다.
복합생약추출물 제조
복합생약처방제의 물 및 에탄올추출물의 제조는 다음과 같이 실시하였다. 먼저 열수추출물의 제조는 한방처방제 100 g에 대해 10배의 이온수를 넣어 40oC 초음파추출기(JAC-4020, KODO Tech- nical Research Co., Ltd., Hwaseong, Korea)에서 3시간 동안 2회 반복 추출한 후 여과(Whatman No 2, Maidstone, England) 및 감 압농축(N-1000S-WD, Eyela Co., Tokyo, Japan)하여 얻은 열수추 출물에 이온수 100 mL로 용해시켜 4oC에 하루 방치한 후 상층액 을 다시 감압농축 후 동결건조(FDU-1100, Eyela Co.)하여 열수추 출물을 제조하였다. 에탄올추출물의 경우 80% 에탄올을 이용하 여 열수추출물 제조방법과 동일하게 제조하였다. 그리고 에탄올 추출물의 생리활성을 배가시키기 위해 제조한 효소추출물은 에 탄올추출물 1 g에 20% 에탄올용액 100 mL를 가하여 현탁시킨 후 여기에 1 mL의 β-glucosidase를 첨가하여 shaking incubator에서 50oC, 12시간 동안 배양한 후 5,000 rpm으로 원심분리하여 상층 액을 회수하였다. 회수된 상층액에 20 mL의 n-부탄올로 2회 분 획하여 얻은 상층을 감압농축 후 동결건조시켜 효소처리 에탄올 추출물을 획득하였다.
총 폴리페놀함량 측정
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(11)을 응용하였다. 각 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 다시 증류수로 10배 희석한 희석 액 2 mL에 2배 희석된 Folin 시약(Sigma Co.) 2 mL을 첨가하여 잘 혼합하였다. 혼합액을 3분간 방치한 다음 10% Na2CO3(Sigma Co.) 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/visible spectrophotome- ter(UVIKON 922, Kontran Co., Milan, Italy) 700 nm에서 흡광도 를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid(Sigma Co.)를 이용한 표준곡선은 tannic acid의 최종농 도가 0, 5, 25, 50, 75 µg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하여 구하였다.
총 플라보노이드 함량 측정
시료의 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등(12)의 방법 을 응용하여 측정하였다. 각 샘플 0.1 mL와 80% 에탄올 0.9 mL 을 혼합한 혼합물 0.5 mL에 10% aluminium nitrate(Sigma Co.)와 1 M potassium acetate(Sigma Co.) 0.1 mL 그리고 80% 에탄올
4.3 mL을 가하여 실온에 40분 방치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 quercetin(Sigma Co.)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
DPPH radical 소거활성 측정
시료의 free radical 소거활성은 stable radical인 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별 로 희석한 희석액 800 µL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용 액 200 µL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도 를 측정하였다. 각 시료의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하 지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내었다.
ABTS radical 소거활성
ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ cation decolorization assay방법(13)에 의하여 시행하였다. 7 mM ABTS 와 2.45 mM potassium persulfate(Sigma Co.)를 최종농도로 혼 합하여 실온인 암소에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성 시킨 후 732 nm에서 흡광도 값이 0.70(±0.02)이 되게 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 용액 990 µL 에 sample 10 µL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도 를 측정하였다. ABTS radical의 소거활성은 RC50 값으로 표시 하였다.
COX-2 저해 활성 측정
COX-2 저해 활성 측정은 COX inhibitor screening assay kit (Cayman Chemical Co.)를 이용하여 실험하였다. 시료 20 µL에 hematin 10µL, 효소 5 µL, buffer 950 µL를 넣고 37oC에서 반응 후 10 µL의 아라키돈산을 첨가하여 37oC에서 2분간 반응시켜 COX-2를 활성화시킨 후 이를 50 µL를 취하여 200 µL의 색원체 를 넣은 후 25oC에서 90분간 반응시킨 후 ELISA autoreader (UVN340, Biochrom Ltd., Holliston, MA, USA)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 양성대조군으로 비스테로 이드성 소염제(NSAIDs) 중의 하나인 indomethacin(Sigma Co.)을 사용하였으며, 다음 식에 따라 저해율을 산출하였다.
