PREVENTION RESEARCH □ ORIGINAL ARTICLE □
66 책임저자：박은주, 631-701, 창원시 마산합포구 월영동 449,
경남대학교 식품영양학과
Tel: 055-249-2218, Fax: 0505-999-2139 E-mail: [email protected]
접수일：2013년 1월 3일, 1차 수정일：2013년 1월 8일, 2차 수정일：2013년 1월 14일, 게재승인일：2013년 1월 16일
Correspondence to：Eunju Park
Department of Food and Nutrition, Kyungnam University, 449, Woryeong-dong Masanhappo-gu, Changwon 631-701, Korea
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산수유의 추출 용매별 항산화능과 항유전독성 효과
경남대학교 식품영양학과 이민희ㆍ김정미ㆍ박은주
Antioxidant and Antigenotoxic Effect of Sansuyu Fruit (Corni fructus) Extracted with Various Solvents
Minhee Lee, Jungmi Kim and Eunju Park
Department of Food and Nutritional Science, Kyungnam University, Changwon 631-701, Korea
The objective of this study was to evaluate the antioxidant activities and antigenotoxic effect of Corni fructus extracted with various solvents (Ace; acetone, EtOH: ethanol, and MeOH; methanol). Total phenolic content (TPC), DPPH radical-scavenging activity (RSA), and superoxide dismutase (SOD)-like activity were determined in the samples. Also antigenotoxic effect of Corni fructus was determined by measuring inhibitory effect of H2O2 induced DNA damage using comet assay in human leukocytes. The TPC of the Corni fructus extracts was in order of Ace (0.5 g GAE/100 g) ＜EtOH (2.8 g GAE/100 g) ＜MeOH (4.5 g GAE/100 g). The IC50 of DPPH RSA was significantly different between EtOH, MeOH and Ace, especially Ace (871.1 μg/ml) is two-fold lower than EtOH (458.9 μg/ml) and MeOH (468.2 μg/ml), and the IC50 of SOD-like activity showed similar reduction (EtOH; 827.2 μg/ml=MeOH; 1193.8 μg/ml ＜Ace; 3949.2 μg/ml). MeOH extract of Corni fructus showed the highest ORAC activity among samples. 200 μM H2O2 induced DNA damages in human leukocytes were significantly reduced by the pretreatment with all Corni fructus extracts. Significantly high correlation coefficients were observed between TPC and antioxidant paramaters, but H2O2 induced DNA damage did not have a relationship with TPC and antioxidant paramaters. As a results, the Corni fructus extracts have antioxidant activities and antigenotoxic effect and its activities showed that there were difference between solvent extractions.
Further inverstigation is needed to identify its antigenotoxic compunds. (Cancer Prev Res 18, 66-73, 2013) Key Words: Corni fructus, Antioxidant, Antigenotoxic, Various Solvents
서 론
인체 내에서 정상적인 대사과정 중 생물학적 반응 등 에 의한 내인적인 생성 요인과 담배, 매연, 자외선, 약물, 방사선 등의 외인적 요인에 의해 생성되는 활성산소종 (reacitve oxygen species, ROS)은 지질, 단백질, 유전자 등에
비선택적, 비가역적으로 작용하며, 면역계를 파괴하여 노화뿐만 아니라 후천성 면역결핍증, 심장질환, 당뇨병, 신경계 질환, 암 등과 같은 각종 질환을 야기한다.1∼3) 과 도하게 생성된 ROS는 산화적 스트레스(oxidative stress) 현 상을 일으키고 그 결과로 암 발생의 초기단계인 조직 내 DNA 손상이 일어난다. 이는 DNA 합성과 RNA 전사를 방해하며, 세포 돌연변이를 유발하여 암이 발생하게 된
다.4,5) 이러한 ROS를 억제하기 위해 천연소재로부터 항 산화 물질을 분리하려는 시도가 활발히 이루어지고 있 다.6,7)
층층나무과에 속하는 산수유나무(Cornus officinalis)의 붉은색 열매 씨를 제거한 과육을 산수유(Corni fructus)라 고 하고, 촉나라 대추와 비슷한 생김새와 신맛이 두드러 지게 나타나 촉산초라고도 불린다.8) 산수유는 예로부터 요통, 이명, 다뇨증 및 폐결핵 등의 치료에 효과가 있고, 이뇨작용, 항암 및 항균작용, 단백질의 소화를 돕는 작 용, 혈압강하 작용 등이 있는 것으로 알려져 있다.9) 산수 유의 성분으로는 malic acid, tartaric acid, gallic acid, ursolic acid와 loganin, sweroside, morroniside와 같은 iridoid 배당체, tellimagrandin 1,2, 1,2,3-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,6-tri- O-galloyl-β-D-glucose, gemin D, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D- glucose 등이 보고되었다.10,11)
최근까지 보고된 산수유에 관한 연구로는 항균 및 항
산화성,12∼18) 산수유와 구기자를 이용한 국산 전통차 개
발에 관한 연구,19) 산수유 열매의 화학성분과 건조에 따 른 과육 분리특성,20) 산수유에 함유된 항암물질의 정제 및 특성,21) 산수유로부터 gallic acid 추출 및 HPLC에 의한 정량분석,22) 산수유 종자의 독성과 렙틴 성분,23) 산수유 에탄올 추출물의 생리활성,24) 산수유의 영양성분 분석25) 등이 있다. 그러나 현재까지 산화적 스트레스로 유도된 인체 백혈구의 DNA 손상에 대한 산수유의 보호 효과에 관한 연구는 거의 보고된 바 없으므로 본 연구에서는 산 수유를 다양한 용매로 추출하여 DNA 손상 억제 효과 및 항산화 활성을 측정하고자 하였다.
