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이학 석사학위 논문
조직공학을 이용한 기관연골조직 제작과
생체이식 후 조직학적 변화 및 기능적 평가:
생체동물실험
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
이 범 희
조직공학을 이용한 기관연골조직 제작과
생체이식 후 조직학적 변화 및 기능적 평가:
생체동물실험
지도교수 김 철 호
이 논문을 이학 석사학위 논문으로 제출함.
2013년 2월
아 주 대 학 교 대 학 원
의생명과학과/분자의학전공
이 범 희
이범희의 이학 석사학위 논문을 인준함.
심사위원장 김 철 호 인
심사위원 김 현 준 인
심사위원 박 헌 이 인
아 주 대 학 교 대 학 원
2012년 12월 14일
i - 국문요약 -
조직공학을 이용한 기관연골조직제작과 생체이식 후 조직학적
변화 및 기능적 평가: 생체동물실험
배경: 일반적으로 알려진 기도재건의 방법은 단단 문합, 자가연골이식, 국소피판 혹은 유리피판 등으로 다양하다. 협착부위 제거 후 단단 문합이 가능하다면 가장 이상적인 치료방법이겠으나, 모든 환자에서 단단 문합술이 적용 가능한 것은 아 니다. 단단 문합이 불가능한 기도협착을 성공적으로 치료하기 위해서는 협착 부 위를 충분히 제거하고 그로 인해 발생 되는 기관의 결손 부위를 원할 하게 재건 해야 할 것이다. 결손 부위를 재건 하기 위해서는 일반적으로 연골이나 피판술 등 자가조직이 사용되나, 이에는 한계가 있어 새로운 기관 재건물 및 주입물을 이용하고자 하는 시도가 있어 왔다. 하지만 이러한 경우 재건 및 주입 후에 지속 시간이 짧아서 추가적인 처치과정이 필요하고, 이식물의 소실이나 면역반응에 의 한 염증으로 합병증 등이 발생할 수 있다. 기관이식물의 경우, 연골의 재생과 아 울러 재건 부위의 점막 재생이 신속하고 원할 하게 이루어지도록 하는 것이 가 장 중요하다. 따라서 새로운 기관 재건물이나 주입물에 관한 연구가 지속되고 있 다. 목적: 본 연구에서는 돼지연골의 세포 외 기질을 사용하여 제작한 다공성 지지체 와 배양된 동종 연골 세포를 토끼 기관에 이식하여 기관 재건의 가능성을 확인 하고자 하였다. 재료 및 방법: 돼지 연골을 탈 세포와 분쇄과정을 통하여 분말 형태로 제작 후 압축, 가교, 염 추출법을 통하여 3차원의 PCSs (Porcine Cartilage derived Substance Scaffold)를 직경 12mm, 높이 5mm로 제작하였다. 제작한 지지체에 동종 새끼토끼의 무릎에서 분리한 연골세포 (1x106ii
적합한 강도와 조직의 특성을 부여하고자 7주간 배양하였다. 배양된 지지체는 성인 토끼의 4 mm x 6 mm (직경 x 높이) 기관 결손 부위에 이식되었으며, 2주, 1개월, 2개월 후 육안적, 조직학적, 영상학적, 기능학적 관찰을 시행하였다.
결과: 제작한 PCS지지체의 물리학적 특성을 관찰한 결과, 공극의 크기는 250~350um로 확인 되었고, 공극률은 82%로 확인되었다. Live/Dead viability assay를 시행한 결과 지지체 내부의 세포는 90%이상 생존하고 있었다. 지지체를 육안적으로 확인한 결과 1주에는 본래의 형태가 유지되었고, 2주와 4주에는 점도 물질의 생성과 미끄러운 특성을 확인할 수 있었다. 이식 후 2주 내시경 관찰 결과 결손 된 부분에 이식된 지지체의 이탈이나 변형은 관찰되지 않았다. 이식 후 1개월에는 지지체의 일부가 기관 내부 쪽으로 육아조직을 형성한 것을 확인할 수 있었다. 이식 후 2개월에는, 1개월에 발견되었던 육아조직은 발견되지 않았고, 기관 내부의 점막이 재생되어 결손부위 및 지지체의 경계는 명확히 관찰되지 않았다. 이식 후 2주 H&E 염색결과에서 보면, 이식 초기는 이식된 연골세포 의하여 세포 외 기질이 생성되고, 중기에는 세포 외 기질 주변으로 대식 세포들이 부착되고 염증반응에 의해 육아조직이 형성되나, 말기에는 생성된 세포 외 기질이 성숙 되면서 형성되었던 육아조직이 이탈되는 현상에 의한 것이라 생각된다. Safranin-O 염색을 시행한 결과 이식 후 시간이 경과함에 따라 세포 외 기질을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 섬모 운동성 측정 결과 정상섬모와 이식한 섬모의 움직임은 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었고, 시간이 지남에 따라 정상섬모와 유사하게 회복됨을 확인할 수 있었다. 결론: In vivo 실험을 통한 토끼에서 얻은 동종 연골세포의 배양 방법을 확립하고 기관절제 동물실험모델의 구축과 개선 및 기관 내에 관한 기술과 임상적 연구 및 적용에 필요한 기초자료가 될 것으로 판단된다. 핵심어: 기관, 조직공학, 기관재생, 연골세포, 상피세포 섬모운동, 세포 외 기질, 돼지연골세포 지지체
iii
차 례
국문요약 ··· i 차례 ··· iii 그림 차례 ··· v Ⅰ. 서론 ··· 1 Ⅱ. 재료 및 방법 ··· 4 1. 연골분리 및 연골세포 배양 ··· 4 2. 지지체 제작과정 ··· 6 3. 지지체에 배양한 연골세포의 종류 ··· 84. Live/ Dead Viability ··· 9
5. 연구모식도 ··· 11 6. 기술 및 이식 도식화 ··· 13 7. 토끼 기관결손 후 지지체 이식 ··· 15 8. 내시경 촬영 ··· 17 9. 표본 슬라이드 제작 ··· 19 10. 조직학적 검사 ··· 20 11. 상피세포 섬모운동측정 ··· 21 III. 결과 ··· 22 1. PCS 지지체 완성 ··· 22 2. 지지체에 연골세포 접종 ··· 24 3. 접종된 연골세포의 생존 ··· 26 4. 배양된 지지체의 육안적 관찰 ··· 28 5. 내시경 결과 ··· 30