Inhibition effect (%)=
S: ∆O.D. of sample, C: ∆O.D. of control 통계처리
모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean±SD로 나타내었으며, 실 험결과의 통계분석은 SAS version 6.12(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 평균화 표준오차, Duncan’s multiple range test 에 의해 시료간의 유의적 차이(p<0.05)를 검정하였다.
결과 및 고찰
총 폴리페놀 함량
식물계에 널리 분포되어 있는 폴리페놀화합물은 천연 색소로 서 뿐만 아니라 생체 내 생성되는 활성산소를 제거하는 천연항 산화물로서 잘 알려져 있다. 폴리페놀화합물은 한 분자내에 2개 이상의 phenolic hydroxyl기를 가진 방향족 화합물로서 페놀산 뿐 만 아니라 시남산유도체, 안토시아닌, 플라보노이드, 리그난, 레 스베라트롤 및 탄닌 등 약 1,000 종류 이상의 다양한 종류가 있
C–S
( )
---C
Table 1. The composition of 16 different medicinal prescriptions widely used for prevention of degenerative arthritis
No. Prescription Source Component Weight (g)
1 Gamiboeumhwan Donguibogam
Phellodendron amurense Ruprecht Anemarrhena asphodeloides Bunge Achyranthis japonica Nakai Eucommia ulmoides Oliv.
Morinda officinalis How Rehmanniae Radix Preparat Corunu officinalis sieb.
Cistanche deserticola Y.C.Ma Poria cocos Wolf
Lycium chinense MILL Polygala tenuifolia Willd.
Dioscorea batatus Decne.
Cervus nippon Temminck Geoclemys reevesii Gray
8.0 8.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 4.0
2 Gamisamgieum Private prescription
Rehmanniae Radix Preparat Eucommia ulmoides Oliv.
Achyranthis japonica Nakai Angelica gigas Nakai Lycium chinense MILL Paeonia lactiflora Pall.
Cnidium officinale Makino Poria cocos Wolf
Cinnamomum loureirii Nees.
Aralia continentalis Kitagawa Angelica dahurica Radix Glycyrrhiza glabra L.
Zingiber officinale Roscoe Zizyphus jujuba var. inermis Rehder
12.00 6.0 6.0 6.0 6.0 6.0 4.0 4.0 4.0 2.8 2.8 2.8 4.0 4.0
3 Ganghwaljetongeum Private prescription
Ostericum Koreanum Kitagawa Atracylodes japonia Koidzumi Aralia continentalis Kitagawa Paeonia lactiflora Pall.
Sinomenium acutum Thunb.
Clematis mandshurica Rupr.
Angelica gigas Nakai Poria cocos Wolf Alisma canaliculatum Akebiae lignum
Aurantii nobilis Pericarpium Chenomeles sinensis Phellodendron amurense Glycyrrhiza glabra L.
6.0 6.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2.8 2.0
4 Gyejakjimotang Keumkweyoyak
Cinnamomum loureirii Nees.
Anemarrhena asphodeloides Glehnia littoralis Radix Zingiber officinale Roscoe Paeonia lactiflora Pall.
Ephedra sinica
Astractylis Koerana Nakai Glycyrrhiza glabra L.
Aconitum carmichaeli
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 4.0 1.5 1.0
5 Gyejigachulbutang Yoshimasu Todo
Cinnamimum cassis Blume Paeonia lactiflora Pall.
Zizyphus jujuba var. inermis Rehder Zingiber officinale Roscoe Atracylodes japonia Koidzumi Glycyrrhiza glabra L.
Aconitum carmichaeli
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2.0 1.0
Table 1. Continued
No. Prescription Source Component Weight (g)
6 Nodugagamtang Private prescription
Catalpa ovata
Eucommia ulmoides Oliv.
Achyranthis japonica Nakai Phlomis umbrosa Turcz.
Clematis mandshurica Rupr.
Acanthopanax senticosus Kalopanax pictus
Sorbus commixta HEDL cortex Caragana chamlagu
Chaenomeles Sinensis Gleditsiae spina
Lonicera japonica Thunb.