재료 및 방법 1. 재료
본 실험에서 사용한 산수유는 전남 구례에서 재배한 것으로 마산 어시장 한약재 판매점에서 구매하여 사용 하였다. 항산화력 측정에 사용된 Folin-Ciocalteu 시약은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서 구입 하였고, 2,2-diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH), gallic acid, py- rogallol은 Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)에서 구입 하여 사용하였다. Trizma hydrochloride (Tris-HCl), Ethylene- diaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA), di- methyl sulfoxide (DMSO) 등을 비롯한 기타 시약 및 용매는 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
2. 시료의 추출
산수유 5 g에 100 ml의 용매(Acetone, Ethanol, Methanol)
를 각각 가하여 상온에서 3일 동안 추출하였다. 각각의 추출물은 여과지(Whatman No. 1)로 감압여과한 후, 이것 을 회전진공농축기(Eyela N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 37oC에서 농축하였다. 각 농축물은 50 mg/ml의 농도로 DMSO에 녹여 4oC에서 보관하면서 적당 한 농도로 희석해서 실험에 사용하였다.
3. 총 페놀 함량
총 페놀 함량은 분석방법으로 널리 사용되고 있는 Folins-Denis 방법26)으로 측정하였다. 즉, 시료 1 ml를 취 하여 distilled water (D.W)와 동량희석하고, 1N Folin-Cio- calteu 시약 2 ml를 가하여 실온에서 3분간 방치한 후, 10% Na2CO3용액 2 ml를 가하여 이 혼합액을 1시간 동안 상온에서 방치하였다. 이 혼합물에서 200 μl를 취하여 ELISA reader (Sunrise, Tecan Co. Ltd., Grödig, Austria)을 사 용하여 690 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량 은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로 g GAE (gallic acid equivalents)/100 g 단위로 나타내었다.
4. DPPH 라디칼 소거능 측정
DPPH 라디칼 소거능은 80 μl의 0.2 mM DPPH 에탄 올 용액을 농도별(50, 100, 250, 500, 1000 μg/ml) 시료 20 μl에 가한 후 10초 동안 잘 혼합해 주고 상온에서 10분간 반응시켜 ELISA reader를 사용하여 492 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 무처리구에는 20 μl의 DMSO로 처 리하여 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 DPPH radical 소 거능은 아래의 식에 의해 계산하여 나타내었으며, 각 용 매별로 DPPH radical을 50% 저해하는 농도인 IC50을 구하 였다.
Radical scavenging activity (RSA, %)=(1−A/B)×100 A: 시료 첨가구의 흡광도, B: 무처리구의 흡광도
5. SOD 유사활성 측정
SOD 유사활성은 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/ml로 희 석한 산수유 추출물 50 μl에 50 μl Tris-HCl buffer (pH 8.5)와 7.2 mM pyrogallol 50 μl을 가하여 25oC에서 45분간 반응시킨 후, ELISA reader를 사용하여 405 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 무처리구에는 50 μl의 DMSO로 처리 하여 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 SOD 유사활성은 아래의 식에 의해 계산하여 나타내었으며, 각 용매별로 pyrogallol을 50% 저해하는 농도인 IC50을 구하였다.
SOD-like activity (%)=(1−A/B)×100
A:시료 첨가구의 흡광도, B: 무처리구의 흡광도
6. ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) Assay
Peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 형광의 감소율 변 화에 대한 산수유 추출물의 항산화 활성은 peroxyl radical scavenging capacity (ORACROO·) 분석법27)을 이용하여 측정 하였다. 과산화 라디칼의 생성을 위해 20 mM 2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)를 사용하 였고, 형광표준 용액은 Ou 등28)의 방법에 따라 40 nM flu- orescent를 제조하여 GENios fluorescence plate reader (Tecan, Salzburg, Austria)로 excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm에서 측정하였다. 결과는 vitamin E 수용 성 유도체인 trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2- carbonyl acid) 1 μM에 의해 보호된 curve area와 비교하여 trolox equivalent (μM TE)로 나타내었다.