iv
6. 이식 부위의 육안적 형태관찰 ··· 31
7. Hematoxylin and Eosin stain ··· 34
8. Safranin-O stain ··· 36 9. 섬모운동성측정 ··· 38 Ⅳ. 고찰 ··· 40 Ⅴ. 결론 ··· 45 참고문헌 ··· 46 ABSTRACT ··· 49
v
그림 차례
Fig. 1. Chondrocyte isolation and culture ··· 5
Fig. 2. PCS (Porcine Cartilage derived Substance) scaffold manufacuturing ··· 7
Fig. 3. Cell viability measurement process ··· 10
Fig. 4. Experimental schedule ··· 12
Fig. 5. Schematic of the technique described in this study··· 14
Fig. 6. Scaffold transplantation ··· 16
Fig. 7. Endoscopic evaluation ··· 18
Fig. 8. Characteristics of porous scaffolds ··· 23
Fig. 9. Chondrocyte-scaffold implants ··· 25
Fig. 10. Live & Dead assay ··· 27
Fig. 11. Gross evaluation of neocartilage cultured in the chondrogenic media using rabbit chondrocytes ··· 29
Fig. 12. Endoscopic findings of rabbit trachea ··· 31
Fig. 13. Gross specimen of the implanted trachea ··· 33
vi
Eosin staining ··· 35
Fig. 15. Histological evaluation of neocartilage with safranin-O staining ··· 37
１
I. 서론
1. 조직공학
조직공학 (tissue engineering)이란 살아있는 세포를 이용 인체나 동물 조직의 구 조나 기능을 회복시키는 학문을 말한다 (Langer and Vacanti, 1993). 1930년대 Bisceglie에 의해 체외에서 작업한 후 체내에 다시 이식하는 생체조직 엔지니어링 기법의 활용을 시작으로 조직공학의 역사는 시작된다. 구체적인 적용에는 직접 세포만을 주입하거나, 세포를 지지체와 혼합 후 이식하거나, 지지체 만을 주입하 여 주위의 세포들로 하여금 조직의 회복을 가능하게 하는 방법이 있다. 조직공학 의 주된 목적은 조직과 장기의 해부학적 및 기능적 재구성을 달성하기 위해 사 람이나 동물에서 세포를 분리 증폭시킨 후 세포와 지지체를 혼합하여 생체 조직 에 이식함으로써 손상된 조직 및 장기를 대체하는 것이다 (Zhang et al., 2010). 2. 임상적인 측면 선천성 혹은 후천적으로 발생된 기관의 결손부위를 재생하기 위하여 기존에는 신축성이 있는 기관 조직의 특이적인 특성을 이용하여 결손된 부위의 상층과 하 층 부위의 조직을 접합하는 방법이 적용되었다. 그러나 신장되는 길이의 한계와 협착이 발생될 경우 2차적인 시술이 시행해야 하는 단점을 지닌다. 기도협착의 치료 또는 기관을 침범한 종양을 절제한 후 생긴 결손부의 재건은 아직도 어려 운 문제 중 하나로, 많은 난제를 내포하고 있다 (Andrews and Pearson, 1971; Cohen et al., 1985). 기도 재건의 방법은 단단 문합, 자가연골이식, 국소피판 혹은 유리피 판 등으로 다양하나 많은 후두기관재건에 있어 술식의 종류를 결정하는 데에 어 려움을 겪고 있는 것은 사실이다. 기도협착을 성공적으로 치료하기 위해서는 협 착 부위를 제거한 후 남게 되는 기관의 결손 부위를 원할 하게 재건해야 하는데 이를 위해서는 연골의 재생과 아울러 재건 부위의 점막 재생이 신속하고 원할 하게 이루어지도록 하는 것이 중요하다 (Zias et al., 2008).
２ 3. 이비인후과영역에서 조직공학적용 조직공학은 이비인후과 영역에서 신흥기술이다. 수많은 구조적 결손들이 신경이 과학, 안면성형학, 후두학, 두경부종양 등의 다양한 분야에서 생겨 치유되며, 이 분야들이 향후 다양한 조직공학적 이식물이 사용될 부분이기도 하다. 하지만 그 때까지는 자가조직이 가장 좋은 이식물이며 자가 조직은 공급이나, 공여부 이환 율 등의 문제점이 있다. 조직공학적 조직은 생활동적 (bioactive)이고, 융합 (biointegrating)이 잘되며, 기능적 (biofunctional)으로도 좋은 조직을 제한 없이 공 급할 수 있고 최소의 비용과, 준비기간, 적은 이환율의 장점을 가지고 있다. 생물학적 측면에서 세포의 기원에 따라 조직공학적 적용에 중요한 영향을 준다. 세포의 기원에 따라 자가세포 (autologous cells), 동종세포 (allogenic cells), 이종세 포 (xenogenic cells)로 나뉘며 동종세포와 이종세포의 경우 면역거부 반응이 있을 수 있다 (Rice et al., 2005). 자가세포를 이용하는 것이 가장 좋은 방법이나 이 또 한 여러 문제점들이 있다. 첫째, 성숙된 조직으로부터 세포를 얻는다면 환자의 공 여부 이환율 (donor-site morbidity)이 높아지며 기관지와 같이 공여부의 크기나 접근 제한적일 경우 더욱 문제가 된다. 그러므로 접근성이 좋고 구조적으로 중요 하지 않은 공 여부를 사용하는 것이 좋다 (Kojima et al., 2003). 둘째, 분리된 세포 를 이식하기 위해서는 충분한 양의 수로 증폭 시켜야 하며 그 과정에서 세포 표 현형 (phenotype)이 변하지 말아야 한다 (Nehrer et al., 1999). 