Glycyrrhiza glabra L.
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 1.5 0.750
7 Mahangeuigamtang Donguibogam
Ephedra sinica Prunus armeniaca
Coxi lacryma-jobi var. mayuen Stapf Glycyrrhiza glabra L.
4.0 3.0 10 2.0
8 Bujatang Sanghannon
Aconitum carmichaeli Astractylis Koerana Nakai Poria cocos Wolf Paeonia lactiflora Pall.
Panax ginseng C.A. Meyer
0.5 5.0 4.0 4.0 3.0
9 Sogyughwalhyeltang Donguibogam
Angelica gigas Nakai Rehmanniae Radix Preparat Cnidium officinale Makino Astractylis Koerana Nakai Poria cocos Wolf Prunus percica Paeonia lactiflora Pall Achyranthis japonica Nakai Clematis mandshurica Rupr.
Sinomenium acutum Thunb.
Ostericum Koreanum Kitagawa Glehnia littoralis Radix Gentianae Radix Zingiber officinale Roscoe Aurantii nobilis Pericarpium Angelica dahurica Radix Glycyrrhiza glabra L.
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.0
10 Sopunghwalhyeoltang Donguibogam
Angelica gigas Nakai Cnidium officinale Makino Clematis mandshurica Rupr.
Angelica dahurica Radix Sinomenium acutum Thunb.
Phellodendron amurense Ruprecht Arisaematis Rhizoma
Atracylodes japonia Koidzumi Ostericum Koreanum Kitagawa Cinnamimum cassis Blume Carthamus tinctorius L.
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0.9
11 Sipmijwasan Yiganbang
Astractylis Koerana Nakai Poria cocos Wolf Angelica gigas Nakai Cnidium officinale Makino Rehmanniae Radix Preparat Paeonia lactiflora Pall Astragalus membranaceus Cinnamomum loureirii Nees.
Zizyphus jujuba var. inermis Rehder Glehnia littoralis Radix
Aconitum koreanum R. Raymond Zingiber officinale Roscoe
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 2.0 2.0 2.0 4.0 1.0 1.0
다(14). 폴리페놀화합물은 그들이 지니고 있는 phenolic hydroxyl 기로 인하여 라디칼포착활성 뿐 아니라 강한 환원력과 금속킬레 이트 작용을 지니고 있어 항산화뿐 아니라 항암, 항당뇨, 항균, 항알러지, 항고혈압 및 항노화 활성을 지니고 있는 중요한 phy- tochemical로 각광을 받고 있다(15-18).
16종의 한방처방제의 열수추출물, 에탄올추출물 및 효소처리추 출물의 총 폴리페놀 함량을측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다.
16종 한방처방제추출물의 폴리페놀 함량은 10.03-78.03 mg/g의 범 위를 나타내었으며, 이 중 마행의감탕(7번) 에탄올추출물이 78.03 mg/g으로 16종의 한방처방제 중 가장 높은 폴리페놀 함량 Table 1. Continued
No. Prescription Source Component Weight (g)
12 Ojeoksan Donguibogam
Atracylodes japonia Koidzumi Aurantii nobilis Pericarpium Magnolia officinalis Platicodon grandiflogma Citrus aurantium Linn Angelica gigas Nakai Zingiberis Rhizoma Paeonia lactiflora Pall Poria cocos Wolf Cnidium officinale Makino Angelica dahurica Radix Pinellia ternata Cinnamomum cassia Glycyrrhiza glabra L.
8.0 4.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 2.8 2.8 2.8 2.8 2.4
13 Woogeumcheonhwangtang Private prescription
Achyranthis japonica Nakai Lonicera japonica Thunberg Angelica gigas Nakai Cnidium officinale Makino Paeonia lactiflora Pall Rehmanniae Radix Preparat Angelica dahurica Radix Psoralea corylifolia Linne Eucommia ulmoides Oliv.
Drynariae Rhizoma Clematis mandshurica Rupr.
Glehnia littoralis Radix Chenomeles sinensis Glycyrrhiza glabra L.