7. 혈액 내 백혈구 세포 분리
건강한 성인 남성으로부터 채혈한 신선한 전혈 5 ml 을 Histopaque 1077을 이용해 백혈구만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다.
8. 시료의 처리 및 산화적 스트레스 유발
준비된 백혈구 세포에 각 추출물 시료를 50 μg/ml의 농도로 처리하여 37oC에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 백혈구를 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후 인위적으로 산화적 스트레스를 유발하기 위하여 200 μM H2O2를 백혈구에 처리하여 4oC에 5분간 반응시킨 다음 다시 PBS로 세척하였다. Positive control을 위해 산수 유 대신 용매인 DMSO를 처리한 후 200 μM H2O2를 처 리하였고, negative control의 경우에는 H2O2를 처리 하지 않았다.
9. DNA 손상 측정(Comet assay)
Comet assay를 위해 반응을 끝낸 백혈구를 75 μl의 0.7% low melting agarose gel (LMA)과 섞은 후, 1.0% normal melting agarose (NMA)가 미리 덮여진 슬라이드 위에 백 혈구와 LMA의 현탁액이 골고루 분산되게 한 후 유리 덮 개로 덮어 4oC 냉장고에 보관하였다. 젤이 굳으면 유리 덮개를 벗기고 그 위에 다시 0.7% LMA 용매 75 μl로 한 겹 더 덮었다. 미리 준비해 둔 차가운 알칼리 분해 완충용액(2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM tris)에 사용 직전에 1% Triton X-100을 섞은 후 슬라이드를 담 가 저온, 암실에서 1시간 동안 침지시켜 백혈구를 용해 시켰다. 분해가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동수조에 배
열하고 4oC의 차가운 전기영동 완충용액(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH＞13)을 채워 20분 동안 방치하여 DNA의 알칼리 민감 부위가 노출되도록 한 후 25 V/300±
3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛 에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위 해 위의 과정은 전기영동수조를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.4 M Tris 완충용액(pH 7.4)에 10분씩 담가 세척하는 과정을 3회 반복하여 슬라 이드를 건조시켰다. 20 μl/ml 농도의 EtBr로 핵을 염색하 여 유리 덮개로 덮은 뒤 형광현미경(Leica, Wetzlar, Germany) 상에서 관찰하였다. CCD 카메라(Nikon, Tokyo, Japan)를 통 해 보내진 각각의 세포핵 이미지는 Komet 5.0 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, Liverpool, UK)이 설치된 컴 퓨터 상에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손 상 및 산수유 추출물에 의한 손상 보호 효과는 핵으로부 터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA 함량(Fluorescence in tail)을 측정하여 나타내었다. 각 각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
10. 통계처리
모든 데이터의 통계처리는 각 항목에 따라 SPSS for Windows (ver. 14.0)를 이용하여 분석하였고 평균과 표준오 차를 구하여 신뢰수준 95% (p＜0.05)에서 평균값들에 대해 유의성을 검증하였다. 각 항목은 one-way 분산분석(ANOVA) 을 시행하여 F값을 구하고 Duncan's multiple range test를 이 용하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 또한 각 항목 에 대하여 Pearson 상관분석을 실시하였다.
결과 및 고찰 1. 총 페놀 함량
산수유 추출물의 총 페놀 함량 분석 결과는 Table 1에 나타내었다. 그 결과 메탄올 추출물이 4.51±0.01 g GAE (gallic acid equivalents)/100 g로 가장 높았으며, 에탄올 추출 물은 2.83±0.01 g GAE/100 g, 아세톤 추출물은 0.48±0.03 g GAE/100 g 의 총 페놀 함량을 보였다. 이러한 결과는 시료 가 다르기는 하지만 Kim과 Park 등31)의 연구에서 오미자 메탄올 추출물의 총 페놀 함량이 1,183.3±5.1 mg GAE/100 g로 에탄올 추출물과 아세톤 추출물에 비해 유의적으로 높았다는 결과와 비슷한 경향을 보이고 있다. 한편 Jeon 등14)의 연구 결과에서 산수유 에탄올 추출물의 총 페놀 함량은 3.42 g/100 g이었고, Celep 등30)의 연구 결과에서
Table 1. Total phenol contents (TPC) of Corni fructus extrac- ted with various solvents
Solvents1)
Ace EtOH MeOH
TPC g GAE2)/100 g 0.48±0.03a 2.83±0.01b 4.51±0.01c Values are mean with standard deviation. Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p
＜0.05) by Duncan's multiple range test.
1)Ace: acetone extraction, EtOH: ethanol extraction, MeOH:
methanol extraction. 2)GAE: gallic acid equivalents.