연골 세포는 정상 성 장배지에서 단층배양시 일정 기간이 지나면 표현형이 섬유모세포 (fibroblast)와 같이 변하는 성질이 있다 (Mayne et al., 1976). 이 경우 연골세포 단층배양 시 FGF-2 (fibroblast growth factor-2)를 첨가하여 이러한 현상을 줄이고 정상적인 연골 조직을 만들 수 있다 (Martin et al., 2001). 공학적 측면에서 가장 중요한 문제점은 적절한 지지체의 선택 (Walles et al., 2004) 과 기능적으로 재생된 조직의 생산이다. 가장 좋은 지지체는 일정 시간이 지나면 분해되거나 주위 조직과 흡수되어야 한 다. 천연 재료로는 젤라틴(gelatin), 교원질(collagen), 피브린 (fibrin), 엘라스틴 (elastin) 등의 단백질과 알긴산 (alginate), 하이알루론산 (hyaluronic acide)등의 다당 류 계열의 천연재료가 주로 이용되고 있다 (Cui et al., 2003; Cheng and Teoh, 2004;
３
Zisch et al., 2004; Segura et al., 2005). 지지체 선택에 있어서, 조직공학적 조직이 본 래의 기계적 기능을 갖는 것이 가장 중요하다. 실제로 실험실적으로 만들어지는 연골조직의 압축계수(compressive modulus)는 원래 연골에 비해 차이가 크며 이 차 이는 세포의 기원, 배양조건뿐만 아니라 초기 지지체의 경직성 또는 분해성에 의 존한다고 할 수 있다. 천연재료로 제작된 지지체의 대표적인 단점은 기계적 강도 가 약하다는 것이다. 천연재료를 사용한 지지체는 기계적 강도가 매우 낮아, 높 은 하중을 견뎌야 하는 조직에 기계적 강도를 제공하지 못한다. 이러한 단점들로 인하여 다양한 지지체의 개발이 어렵다는 단점이 있다. 4. 연구의 목적 본 연구에서는 천연재료인 돼지연골의 세포 외 기질을 사용하여 합성재료와 천연재료로 만든 지지체의 단점을 극복하고 기계적인 강도를 높이고 다공 크기를 조절한 지지체를 제작하였다. PCS 지지체가 기관 재건을 위한 연골 세포의 이식의 조직공학적 지지체 역할을 할 수 있는지 알아보고 이 지지체를 이용 토끼 무릎 연골에서 채취한 연골세포를 이식하여 토끼 기관의 재건을 확인하고자 하였다. 지지체에 이식된 연골세포가 얼마나 지지체에서 생존하고 있는지를 확인하기 위해 Live/Dead assay 실험을 하였다. 또한 토끼 기관의 결손 부위에 지지체를 이식하였을 때, 이식물이 주변 조직에 성공적으로 생착되었는지를 확인하기 위해 영상학적 (내시경 및 Micro-CT)평가를 실행하였다. 또한 이식된 연골세포가 성공적으로 생착되어 연골세포의 특이적인 모양인 연골소강 (lacuna) 형성하는지 여부, 생존하는 세포의 위치와 수 그리고 연골세포에서 주로 생성되는 세포 외 기질인 GAG (glycosaminoglycan)를 알아보기 위하여 조직학적 평가 (H&E, Safranin-O)를 시행하였다. 또한 정상적인 기관의 섬모상피세포와 이식한 지지체의 섬모상피세포가 얼마나 유사한지 확인하기 위하여 미세섬모 운동평가인 섬모운동의 빈도 (Ciliary beat frequency, CBF)를 측정하여 확인하였다.
４
II. 재료 및 방법
1. 연골분리 및 연골세포 배양
연골세포를 채취하기 위하여 250g의 2주령의 새끼 토끼를 Zoletil (virbac S.A, France) 과 rumpun (bayer korea. Ltd, Korea)을 10ml 1:1 비율로 혼합하여 (300l/kg) 근육내 주사하여 마취를 시행하였다. 무릎 연골을 10mm x 10mm 크기로 적출하고 이를 phosphate-buffered saline (PBS, Sigma, St.Louis, MO, USA)에 세척하였다. 적출된 무릎 연골은 멸균된 칼을 사용하여 0.5mm이하의 연골조각으로 자른 후 penicillin-streptomycin- amphotericin 용액과 식염수로 세척하였다. 준비된 연골 조 각을 0.1% 제 2형교원질분해효소 (collagenase II, Worthington Biochemical Corp, Freehold, NJ, USA)가 첨가된DMEM (GIBCO, Grand Island, NY, USA)배지에 넣고 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 16시간 동안 처리하였다. 반응 처리된 연골조직액 을 100m 여과망 (100m Nylon, Bd FalconTM, U.S.A)에 통과 시켜 불순물을 제거 하고 수거된 연골세포를 1700rpm으로 10분간 원심 분리하여 세척하였다. 연골세 포는 1.2x106의 수로 150mm 배양 접시에 접종 되었으며, 항생제 [100 U/ml
penicillin G (GibcoBRL) and 100ug/ml streptomycin (Gibco BRL)]용액, 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Sigma)가 포함된 세포배양배지(DMEM high glucose, Gibco-BRL)에 배양 되었다. 계대배양은 70~80% 로 증식되었을 때 이루어졌으며, 본 실험은 4번의 계대배양을 거친 연골세포를 사용하였다 (Fig. 1).
５
Fig. 1. Chondrocyte isolation and culture. (A) Disinfect the young rabbits (B) Knee
cartilage isolation (c) Knee cartilage harvested and fragments (D) (E) Type II collagen-degrading enzyme processing (F) Proliferation of cartilage cells.