5.0 5.0 2.0 2.0 2.0 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
14 Euieuiintang Donguibogam
Ephedra sinica Angelica gigas Nakai Astractylis Koerana Nakai
Coxi lacryma-jobi var. mayuen Stapf Cinnamimum cassis Blume Paeonia lactiflora Pall Glycyrrhiza glabra L.
4.0 4.0 4.0 8.0 3.0 3.0 2.0
15 Cheongonhwayeomtang Donguisusebowon
Arisaematis Rhizoma Poria cocos Wolf Zingiber officinale Roscoe Pinelliae rhizoma
Atracylodes japonia Koidzumi Aurantii nobilis Pericarpium Ostericum Koreanum Kitagawa Angelica dahurica Radix Sinapis alba L.
Glycyrrhiza glabra L.
Atracylodes japonia Koidzumi
3.0 3.0 3.0 4.0 4.0 2.0 1.5 1.5 1.5 1.0 4.0
16 Haeuigamhwangtang Private prescription
Kalopanax pictus
Coxi lacryma-jobi var. mayuen Stapf Achyranthis japonica Nakai Cnidium officinale Makino Ostericum Koreanum Kitagawa Lycium chinense Miller
Acanthopanax gracilistylus Smith Glycyrrhiza glabra L.
Rhemanniae Radix Crudus
8.0 8.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 2.0 4.0
을 보였다. 추출방법에 따라 총 폴리페놀 함량 차이를 보면, 가 미삼기음(2번), 소경활혈탕(9번), 십미좌산(11번), 청온화염탕(15번) 을 제외한 나머지 한방처방제에서 추출방법에 따라 유의적인 함 량 차이를 보였으며, 특히 마행의감탕 에탄올추출물의 폴리페놀 함량이 열수 및 효소처리추출물보다 약 2배 높게 나타났다. 이와 같이 복합생약처방제 폴리페놀화합물의 함량은 추출할 때 사용 한 용매와 추출방법에 따라 다름을 알 수 있었으며, 일반적으로 물보다 에탄올추출물의 폴리페놀 함량이 대체로 높음을 알 수 있 었다. 이러한 생약추출물의 폴리페놀 함량은 추출물 제조 시 사 용하는 용매와 추출방법에 따라 차이가 있다는 전보의 연구결과 (19)와 유사하였다.
총 플라보노이드 함량
플라보노이드는 C6-C3-C6의benzopyrone 기본골격을 지니고 있 는 담황색 내지는 노란색을 띠고 있는 페놀계 화합물의 총칭으 로 자연계에 널리 분포하고 있다(20). 플라보노이는 flavones, flavonols, flavanonones, flavanol 및 isoflavones으로 구성되어 있으 며, 그 종류와 함량은 품종, 재배, 및 가공에 따라 다르며, 항암,
항고혈압, 항염증, 항균, 항산화 및 항노화 작용 등 여러 생리적 작용을 지니고 있어 현재 기능성식품 및 화장품의 신소재로서 널 리 사용되고 있다(21,22).
16종의 한방처방제의 열수추출물, 에탄올추출물 및 효소처리추 출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 Fig. 2와 같다. 총 플라보노이드 함량의 경우 총 폴리페놀 함량의 결과와 달리 열 수추출물에서는 마행의감탕(7번)이 16.24 mg/g, 에탄올추출물에서 는 가미보음환(1번)이 4.85 mg/g, 효소추출물에서는 의이인탕(14 번)이 11.23 mg/g으로 가장 높은 플라보노이드 함량을 나타내었 다. 이와같이 추출에 사용한 용매 및 추출방법에 따라 한약처방 제의 총 플라보노이드 함량 변화를 확인할 수 있었다. 또한, 총 폴리페놀 함량의 경우 효소추출물에서는 폴리페놀 추출 함량이 낮아지거나 비슷한 수치를 보였지만 총 플라보노이드 함량의 경 우 마행의감탕(7번)을 제외한 나머지 15종의 한방처방제의 열수 및 에탄올추출물보다 효소추출물에서 플라보노이드 함량이 증가 하는 것을 확인하였다. 이는 황기(23), 은행잎(24), 함초추출물 제 조 시(25) 효소처리에 의해 유효성분의 추출수율이 향상 되었다 는 보고와 유사한 경향을 보였다.