Fig. 1. DPPH radical scavenging activity (A) and IC50 (B) of Corni fructus extracted with various solvents. Values are means with standard deviation. Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p＜0.05) by Duncan's multiple range test. Ace: acetone extraction, EtOH: ethanol extraction, MeOH: methanol extraction.
산수유 메탄올 추출물의 총 페놀 함량이 3.13 g GAE/100 g이었다. 이는 본 연구의 에탄올 추출물 및 메탄올 추출 물의 총 페놀 함량과 비슷한 수준이었다.
2. DPPH 라디칼 소거능 측정
보라색의 DPPH 라디칼은 항산화제와의 반응에 의해 라디칼이 소거되어 노란색으로 변하는 점을 이용하여 항산화 활성을 검정하는 방법이다.31) 산수유의 DPPH 라 디칼 소거능과 라디칼을 50% 저해하는 농도인 IC50값은 Fig. 1에 나타내었다. 각 시료의 농도가 증가할수록 라디 칼 소거능이 유의하게 증가하였고. 산수유 추출물의 IC50
은 아세톤 추출물, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물에서 각 각 871.4±9.3 μg/ml, 458.9±4.8 μg/ml, 468.2±2.9 μg/ml 으로 에탄올 추출물과 메탄올 추출물이 아세톤 추출물 에 비해 유의적으로 낮았다. 산수유 에탄올 추출물이 200 ppm (μg/ml)에서 64.3%의 라디칼 소거능을 나타낸 Jeon 등14)의 연구에 비해 본 연구의 산수유 에탄올 추출
물은 250 μg/ml에서 48%으로 라디칼 소거능이 낮았다.
반면 산수유 메탄올 추출물의 경우, Kim 등32)의 연구에 서는 1,000 ppm (μg/ml)에서 67%의 라디칼 소거능을 보 였지만, 본 연구의 메탄올 추출물은 1,000 μg/ml에서 77%의 라디칼 소거능을 나타내 Kim 등32)의 연구 결과에 비해 높은 편이었다. 또한 Jeon 등14)의 연구에서 산수유 에탄올 추출물의 IC50값은 154 ppm (μg/ml)이었고, Lee 등33)의 연구에서 산수유 메탄올 추출물의 IC50값은 189.3 ppm (μg/ml)으로 본 실험의 에탄올 추출물(458.9 μg/ml) 과 메탄올 추출물(468.2 μg/ml)의 라디칼 소거능이 더 낮 게 나타났다. 본 실험에서는 산수유 열매 5 g을 99.5%의 EtOH 또는 MeOH 100 ml를 가하여 실온에서 3일간 방치 하여 추출한 반면, Jeon 등14)의 연구에서는 100 g의 분쇄 한 산수유를 70%의 EtOH 2,000 ml를 가하여 실온에서 12시간 추출하였으며, 이 같은 방법으로 5회 반복하였 다. 또한 Lee 등33)의 연구에서는 분쇄된 산수유 중량 대 비 10배에 해당하는 메탄올로 74oC에서 3시간씩 2회 환 류 추출하였다. 이처럼 추출 용매의 농도와 추출 횟수에 따라 산수유 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 다소 차 이가 있는 것으로 사료된다.
3. SOD 유사활성 측정
SOD 유사활성은 전자 환원으로 반응성이 매우 큰 su- peroxide anion radical을 제거하기 위해 분비되는 super- oxide dismutase (SOD)와 유사한 역할을 하며, 생체 내에서 생성된다.34) 산수유의 SOD 유사활성 측정결과와 라디칼 을 50% 저해하는 농도인 IC50값은 Fig. 2에 나타내었다.
아세톤 추출물을 제외한 각 시료의 농도가 증가할수록
Fig. 2. SOD-like activity (A) and IC50 (B) of Corni fructus extracted with various solvents. Values are means with standard deviation.
Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p＜0.05) by Duncan's multiple range test. NS:
not significant, Ace: acetone extraction, EtOH: ethanol extraction, MeOH: methanol extraction.
Fig. 3. Peroxyl radical-scavenging capacities of Corni fructus extracted with various solvents. Values are means with stan- dard deviation. Values not sharing the same letter are signi- ficantly different from one another (p＜0.05) by Duncan's mul- tiple range test. ORAC values expressed as Trolox equivalents (μM) according to a 1：1,000 dilution of Corni fructus extracted with various solvents. Ace: acetone extraction, EtOH:
ethanol extraction, MeOH: methanol extraction.
SOD 유사활성이 유의하게 증가하였다. 라디칼을 50%
저해하는 농도인 IC50값은 아세톤 추출물, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물에서 각각 3,949.2±518.8 μg/ml, 827.2±15.0 μg/ml, 1,193.8±11.6 μg/ml로, 에탄올 추출물과 메탄올 추출물이 아세톤 추출물에 비해 유의적으로 낮았다. Kim 과 Park29)의 연구에서 다양한 용매로 추출한 오미자의 SOD IC50값이 에탄올 추출물과 메탄올 추출물이 970.3 μg/
ml, 905.7 μg/ml으로 아세톤 추출물(1,579.4 μg/ml)에 비 해 유의적으로 낮았다는 결과와 유사한 경향을 보였다.