６ 2. 지지체 제작 과정 1) 돼지 연골의 채취 및 탈 세포 돼지의 뒷다리 무릎관절에서 연골을 분리한 후 일정한 크기로 잘라 흐르는 물 에 수세하였다. 수세한 연골을 3차수로 여러 번 수세 후 1일정도 냉장 보관하였 다. 동결건조 한 후에 연골조각을 대략 1~2mm 정도의 크기로 분쇄하였다. 분쇄 한 연골은 초고속 원심분리기를 사용하여 수세하였으며, 수세한 연골은 액체질소 를 사용하여 동결미세 분쇄하였다. 동결분쇄 후의 연골은 크기 50m 정도의 분 말형태로 탈 세포 하였다 (Fig. 2). 2) 지지체 처리과정
탈 세포된 연골 분말은 66mg과 300um 크기의 salt 660mg을 EDC250ul를 혼합하 여 12mm x 5mm (높이 x 직경)로 제작된 주형 틀 (mold)에 채워진 후 압축기에 의 하여 원통형 모양의 지지체로 제작되었다. 제작된 PCS 지지체는 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride, Sigma) 1.197g에 99.9%ETOH (Ethyl Alcohol, DUKSAN) 100ml 넣어 16시간 처리 후 NHS (N-Hydroxysuccinimide, Sigma)를 1.1509g에 3차수 100ml을 4시간처리하여 가교 반응을 유도 하였고 NH2PO4 (Natriamphosphatdibasisch) 2.8g을 3차수 4L로 녹여 1시간 30분간 처리하여
중화되었으며, 3차수로 잔여 반응기를 제거하고 세척하였다. 제작된 PCS는 저온 EO gas (Ethylene oxide, Delta Medical,EOG-300, Korea) 처리를 통하여 멸균되었다. 지지체의 높이를 유지하기 위해 돼지 연골분말과 염화나트륨의 양은 항상 같게 넣고 만들었다 (Fig 2).
７
Fig. 2. PCS (Porcine Cartilage derived Substance) scaffold manufacuturing. (A) Yong
pig (B) Cartilage isolation (C) Decellulariztion (D) After the injection of liquid nitrogen freeze-fracturing (E) Cartilage powder production (F) Compressor using a circular scaffold fabrication (G) Scaffolds crosslinked (H) scaffold from the salt leaching (I) PCS scaffold the completion.
８ 3. 지지체에 연골세포 주입 단층 배양된 연골세포는 0.05% trypsin (Gibco)을 처리하여 수거하였다. 50ml 튜브 에 수거한 연골세포를 넣고 1700 rpm에서 10분간 원심분리하여 세척하였다. 멸균 된 PCS지지체는 FBS가 들어간 DMEM 배양액에 1시간 반응 시켜 친수화를 유도 했으며, 잔여 DMEM을 제거 후 15x106 의 연골세포를 350l 세포배양배지에 혼합 되어 상, 하 면에 접종하였다. 접종 2시간 뒤 지지체를 뒤집어서 37℃, 5% CO2 항온배양기에서 총 4시간동안 세포 접종을 유도하였다. PCS에 접종된 연골 세포 는 연골 분화배양액 [DMEM, 1.0 mg/ml insulin from bovine pancreas, 0.55 mg/ml human transferrin, and 0.5 mg/ml sodium selente (ITS, Sigma)와 50l/ml ascorbic acid, 100nM dexamethasone, 40 g/ml proline, 1.25mg/ml bovine serum albumin (BSA), 그리고 100 g/ml sodium pyruvate]에서 1, 2, 4, 7주 배양 되었다.
９
4. 지지체내 생존 세포 평가
살아있는 세포는 세포 내 esterase 활성이 높고 plasma membrane이 완전한 반면, 죽은 세포는 esterase 활성이 낮고 plasma membrane이 망가지는 성질을 바탕으로 esterase와 반응하는 Calcein AM과 세포핵에 결합하는 EthD-1 (Ethidium homodimer-1)의 두 가지 형광 probe 를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 동시에 확인 하였다. Calcein AM은 비 형광 상태이나 살아있는 세포에서 esterase에 의해 분해 될 경우, 녹색의 형광을 띠면서 세포 내에 남게 되고, EthD-1은 membrane이 손상 된 죽은 세포에 침투하여 핵산과 결합하면서 밝은 붉은색의 형광을 나타나게 된 다 (그림 3). 각각의 세포 이미지를 획득하고 무작위로 선별한 후 image J (NIH) 프로그램을 사용하여 정량화하였다 (Fig. 3).
１０
Fig. 3. Cell viability measurement process. (A) Staining of each image obtained (B)
Random screening (C) Converting images to RGB color (D) Each image merge (E) Inspect the stained cells (F) Statistical analysis.
１１ 5. 연구 모식도 연골세포를 주입한 지지체는 7주 동안 항온배양기에서 배양시키며 조직 성숙 (maturation)를 유도하였으며, 지지체의 변화 상태를 지속적으로 관찰하였다. 2.5kg 의 14주령 된 수컷 토끼의 기관에 7주간 배양한 지지체를 이식하였다. 그리고 각 각 2주 (N=4), 1 개월 (N=3) 그리고 2개월 (N=3) 후 내시경 촬영 및 부검을 진행 한 후 기관 조직을 적출하였다 (Fig. 4).
１２
Fig. 4. Experimental schedule. Chondrocyte isolation and culture. Tissue maturation
１３ 6. 기술 및 이식 도식화 토끼의 기관에 결손부위를 만든 후, 7주간 배양한 지지체를 이식하였다. 7주간 배양한 지지체를 기관의 결손부위에 이식할 수 있도록 결손부위의 크기에 맞게 잘라 주었다. 지지체 이식부위에서 이탈되는 것을 방지하고 결손부위가 정교하게 맞물리게 하기 위하여 기관 내부 면이 좁아지는 사다리꼴 형태로 잘라서 이식하 였다. 그 후 토끼의 기관 결손과 지지체를 고정시키고 공기의 유출을 방지하기 위해서 생체접착제 (fibrin glue)를 도포해 주었다 (Fig. 5).
１４
Fig. 5. Schematic of the technique described in this study. (A) Tracheal defects,
approximately 4mm wide by 6mm long, were made by scalpel (B) And fibrin glue coated scaffold inserted in the defect.