Fig. 1. Total polyphenols contents of three extracts from sixteen different Korean traditional medicinal prescriptions widely used for prevention of degenerative arthritis. Total polyphenols content (mg/g) was calculated by tannic acid as standard. Each value is mean±SD (n≥3). Refer to Table 1 for No.
Fig. 2. Total flavonoids contents of three extracts from sixteen different Korean traditional medicinal prescriptions widely used for prevention of degenerative arthritis. Total flavonoids content (mg/g) was calculated by quercetin as standard. Each value is mean±SD (n≥3).
Refer to Table 1 for No.
DPPH radical 소거활성
항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으 로 radical 소거 작용은 활성라디칼에 전자를 공여하여 항산화 효 과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 이용되고 있다(26). DPPH 는 hydrazyl의 질소원자가 불안정한 상태로 쉽게 수소원자를 받 아들이는 성질을 가지고 있어 항산화성 물질과 반응하여 수소원 자를 받아들임으로서 자체적으로 가지고 있는 정색성을 잃게 되 는 성질을 이용하여 항산화능의 정도를 측정할 수 있다. DPPH radical법은 DPPH의 환원정도를 기준으로 측정물질의 환원력과 항산화력을 가늠하게 한다(27).
16종의 한방처방제의 열수추출물, 에탄올추출물 및 효소처리추 출물과 인공천연 항산화제로 알려진 BHA, L-ascorbic acid의 DPPH radical 소거활성을 RC50 값으로 비교한 결과는 Fig. 3과 같다. 16종의 한방처방체의 추출물들의 RC50값의 범위는 27.33- 726.33µg/mL의 범위로 나탔다. 열수추출물의 경우 RC50값이 100 µg/mL 농도 이하의 처방제는 총 9종[강활제통음(3번), 계작지모
탕(4번), 계지가출부탕(5번), 노두가감탕(6번), 마행의감탕(7번), 부 자탕(8번), 소풍활혈탕(10번), 우금천황탕(13번), 의인인탕(14번)]
에서 나타났다. 이중 의이인탕(14번) 열수추출물이 68.56 µg/mL 로 가장 우수한 DPPH radical 소거활성을 보였다. 에탄올추출물 의 경우 총 4종[노두가감탕(6번), 마행의감탕(7번), 부자탕(8번), 의인인탕(14번)]에서 100 µg/mL 이하의 RC50 값을 나타냈고, 그 중 마행의감탕(7번) 에탄올추출물은 27.33 µg/mL로 16종의 3가지 추출물들 중 가장 낮은 RC50값을 나타냈다. 다음 효소처리추출 물의 경우 마행의감탕(7번) 효소처리추출물만이 63.00 µg/mL로 100µg/mL 이하의 RC50값을 나타냈으며, 나머지 한방처방제 효 소처리추출물들의 경우 200 µg/mL 이상의 RC50 값을 나타내었 다. 이와 같이 DPPH radical 소거활성이 우수하게 나타난 한방처 방제 추출물은 총 폴리페놀 함량이 높게 나타났던 시료와 유사 한 경향을 보이고 있다. 이는 전자공여능이 phenolic acids와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화작용의 지표라는 보고(28)와 유사하였다.
Fig. 3. DPPH radical scavenging activity of three extracts from sixteen different Korean traditional medicinal prescriptions widely used for prevention of degenerative arthritis. RC50 values were calculated from regression curves using five different concentrations in triplicate experiments. BHA and L-ascorbic acid (L-AsA) were used as positive references. Refer to Table 1 for No.
Fig. 4. ABTS radical scavenging activity of three extracts from sixteen different Korean traditional medicinal prescriptions widely used for prevention of degenerative arthritis. RC50 values were calculated from regression curves using five different concentrations in triplicate experiments. BHA and L-ascorbic acid (L-AsA) were used as positive references. Refer to Table 1 for No.