4. ORAC assay
ORAC assay는 수소 원자의 전이에 의해 나타는 항산화 능을 반영하는 하는 것으로, peroxyl radical에 대한 항산화 물의 저해능을 측정하는 방법이다. ORAC assay는 수용성 비타민 E를 항산화 대조물질로 사용하고 형광 물질을 결 합시킴으로써 반응도가 민감하여 정확도를 높일 수 있는 방법이다.35) ORAC assay system을 이용하여 산수유 추출 물의 peroxyl 라디칼 제거활성 측정 결과는 Fig. 3에 나타 냈다. 각 용매별 산수유 추출물을 1,000배 희석하여 측정 한 결과, 아세톤 추출물, 에탄올 추출물, 메탄올 추출물에 서 각각 1.14±0.03 μM TE, 3.44±0.34 μM TE, 4.31±0.3 μM TE으로 유의적인 차이를 보였다. 특히 메탄올 추출 물은 아세톤 추출물에 비해 ORAC value가 약 4배정도 높 은 것으로 나타났다. 산수유를 이용한 ORAC value는 온 도에 따른 산수유 물 추출물 선행연구36)가 있었으며, 저 농도(25 μg/ml)에서는 온도에 따른 차이가 없었으나 고 농도(50 μg/ml)에서는 50oC에서 8.5±0.2 μM TE/g으로 25oC (5.7±0.3 μM TE/g), 90oC (6.3±0.2 μM TE/g)에 비해
유의적으로 높았다. 이처럼 산수유의 ORAC value는 추출 용매와 추출 시간에 따라 차이가 있는 것으로 사료된다.
5. 산수유 추출물이 DNA 손상에 미치는 영향
Comet assay는 alkaline elution, alkaline precipitation, alka- line unwinding 등의 DNA 손상 측정법 보다 민감하고, 적 은 수의 세포에서 DNA 손상을 빠르고 민감하게 측정할 수 있다.37∼40) H2O2로 유도된 산화적 DNA 손상에 대한 산수유 추출물의 보호효과 결과는 Fig. 4에 제시하였다.
산수유 용매 추출물을 50 μg/ml의 농도로 백혈구에 처
Fig. 4. Antigenotoxic effect of Corni fructus extracted with various solvents in human leukocyte at 50 μg/ml. Values are means with standard deviation. Values not sharing the same letter are significantly different from one another (p＜0.05) by Duncan's multiple range test. NC: DMSO-treated normal control, PC: 200 μM H2O2-treated positive control, Ace:
acetone extraction, EtOH: ethanol extraction, MeOH: methanol extraction.
Table 2. Analysis of correlation between total phenolic contents and antioxidant parameters, and DNA damage
Correlation coefficient
TPC DPPH IC50 SOD IC50 ORAC value
DPPH IC50 −0.9001)* - - -
SOD IC50 −0.823* 0.944* - -
ORAC value 0.975* −0.945
*
−0.879*
-
DNA damage −0.427 0.504 0.452 −0.496
1)Correlation analysis used Pearson's correlation coefficient.
Values are significantly correlated by Pearson's correlation (*p
＜0.01). TPC: total phenolic contents, DPPH IC50: half maximal inhibitor concentration DPPH radical scavenging activity, SOD IC50: half maximal inhibitor concentration SOD-like activity, ORAC value: oxygen radical scavenging capacity against peroxyl radical, DNA damage: H2O2 induced DNA damage.
리한 후 H2O2 200 μM 농도로 처리하여 유도된 DNA 손 상도를 측정한 결과, 각 시료에서 200 μM의 H2O2를 처 리한 양성 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이러한 결과를 50 μg/ml 농도에서의 %tail DNA inhibition으로 나 타내면, 아세톤 추출물은 28.9%, 에탄올 추출물은 42.5%, 메탄올 추출물은 40.6%로 나타났고, 활성 비교를 위해 50 μg/ml 농도로 처리한 ascorbic acid의 DNA 손상 억제율은 58.2%로 나타났다. 에탄올 추출물과 메탄올 추출물의 DNA 손상 억제율은 ascorbic acid의 DNA 손상 억제율과 유의적인 차이가 없었으나, 아세톤 추출물의 DNA 손상 억제율은 ascorbic acid의 DNA 손상 억제율에 비해 유의 적으로 낮게 나타났다.