１５ 7. 토끼 기관 결손 후 지지체 이식 2.5 kg의 14주령 토끼는 Zoletil : rumpun (1:1)에 의하여 마취가 유도되었으며, 멸 균된 수술용 칼날에 의하여 피부와 근육층이 절개 되어 기관이 노출시켰다. 노출 된 기관은 4mm x 6mm (직경 x 높이)의 크기로 결손이 주어졌으며, 7주 동안 조직 성숙화 (tissue maturation)가 진행된 지지체를 결손 부위에 이식하였다. 이식된 지 지체의 고정과 공기의 유출을 방지하기 위하여 생체 접착제 (fibrin glue)를 이식된 지지체와 기관 결손 부위에 도포하였다. 그 후 생분해성 조직 접합용 실인 vicryl (Johnson&Johnson, U.S.A)을 사용하여 근육층과 피부층 각각을 꿰매주었다. 피부층 의 감염을 방지 하기 위하여 알러스프레이 (vetoquinol lab, France)를 수술부위에 도포해 주었으며, 추가적인 감염을 방지하기 위하여 메타캄 (Boehringer Ingelheim, Mexico) 현탁액 (4ml/마리) 을 복용시켰다 (Fig 6).
１６
Fig. 6. Scaffold transplantation. (A) 2.5 kg of 14-week-old rabbits after anesthesia, the
surgical site disinfection (B) Epilation surgical site (C) Layer of skin and musculature and the incision in order to expose the tracheal (D) Tracheal defect formation (E) Scaffold implanted into the defect (F) Applied to fibrin glue graft site.
１７
8. 내시경 촬영
지지체 이식 후 각각의 분석 시기 (2주, 1개월, 2개월)에 해당 토끼를 이전과 동 일 한 방법으로 마취하여 기관내부를 내시경으로 관찰하였다. 토끼의 구강을 개 방 후 상, 하악 골을 고정시키고, 내시경의 삽입이 원활하도록 토끼의 혀를 노출 시켜 고정시켰다. 그 후 조명장치 (RICHARD WOLF GMBH 71321KNITTLINGEN, Germany)와 내시경 (Stryker Endoscopy, U.S.A)을 사용하여 생존 상태로 토끼의 기 관과 지지체의 상태를 관찰하였다 (Fig 7).
１８
Fig. 7. Endoscopic evaluation. (A) Rabbit oral self-correction two open (B) Fixed jaw of the maxilla and mandible (C) (D) Tongue fixed to the floor to make space by the insertion of an endoscope (E) Endoscope inserted (F) Observe the tracheal internal and photos secure.
１９ 9. 표본 슬라이드 제작 해당 분석 시기인 2주, 1개월, 2개월에 지지체를 이식한 기관을 적출하여 회수한 후 조직의 구성 성분 및 구조의 변성을 방지하기 위하여 10% NBF (Neutral Buffered Formaldehyde) 고정액으로 24~48시간 동안 고정한다. 이후 고정액을 제거 하기 위해서 흐르는 물에 세척하고 파라핀 자동 침투기 (Autotechnicon; Shandon Pathcentre)를 사용하여 탈수, 투명 파라핀 침투 과정을 12단계로 14~15시간 동안 진행하였다. 파라핀 침투를 끝낸 조직은 포매 (embedding)과정을 통해 파라핀블럭 (paraffin block)을 제작하였다. 제작된 블록은 회전형박절기 (rotary microtome)을 사 용하여 4m 두께로 박절한 후 항온수조 (constant temperature water bath)에 부유시 켜 파라핀 절편의 주름을 제거하여 60℃에서 건조시켰다. 건조된 표본 슬라이드 는 조직학적 검사 및 면역조직화학적 검사에 사용하였다.
２０
10. 조직학적 검사 ( H&E & Safranin-O )
제작한 slide가 건조된 후 파라핀을 제거하기 위해서 xylene에 10분씩 3회 침수 시켰다. 파라핀이 제거된 것을 확인한 후 100% 알코올 5분씩 2회, 95% 3분씩 2회, 80% 3분씩 3회, 70% 3분씩 3회에 걸쳐 낮은 농도의 알코올로 이동시키면서 함수 과정을 진행하였다. 함수과정이 끝난 후 흐르는 수돗물로 수세한 후 Mayer hematoxylin 용액에 10분간 침수시켜 조직의 핵을 염색시키고 다시 흐르는 수돗 물로 3분동안 침수시켜 잔여 염색물 수세하였다. 그 후 0.02% fast green 용액에서 3분간 염색시킨 후 1%glacial acetic acid에 7초간 침수 시켜 탈색시켰다. 그리고 safranin-O 용액을 6분간 처리하여 당단백을 염색한 후 수돗물에 2회 침수 시켜 비 특이 염색물을 제거 한 후 실온에서 20분간 건조시켰다. 건조된 slide 조직을 xylene에 10분씩 3번 담근 후 봉입제를 사용하여 봉입하였으며, 염색의 판독은 조직의 보라색의 핵과 붉은 색의 세포외 기질의 관찰로 이루어졌다. H&E (Hematoxylin and Eosin) 염색은 동일한 함수 과정을 거친 후 흐르는 수돗물로 수 세한 후 harris hematoxyline 용액에 10분간 침수시켜 핵을 염색시키고 다시 흐르 는 수돗물에 1분동안 수세하였다. 1% alcoholic hcl에 3회 침수시켜 탈색 한 후 1 분간 다시 수세하였다. 그리고 세포질 염색을 위해서 eosine에 1분간 반응시키고 저농도에서 고농도의 알코올 처리 과정을 거쳐 탈수시켰다. 봉입 과정을 거친 slide의 판독은 보라색의 핵과 분홍색의 세포질의 관찰로 이루어졌다 (Fig. 14, Fig. 15).