ABTS radical 소거활성
ABTS는 2,2'-azobis의 색을 띤 양이온 라디칼의 감소에 근거하 여 항산화능을 측정하는 방법으로 생약추출물의 항산화력에 의 해 ABTS radical이 소거되어 청록색으로 탈색된 활성 radical의 저해 정도를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS 소거활성능을 측정 할 수 있고 탈색 반응이 1분 안에 종료되어 단시간에 측정 가능 하다(29). 따라서 16종의 한방처방제의 열수추출물, 에탄올추출물 및 효소처리추출물의 항산화효과를 ABTS radical의 소거활성을 측정하여 radical을 1/2로 소거하는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내어 비교한 결과는 Fig. 4와 같다. 열수추출물의 경 우 RC50값이 100 µg/mL 이하인 총 7종[(강활제통음(3번), 계작지 모탕(4번), 계지가출부탕(5번), 노두가감탕(6번), 마행의감탕(7번), 소풍활혈탕(10번), 및 의이인탕(14번)] 한방처방제 열수추출물에 서 나타났다. 이 중 마행의감탕(7번) 열수추출물이 21.11 µg/mL로 가장 우수한 ABTS radical 소거활성을 보였다. 에탄올추출물의 경우 총 5종[가미보음환(1번), 노두가감탕(6번), 마행의감탕(7번), 부자탕(8번), 및 의이인탕(14번)]이 100 µg/mL 이하의 RC50 값을 나타냈고, 그 중 마행의감탕(7번) 에탄올추출물이 27.45 µg/mL의 농도로 가장 우수하게 나타났다. 효소처리추출물의 경우 100 µg/
mL의 RC50 값을 나타내는 시료는 없었으며, 152.11 µg/mL의 농 도를 보인 마행의감탕(7번) 효소처리추출물이 ABTS radical 소거 활성이 가장 우수했고, 나머지 한방처방제들의 경우 300 µg/mL 이상의 RC50값을 나타내었다.
COX-2의 저해활성
16종의 한방처방제의 열수추출물, 에탄올추출물 및 효소처리추 출물의 COX-2 저해활성을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 먼저 열수추출물의 저해활성을 보면(모두 25 µg/mL에서 측정) 가미삼 기음(2번) 15.91%, 계지가출부탕(5번) 18.34%, 마행의감탕(7번) 49.10% 및 소풍활혈탕(10번) 10.67%로 마행의감탕 열수추출물의
저해활성이 가장 높았으며, 나머지 3가지 열수추출물은 모두 20%
이하의 낮은 저해활성을 보였고 그 외 것은 저해활성이 거의 나 타나지 않았다. 에탄올추출물의 경우 마행의감탕이 69.06%로 가 장 높은 저해활성을 나타내었으며, 그 다음으로 의의인탕 68.23%, 노두가감탕 54.5%, 소경활혈탕 45.74%, 가미삼기음, 강활제통음 및 계작지모탕은 모두 42% 정도로 나타났고 그 외 것은 40% 이 하의 낮은 저해활성을 나타내었다. 마지막으로 효소처리추출물의 경우 의이인탕(16번)이 75.05%로 가장 높은 COX-2 저해활성을 보였으며, 해의감황탕은 48.65%, 소경활혈탕 18.59%로 나타났으 나 그 외 것은 매우 낮거나 저해활성이 거의 없었다. 이와 같이 민간 및 한방에서 관절염 치료제로 널리 사용되고 있는 16가지 한방처방제 중 마행의감탕(7번)의 물 및 에탄올추출물이 총 페 놀, 총 플라보노이드 함량이 최고로 높았으며, 아울러 DPPH 및 ABTS 라디컬 포착활성과 COX-2 저해활성도 가장 높게 나타났 다. 또한, 효소추출물에서는 의의인탕(14번) 가장 높은 COX-2 저 해활성을 나타내었다. 이러한 결과를 미루어 볼 때 한방처방제 추출물의 항산화 및 항염증 활성은 사용한 추출용매 및 추출방 법에 따라 다소 차이가 있음을 알 수 있었고 특히 COX-2 저해 효능이 상당히 차이가 있었으며, 같은 시료라도 추출조건에 따라 효소 저해활성도 차이가 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 실험에 사용된 16종의 한방처방제 중 항산화와 항염 증에 전반적으로 우수한 효능을 보이는 마행의감탕(7번)과 의이 인탕(14번) 한방처방제는 공통적으로 radical 소거활성과(30) 염증 성 cytokine 억제(31)가 우수하다고 보고된 의이인이 가장 많이 함유되어 있는 것을 확인하였고, 이는 Kim 등(32)이 한약재 조 성물 중 금은화 추출물을 첨가한 한약재 조성물에서 유의적으로 전자공여능 활성이 증가하였다는 보고와 Cho 등(33)의 한약재 조 성물 중 선복화 첨가에 따라 전자공여능이 증가하였다는 보고와 유사하게 본 연구에서는 의이인이 많이 함유된 한방처방제에서 항산화 및 항염증 활성이 전반적으로 상승되는 것을 확인하였다.