Jeon 등14)의 연구에서 산수유 에탄올 추출물이 sodium azide에 대한 항돌연변이 효과가 우수한 것으로 나타났 고, 산수유 에탄올 추출물을 간암 세포와 자궁암 세포에 처리하였을 때 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하였 다. Kim 등21)의 연구에서도 인체 폐암 세포주인 A549와 인체 유방암 세포주인 MCF-7에 산수유 추출물을 처리한 결과 암세포주의 증식이 억제되었다. 앞서 언급하였듯 이 과도하게 생성된 ROS는 세포내 DNA 손상을 일으키 고, 이러한 DNA 손상은 DNA 합성과 RNA 전사를 방해 하여 세포 돌연변이를 유발하여 암이 발생하게 된다. 선 행연구의 결과에 따르면 산수유 추출물은 항돌연변이 효과가 우수하며, 암세포주의 증식을 억제시켰고, 본 연 구에서는 다양한 용매에 의해 추출된 산수유 추출물이 암의 개시단계인 DNA 손상을 효과적으로 억제시켜 항
유전독성 효과가 있으며 나아가 항암효과를 가지고 있 을 것으로 기대된다.
산수유의 아세톤 추출물의 경우, 다른 용매 추출물에 비해 항산화 활성은 유의적으로 낮았으나, 항유전독성 효과는 메탄올과 에탄올 추출물의 항유전독성 효과와 유의적인 차이를 보이지 않았다. 현재까지 산수유에 대 한 성분 분석 연구로는 iridoid 배당체, tellimagrandin 1,2, 1,2,3-tri-O-galloyl-β-D-glucose, 1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glu- cose, gemin D, 1,2,3,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose 등이 보
고10,11)되었으나 DNA 손상 억제 관련 가능성이 있는 성
분에 대해서는 보고된 바 없다. 따라서 산수유 아세톤 추출물 내 어떤 성분이 DNA 손상억제 활성에 기여하였 는지는 현재로서는 알 수가 없으므로 이에 관한 후속연 구가 필요할 것으로 사료된다.
6. 산수유 추출물의 총 페놀 함량과 항산화활성 및 항 유전독성 효과와의 상관관계 분석 결과
각 실험 지표에 대한 Pearson's 상관관계를 Table 2에 제 시하였다. 총 페놀 함량 측정법은 간단하고 민감하며 정 확한 방법으로 오랜 기간 동안 이용되는 방법으로, 시료 에 함유되어 있는 페놀 화합물의 양을 측정하여 항산화 능을 예측할 수 있다.41) 천연에 존재하는 페놀 화합물들 은 항산화능을 가질 뿐만 아니라 암 예방 물질로도 알려 져 있다.42,43) 많은 선행연구들에서 총 페놀 함량과 항산 화 활성의 양의 상관관계가 있음을 보고하였다.44~47) 본 연구의 상관관계 분석에서도 총 페놀 함량은 DPPH IC50, SOD IC50값과 음의 상관관계를 나타냈으며, ORAC value와는 양의 상관관계를 나타내었다. 그러나 총 페놀
함량과 항유전독성 효과는 상관관계가 나타나지 않았 다. 이는 산수유에 함유된 총 페놀 성분이외의 다른 유효 성분들이 DNA 손상 억제에 더 크게 기여한 것으로 사료 된다.
결 론
산수유 5 g에 100 ml의 용매(Acetone, Ethanol, Methanol) 를 각각 가하여 상온에서 3일 동안 추출한 다음 농축하 여 각각 용매별 추출물을 얻었다. 각 용매별 추출물을 이용하여 산수유의 항산화 활성 조사 결과, 총 페놀함량 은 메탄올에서 추출한 추출물이 4.51±0.01 g GAE/100 g 로 가장 높았고, 그 다음으로 에탄올 추출물, 아세톤 추 출물 순으로 페놀 함량이 높았다. DPPH 라디칼 소거능 측정에서는 각 시료의 농도가 증가할수록 라디칼 소거 능이 유의하게 증가하였다. 라디칼의 50%를 저해하는 농도인 IC50은 에탄올 추출물과 메탄올 추출물이 아세 톤 추출물에 비해 유의적으로 낮았다. SOD 유사활성은 에탄올 추출물과 메탄올 추출물의 농도가 증가할수록 SOD 유사활성이 유의하게 증가하였다. ORAC assay를 이 용한 peroxyl 라디칼 소거능은 메탄올 추출물이 가장 높 았으며, 메탄올 추출물의 ORAC assay 측정값이 아세톤 추출물에 비해 약 4배 높았다. 한편 산수유 추출물의 산 화적 스트레스에 의한 DNA 손상 억제 효과를 보기위해 50 μg/ml의 농도로 백혈구에 처리한 후 200 μM H2O2로 DNA 손상을 유도한 결과, 백혈구의 DNA 손상 억제율 이 아세톤 추출물은 28.9%, 에탄올 추출물은 42.5%, 메 탄올 추출물은 40.6%로 나타났다. 총 페놀 함량, 항산화 및 항유전독성 활성 지표 간의 상관관계를 분석한 결과, 총 페놀 함량과 항산화활성 지표 간에는 유의적인 상관 관계가 있었으나 항유전독성 활성은 총 페놀이나 항산 화 활성과는 유의적인 상관관계가 없는 것으로 나타났 다. 이상의 결과에서 산수유 용매 추출물은 항산화 활성 과 항유전독성 효과가 있으며, 그 활성은 추출용매에 따 라 차이가 있는 것으로 나타났다. 산수유 용매 추출물의 항유전독성 효과를 나타내는 활성성분에 대해서는 추가 적인 연구를 통해 밝혀질 수 있을 것으로 기대된다.