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11. 기관상피세포의 미세섬모운동 평가 (Mucociliary function test)
이식된 기관 부위의 점막을 채취하여 재생된 점막의 섬모운동을 확인하였다. 점 막 세포가 들어있는 판 (plate)을 도립 현미경 (Axiovert 40 CFL; Carl Zeiss AG, Goettingen, Germany)으로 관찰하였다. 배양용기를 도립 현미경 위에 놓고 400 배 율 하에서 섬모운동횟수를 다음과 같이 측정하였다. Complementary Metal-Oxide Semiconductor(CMOS)카메라 (Moticam 2000, Motic China Group Co., Ltd)를 통하여 모니터 화면에 나타나는 영상 중 섬모가 뚜렷이 보이고 세포 자체는 움직이지 않으며 주위 세포에 의한 간섭도 적은 섬모세포를 선택하여 그 세포를 포함한 영상을 약 15초 정도 영상 캡쳐 소프트웨어 (Motic Image Plus;Motic China Group Co., Ltd)로 녹화하고 개인용 컴퓨터에 저장한 후 (Intel Xeon 3.0 GHz)녹화된 영상 을 다시 컴퓨터 모니터에 재생한 후 컴퓨터 메모리에 10초의 영상을 불러들여 Fast-Fourier Transform (FFT) 분석을 이용하여 섬모운동횟수를 측정하였다 (Fig 16).
２２ III. 결과 1. PCS 지지체 완성 각각의 지지체는 염추출법으로 모두 직경 12mm, 높이 5mm로 몰드를 사용하여 제작되었다. 염추출법을 이용한 지지체의 제작은 혼합하는 염결정의 크기에 따라 공극의 크기와 공극률을 조절된다. 실제로 제작한 PCS 지지체의 물리학적 특성 을 확인하기 위하여 전자현미경 촬영을 시행하였다. 관찰 결과, 공극의 크기는 세포가 안착될 수 있는 250~350m로 확인되었으며, 공극률은 82%로 확인되었다. 내부와 외부 구조를 관찰한 결과, 내부의 공극은 외부의 공극과 연결된 것이 확 인 되었으며, 이러한 특성은 내부에서 세포가 생성한 노폐물을 외부로 배출하고 외부에서 공급되는 배양액을 내부로 원활히 공급할 수 있는 장점이 된다 (Fig. 8).
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２４ 2. 지지체에 연골 세포접종 지지체에 연골세포를 접종하기 위하여 지지체는 EO gas 멸균되었으며, 세포를 접종하기 전 DMEM에 침수시켜 친수화를 유도하였다. 세포 접종은 15 x 106/scaffold 으로 이루어졌으며, 접종 후 항온 배양기에서 지지체에 세포의 부착 을 유도하였다. 접종 4시간이 경과 후 지지체의 색은 분홍색에서 노란색으로 변 하였다. 이러한 색의 변화는 접종된 세포의 산성 대사 산물이 배양액에 포함된 phenol red 성분과 반응하여 유발된 것이며, 결국 지지체에 세포가 접종되는 4시 간 동안 세포의 대사는 원활이 진행된 것을 의미한다 (Fig. 9).
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Fig. 9. Chondrocyte-scaffold implants. (A) Chondrocyte injection (B) Chondrocytes
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3. 접종된 연골 세포의 세포 생존 (Live & Dead assay)
PCS 지지체에 접종된 연골세포의 생존여부를 검증하기 위하여 Live/Dead viability assay 를 시행하였다. 육안적 관찰 결과 생존 세포가 PCS 지지체의 공극 에 부착되어 녹색으로 관찰되었으며, 정량적 처리 결과 지지체 내부의 세포는 90% 이상 생존하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 결국 PCS 지지체는 연골 세포가 접 종되어 생존하기에 적합한 지지체임을 확인할 수 있었다 (Fig 10).
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Fig. 10. Live & Dead assay. (A) Confirmed that viable cells are located in the pores of the
scaffold (yellow circle) (B) Of dead cells observed (C) Merging of viable cells and dead cells ever observed.
２８ 4. 배양된 지지체의 육안 관찰 접종된 세포는 조직성숙화 과정을 거치면서 1주, 2주, 4주 그리고 7주에 걸쳐 관 찰 되었다. 1주 결과 지지체는 크기가 줄어드는 경향성 없이 본래의 형태가 유지 되는 것을 확인 할 수 있었으며, 2주와 4주 관찰 결과 지지체는 점도 물질의 생 성과 미끄러운 특성을 확인할 수 있었다. 7주에서는 공극의 일부가 많이 채워 진 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 성숙화 과정이 진행되면서 지지체에는 접종된 세포의 의하여 점성의 세포 외 기질이 형성되고, 시간이 경과 하면서 이 러한 세포 외 기질이 지지체의 공극에 축적되는 것을 간접적으로 나타내는 지표 가 된다 (Fig 11).
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Fig. 11. Gross evaluation of neocartilage cultured in the chondrogenic media using rabbit chondrocytes. (A) 1week incubation (B) 2week incubation (C) 4week incubation (D)
7week incubation.
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5. 내시경 결과
0도 경성 내시경 (0 degree rigid endoscope)을 이용하여 이식된 지지체가 토 끼의 기관 내에서 변화하는 양상을 관찰 하였다. 이식 후 2주 관찰 결과, 결손 된 부분에 이식된 지지체의 이탈이나 변형은 관찰되지 않았으며, 결손된 부분과 지지체가 이식된 부분의 뚜렷한 경계를 보이지 않았다. 이식 후 1개월에 관찰결 과, 이식된 지지체 및 육아조직이 기관의 내부 쪽으로 증식된 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 이식 후 2개월 관찰 결과, 1개월에서 관찰되었던 육아조직이 기 관 내부로 증식되는 형태는 더 이상 관찰할 수 없었으며, 기관 내부의 표면과 유 사한 형태로 이식된 지지체와 결손 부위의 경계는 관찰되지 않았다 (Fig 12).
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Fig. 12. Endoscopic findings of rabbit trachea. (A) Trachea observation of rabbits at 2
weeks after transplantation (B) Rabbit 1 month after transplantation of organs observed (C) Rabbit 2 months after transplantation of trachea observed.