Table 2. COX-2 inhibition effects of three extracts from sixteen different Korean traditional medicinal prescriptions widely used for prevention of degenerative arthritis
No. Prescription COX-2 inhibition effects (%)
Water extracts Ethanol extracts Enzyme extracts
1 Gamiboeumhwan - 16.38±0.00 -
2 Gamisamgieum 15.91±0.12 42.76±0.16 -
3 Ganghwaljetongeum - 42.53±0.15 -
4 Gyejakjimotang - 42.29±0.03 -
5 Gyejigachulbutang 18.34±1.03 - 03.06±0.71
6 Nodugagamtang - 54.50±0.34 -
7 Mahangeuigamtang 49.10±0.93 69.06±0.18 -
8 Bujatang - 23.28±0.41 -
9 Sogyughwalhyeltang - 45.74±1.11 18.59±0.56
10 Sopunghwalhyeoltang 10.67±0.58 39.42±0.33 03.85±0.94
11 Sipmijwasan - 33.91±0.58 -
12 Ojeoksan - 12.21±0.17 -
13 Woogeumcheonhwangtang - 34.20±0.86 -
14 Euieuiintang - 68.23±0.64 75.05±0.39
15 Cheongonhwayeomtang - 14.32±3.12 -
16 Haeuigamhwangtang - - 48.65±0.12
Indomethacin 95.89±1.05
Each value is mean±SD (n≥3).
COX-2 inhibition acttivity of each sample was measured at 25 µg/mL. Indomethacin was measured at 1 µg/mL.
요 약
본 연구에서는 민간 및 한방에서 관절염 치료 처방제로 널리 사용되고 있는 한방처방제 16종을 선정하여 향후 관절염 예방 및 치료용 기능성식품의 개발 기초 자료로 활용하기 위해 한방처방 제로부터 물, 에탄올 및 효소처리추출물을 제조하고 그들의 항산 화 및 항염증활성을 in vitro assay system을 사용하여 측정하였 다. 16종 한방처방제의 각 추출물의 폴리페놀 함량은 10.03-78.03 mg/g의 범위를 나타내었으며, 이 중 마행의감탕(7번)의 에탄올추 출물이 78.03 mg/g으로 16종의 한방처방제 중 가장 높은 폴리페 놀 함량을 보였다. 총 플라보노이드 함량의 경우 총 폴리페놀 함 량의 결과와 달리 효소추출물에서는 폴리페놀 추출 함량이 낮아 지거나 비슷한 수치를 보였지만 총 플라보노이드 함량의 경우 마 행의감탕(7번)을 제외한 나머지 15종의 한방처방제에서 열수 및 에탄올추출물보다 효소추출물에서 플라보노이드 함량이 증가하 는 것을 확인하였다. 한편, 마행의감탕(7번) 추출물에서 DPPH 및 ABTS 라디컬 포착활성과 COX-2 저해활성도 가장 높게 나타난 반면, 효소추출물에서는 의의인탕(14번)이 가장 높은 COX-2 저 해활성을 나타내었다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 마행의감탕 및 의의인탕을 관절염 치료 한방처방제로 개발할 가능성이 높다 고 생각되며, 향후 보다 상세한 그들의 항산화 및 항염증활성을 조사할 필요가 있다고 생각된다.
감사의 글
본 연구는 지역산업선도기술개발사업 연구과제(과제번호-70004130) 의 일환으로 수행된 결과의 일부로서 연구비를 지원해 준 관계 자에 감사드립니다.
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