감사의 글
본 연구는 2013년도 경남대학교 학술논문게재연구비 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.
참 고 문 헌
1) Pryor WA, Stone K. Oxidants in cigarette smoke: radicals, hydrogen peroxide, peroxynitrate, and peroxynitrite. Ann NY Acad Sci 686, 12-18, 1993.
2) Chance B, Sies H, Boceris A. Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol Rev 59, 527-605, 1979.
3) Gutteridge JMC, Halliwell B. Antioxidants in nutrition, health, and disease. Oxford, Oxford University Press, pp 1-62, 1994.
4) Dhawan A, Mathur N, Seth PK. The effect of smoking and eating habits on DNA damage in Indian population as measured in the Comet assay. Mutat Res 474, 121-128, 2001.
5) Kim GB, An JG, Kim JW. Use of comet assay as a bioassay in marine organisms exposed to genotoxicants. J Entomol Sci 14, 1071-1079, 2005.
6) Masaki H, Sakaki S, Atsumi T, Sakurai H. Active oxygen scavenging activity of plants extracts. Biol Pharm Bull 18, 162-166, 1995.
7) Namiki M. Antioxidants/antimutagens in food. Crit Rev Food Sci Nutr 29, 273-300, 1990.
8) Yoon GB, Jang JK. Wild grass for body. Seoul, Seok O publishing company, pp 459, 1989.
9) Kim CS, Park JH, Do SH. The study for the use of the wild plant resources in Korea. Report, pp 1410-1416, 1979.
10) Kim YH. Isolation of constituents from the fruits of Cornus officinalis. Siebold 14, 287-292, 1999.
11) Guilian T, Zhang T, Yang F, Ito Y. Separation of gallic acid form Cornus officinalis Sieb. et Zucc by high-speed counter- current chromatography. J Chromatogr A 886, 309-312, 2000.
12) Seo KI, Lee SW, Yang KH. Antimicrobial and antioxidative activities of Corni Fructus extracts. Korean J Postharvest Sci Technol 6, 99-103, 1999.
13) Lee SO, Han SM, Kim HM, Jeung SK, Choi JY, Kang IJ.
Chemical components and antimicrobial effects of Corni fructus. J Korean Soc Food Sci Nutr 35, 891-896, 2006.
14) Jeon YH, Kim MH, Kim MR. Antioxidative, antimutagenic, and cytotoxic activities of ethanol extracts from Cornus officinalis. J Korean Soc Food Sci Nutr 37, 1-7, 2008.
15) Chun HJ, Choi WH, Lee JH, Yang HO, Baek SH. Screening of cytotoxicity and antimicrobial effects of hexane extracts from Cornis fructus. Kor J Ori Med Physiol Path 17, 476-480, 2003.
16) Lee JK, Hong GY, Park YJ, Park ST. Effect of Cornis fructus extract on the cell adhesion ability and oxidative stress in cultured NIH3T3 fibroblasts injured by hydrogen peroxide. J Kor Soc People Plants Environ 11, 49-57, 2008.
17) Kim YD, Kim HK, Kim KJ. Antimicrobial activity of solvent fraction from Cornus officianalis. J Korean Soc Food Sci Nutr 32, 829-832, 2003.
18) Kim OK. Antidiabetic and antioxidative effects of Corni
fructus in streptozotocin-induced diabetic rats. J Korean Oil Chem Soc 22, 157-167, 2005.
19) Joo HK. Study on development of tea by utilizing Lycium chinense and Cornus officinalis. Korean J Dietary Culture 3, 377-383, 1988.
20) Lee YC, Kim YE, Lee BY, Kim CJ. Chemical compositions of Corni frucus and separating properties of its flesh by drying.
Korean J Food Sci Technol 24, 447-450, 1992.
21) Kim BH, Park KW, Kim JY, Jeong HY, Yang GH, Cho YS, Yee ST, Seo KI. Purification and characterization of anticarcinogenic compound from Corni fructus. Korean J Food Sci Technol 36, 1001-1007, 2004.