３２ 6. 이식부위의 육안적 형태 관찰 기관 결손 부위에 PCS 지지체를 이식 2주, 1개월, 2개월 후에 토끼 기관을 적출 하여 기관의 외형을 관찰하였다. 이식된 지지체의 이탈이나 변형은 관찰되지 않 았으며, 주변 조직과의 공극 또한 관찰되지 않았다. 지지체와 기관 결손 부위가 연결된 형태를 보였다. 이식 2주 후 조직학적 검사상, 이식된 지지체는 기관결손 부위에서 부착되어 주위 조직과 융합되어 고정된 것을 확인할 수 있었다. 이식 후 1개월 관찰 시, 2주와 유사하게 주변조직과 융합되어 있었으며, 접촉 시 강도 가 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이식 후 2개월 관찰 결과 이식한 지지체는 결 손부위의 크기와 유사하게 되었으며, 주변 조직과 비교하였을 때 외형적인 특성 이 큰 차이를 보이지 않았다. 시간이 지남에 따라 지지체가 기관에 흡수되는 것 을 확인할 수 있었다 (Fig 13).
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Fig. 13. Gross specimen of the implanted trachea. Red arrows transplanted scaffold (A)
2week (B) 1month (C) 2month.
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7. Hematoxylin and Eosin stain
이식된 지지체가 생체 내에서 변화하는 생리학적 양상과 주변조직의 변화 양상 을 관찰하기 위하여 H&E 염색을 시행 하였다. 각각의 염색은 정상적인 기관을 대조군으로 하여 염색하였으며, 대조군과 염색상을 비교하였을 시 동일한 염색상 을 보였다. 이식 후 2주 째 지지체를 염색한 결과 기관의 외측으로 조직의 성장 이 관찰되었으며, 고배율로 확대 하여 관찰하였을 때 결손된 기관의 연골부위와 공극을 보이며 완전하게 주변 조직과 융합되지 않은 경향성을 보였다. 이식 후 1 개월 후, 기관 내측으로 육아조직의 성장이 관찰되었으며, 이러한 육아조직의 성 장은 기관 표면에서 역 ‘T’ 형태이며 작은 대식 세포와 이물이 다량 관찰된 것으 로, 기관 조직의 표면에서 유래된 것이 아니라 내부의 호흡에 의한 이물질이나 그로 인한 대식세포의 부착에 의하여 발생된 것으로 보였다. 이식 2개월 후에는 1개월 째 지지체에서 관찰된 기관 내측으로의 육아조직의 성장을 관찰할 수 없 었으며, 이식된 지지체가 주변 조직과 결합된 양상을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 이식 초기에 결손된 조직을 수복하기 위하여 이식된 지지체의 세포에 의 하여 세포 외 기질이 생성되며, 이식 중기에는 생성된 세포 외 기질 주변으로 호 흡 이물질이나 대식 세포들이 부착되며, 이식 말기에는 생성된 세포 외 기질이 성숙 되면서 표면에 부착되었던 이물질이 이탈되는 현상에 의한 것이라 생각된 다 (Fig 14).
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Fig. 14. Histological evaluation of tissue-engineered trachea with Hematoxylin and Eosin staining. (A) 2 weeks after transplantation (B) 1month after transplantation (C)
３６ 8. safranin-O 염색 연골 조직에서 분비하는 단백당 (Proteoglycan)을 확인 하기 위하여 safranin-O 염 색을 시행 하였다. 이식 2주와 1개월 후, 이식부위의 safranin-O 염색관찰 결과, 지지체와 지지체 사이에서 세포가 균일하게 분포한 것을 확인할 수 있었으나 세 포 외 기질의 분비는 관찰할 수 없었다. 반면 이식 2개월 후에는 고배율에서 붉 은 색으로 세포 외 기질이 국소적으로 염색된 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 식된 지지체 및 연골세포는 시간이 경과함에 따라 세포 외 기질이 생성하는 것 을 확인 할 수 있었다 (Fig 15).
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Fig. 15. Histological evaluation of neocartilage with safranin-O staining. (A) 2 weeks
after transplantation (B) 1month after transplantation (C) 2month after transplantation.
３８ 9. 섬모 운동성 측정 섬모 운동성 측정은 이식 후 2주, 1개월, 2개월 토끼의 기관 점막을 채취한 후, 1 개의 조직에서 각각 다른 부위의 10개의 개별적인 곳을 현미경을 사용하여 10초 동안 섬모 운동을 촬영하여 측정 분석하였다. 섬모 운동성은 정상 점막의 섬모 운동성과 비교 분석하였다. 이식 2주와 1달에서는 통계적으로 유의하게 운동성이 떨어져 있었으나 시간이 지날수록 정상섬모와 비슷한 주파수를 보였다. 정상기과 의 주파수는 평균 21.7, 2주기관 16.2, 1달기관 18.3, 2달기관 20.2의 주파수가 나왔 다 (Fig 16).
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Fig. 16. Measurement of trachea ciliary beat frequency. (A) (B) Evaluation of trachea ciliary beat frequency using inverted microscope, high-speed digital camera, and software.