22) Jang M, Kim YJ, Min JW, Yang DC. Optimization of extraction method for the quantitative analysis of gallic acid from Cornus officinalis. Korean J Food Sci Technol 41, 498-502, 2009.
23) Chung SR, Jeune KH, Park SY, Jang SJ. Toxicity and lectins constituents from the seed of Cornus officinalis. Korean J Pharmacogn 24, 177-182, 1993.
24) Kwon SH, Yang HS, Kim JY, Park KW, Shon MY, Kang KS, Shim KH, Seo KI. Biological activities of ethanol extract from Corni furctus. J Korean Soc Food Sci Nutr 38, 287-291, 2009.
25) Kim YD, Kim HK, Kim KJ. Analysis of nutritional com- ponents of Cornus officianalis. J Korean Soc Food Sci Nutr 32, 785-789, 2003.
26) Folin O, Denis W. On phosphotungastic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J Biol Chem 12, 239-249, 1912.
27) Kurihara H, Fukama H, Asami S, Totoda Y, Nakai M, Shibata H, Yao XS. Effects of oolong tea on plasma antioxidative capacity in mice loaded with restraint stress assessed using the oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. Biol Pharm Bull 27, 1093-1098, 2004.
28) Ou B, Hampsch-Woodill M, Prior RL. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe. J Agric Food Chem 49, 4619-4626, 2001.
29) Kim MJ, Park E. Antioxidative and antigenotoxic effect of Omija (Schizandra chinensis B.) extracted with various solvents.
J Korean Soc Food Sci Nutr 39, 487-493, 2010.
30) Celep E, Aydin A, Yesilada E. A comparative study on the in vitro antioxidant potentials of three edible fruits: Cornelian cherry, Japanese persimmon and cherry laurel. Food Chem Toxicol 50, 3329-3335. 2012.
31) Bondent V, Brand-Williams W, Bereset C. Kinetics and mechanism of antioxidant activity using the DPPH free radical methods. Lebensm Wiss Technol 30, 609-615, 1997.
32) Kim EY, Bail IH, Kim JH, Kim SR, Rhyu MR. Screening of the antioxidant activity of some medicinal plants. Korean
J Food Sci Technol 36, 333-338, 2004.
33) Lee SE, Seong NS, Bang JK, Park CG, Sung JS, Song J.
Antioxidative activities of Korean medicinal plants. Korean J Med Crop Sci 11, 127-134, 2003.
34) Kang YH, Park YK, Lee G. The nitrite scavenging and electron donating ability of phenolic compounds. Korean J Food Sci Technol 28, 232-239, 1996.
35) Huang D, Ou B, Prior RL. Reviews, the chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agric Food Chem 53, 1841-1856.
2005.
36) Lee M, Kim J. Park E. Antioxidant and antigenotoxic effects of Sansuyu fruit (Corni fructus) extracted with water at different temperatures. J Korean Soc Food Sci Nutr 40, 149-155, 2011.
37) Bolognesi CR, Rabboni R, Roggieri P. Genotoxicity biomar- kers in Mytilus galloprovincialis as indicators of marine pollu- tants. Comp Biochem Physiol 133C, 319-323, 1996.
38) Black MC, Ferrell JR, Horning RC, Martin LK. DNA strand breakage in freshwater mussels (Anodonta grandis) exposed to lead in the laboratory and field. Environ Toxicol Chem 15, 802-808, 1996
39) Shugart L. An alkaline unwinding assay for the detection of DNA damage in aquatic organisms. Mar Environ Res 214, 321-325, 1998.
40) Singh PN, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 175, 184-191, 1988.
41) Ronald LP, Xianli W, Karen S. Standardized method for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J Agric Food Chem 53, 4290-4302, 2005.
42) Lee KW, Lee HJ. The roles of polyphenols in cancer chemo- prevention. Biofactors 26, 105-121, 2006.
43) Guo J, Wang MH. Antioxidant and antidiabetic activities of Ulmus davidaina extracts. Food Sci Biotechnol 16, 55-61, 2007.
44) Kratchanova M, Denev P, Ciz M, Lojek A, Mihailov A.
Evaluation of antioxidant activity of medicinal plants contai- ning polyphenol compounds. Comparison of two extraction systems. Acta Biochim Pol 57, 229-234, 2010.
45) Ku KM, Kim HS, Kim BS, Kang YH. Antioxidant activites and antixoidant constituents of pepper leaves from various cultivars and correlation between antioxidant activities and antioxidant constituents. J Appl Biol Chem 52, 70-76, 2009.
46) Cheung LM, Cheung PCK, Ooi VEC. Antioxidant activity and total phenolics of edible mushroom extracts. Food Chem 81, 249-255, 2003.
47) Du G, Li M, Ma F, Liang D. Antioxidant capacity and the relationship with polyphenol and vitamin C in Actinidia fruits.
Food Chem 113, 557-562, 2009.