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V. 고 찰
선천적인 원인 또는 종양, 외상 등에 의한 기관 및 기도 협착에 대한 치료는 발생원인, 환자의 나이, 상태 등에 따라 다르지만 일반적으로 손상 부위의 크기, 특히 길이에 따라 결정되며 아직도 어려운 임상질환 중의 하나로서 해결 하여야 할 많은 과제들을 내포하고 있다 (Worman et al., 1966; Cotton, 1978; Thawley and Ogura, 1981; Toohill, 1981; Schuller and Parrish, 1988; Grillo, 1990). 기관 벽의 일부만 손상이 되었을 경우 그 부위를 제거하고 크기가 작을 경우 그대로 두거나 각종 피판을 이용하여 재건해 준다. 기관 협착과 같이 기관의 외, 내 경 모두가 손상이 있는 경우에는 병변의 부위를 절제한 후 단단 문합술을 시행하는 것이 보편적이다. 기도협착을 성공적으로 치료하기 위해서는 협착 부위를 절제한 후 남게 되는 기도의 결손 부위를 원할 하게 재건해야 하는데 이를 위해 연골의 재건과 이재건 부위에 점막재생이 신속하고 활발하게 이루어 지도록 하는 것이 무엇보다 중요하다 (Donski and O'Brien, 1980; Leung, 1983; Takato et al., 1987; Mayer et al., 1992). 즉 안정되고 유연한 골격으로 구조적인 안정성을 확보하는 동시에 내 면 은 호 흡 성 상 피 로 피 복 됨 으 로 써 기 증 적 으 로 도 정 상 화 가 되 어 야 한 다 . 자 가 조 직 , 동 종 이 식 및 보 철 재 료 등 의 수 술 방 법 은 여 러 문 헌 에 의 해 설명되어있다 (Neville, 1982; Nakanishi et al., 1993; Cavadas, 1998). 기관의 교체는 임상응용으로 이어질 만큼 만족스러운 결과를 제공하지는 않았다. 기도의 골격과 점 막 을 동 시 에 재 건함 으 로 써 , 재 건 부 위의 가 피 형 성 과 분 비물 의 축 적 을 억제하고 정상적인 호흡을 유지하여 정상적인 기도생리를 회복할 수 있다면 이상적이라고 할 수 있다. 여러 가지 다양한 방법이 시도되고 있으나 수술방법이 복잡하고 여러 단계의 수술이 필요하며 자가조직 체취과정에서 발생하는 손상 등의 단점으로 인하여 표준적인 치료법이 정립되어 있지 않은 상태이다. 이처럼 환자의 자가조직을 이용함으로써 생기는 여러 부작용을 줄이기 위해서 그 동안 각종 인공재료를 이용한 인공기관의 제작이 시도되어 왔다. 그러나 이러한 인공 기관들은 점막 재생이 불량하며 염증에 취약하고 육아조직의 형성, 접합부위의
４１ 분리, 주위 조직의 손상 및 재협착 가능성이 높아 임상적으로 적용하는데 많은 문제점을 가지고 있다. 최근 들어 조직공학 및 재생의학 기반의 인공장기 개발 기술이 발전하면서 인공재료만을 사용하는 것이 아니라 생체 조직을 함께 사용함으로써 연골 및 기관의 제작에도 많은 성과가 있었다. 세포 치료 및 조직 공학적 장기 재생에는 세포와 함께 지지체를 필요로 하는 경우가 많다. 이 분야에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 지지체는 다공성 구조내 파종된 세포와 조직 주변으로부터 이동되는 세포의 성장에 중요한 역할을 수행한다. 거의 대부분의 인체내 세포는 부착되어 성장되는 부착세포로써 만일 부착할 곳이 없으면 세포는 성장되지 못하고 사멸된다. 따라서 지지체는 세포의 부착, 분화, 성장 및 세포 이동에 대한 적합한 환경을 제공해야 한다. 이상적인 고분자 지 지 체 는 세 포 들 이 지 지 체 간 극 을 통 해 이 동 하 여 서 이 식 된 주 위 의 정 상 세포들이 자연스럽게 접착하여 스며들게 해야 하기 때문에 적절한 공극을 가져야 하고 세포 접착력도 우수해야 한다. 이식 하였을 때 이식 부위에서 염증 반응이 일어나지 않아야 하기 때문에 생체 적합성이 뛰어나야 하고 이식 부위의 정상 부위와 경계 면에서 재생된 콜라겐섬유 (collagen fibril)들 간의 결합도 강화 시켜야 한다. 세포들이 증식하는 것을 촉진시키고 용이하게 하도록 생분해성이 좋 아야 하 고 기 관연골 결손 부위가 재생이 되었을 때 자연스럽게 윤곽 이 나타나도록 적절한 안정성과 기질이 과분비 되지 않는 응집력도 갖추어야 한다. 탄성력도 어느 정도 지녀야 한다. 이러한 조건이 만족 되었을 때 기관 결손시 조직 재생을 유도하는 이상적인 지지체라고 할 수 있다. 이러한 생체적합성, 분 해 성 , 다 공 성 , 수 분 함 유 , 전 달 , 세 포 유 착 등 의 성 질 을 최 대 한 고 려 하 여 만들려고 하였다. 본 연구에서는 제작한 각각의 지지체는 모두 직경 12mm, 높이 5mm로 주형틀을 사용하여 제작 되었다. 실제로 제작한 PCS 지지체의 물리학적 특성을 확인 하기 위하여 전자현미경 촬영을 시행하였다. 공극의 크기는 세포가 안착 될 수 있는 250~350um로 확인 되었으며, 공극률은82%로 확인 되었다. 내부와 외부 구조를 관찰한 결과, 내부의 공극은 외부의 공극과 연결된 것이 확 인 되 었 으 며 , 이 러한 특 성 은 내 부 에 서 세 포 가 생 성 한 노 폐물 을 외 부 로
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배출하고 외부에서 공급되는 배양액을 내부로 원활히 공급 할 수 있는 장점이 된다. 동종이계 연골세포는 낮은 항원성으로 인하여 연골 조직 결손부위가 재생되는데 사용 할 수 있다 (Lu et al., 2005; Weinand et al., 2006). 많은 나라의 연구자들에 의해서 연골세포의 안정적인 공급을 위하여 세포은행 설립 가능성을 모색하고 있다 (Tracheal reconstruction using Csonge et al., 2002). 세포 접종은 15 x 106/scaffold으로 이루어 졌으며, 접종 후 항온 배양기에서 지지체에 세포의 부착을 유도하였다. 접종 4시간이 경과 후 지지체의 색은 분홍색에서 노란색으로 변하였다. 색의 변화는 접종된 세포의 산성 대사 산물이 배양액에 포함된 phenol red 성분과 반응 하여 유발 된 것이며, 결국 지지체에 세포가 접종되는 4시간 동안 세포의 대사는 원활이 진행된 것을 의미한다. Live/Dead viability assay 를 시행 한결과 육안적 관찰 결과 생존 세포가 PSC 지지체의 공극에 부착되어 녹색으로 관찰 되었으며, 정량적 처리 결과 지지체 내부의 세포는 90%이상 생존하고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 접종된 세포는 조직성숙화 과정을 거치면서 1주, 2주, 4주 그리고 7주에 걸쳐 관찰 되었다. 1주 결과 지지체는 크 기 가 줄 어 드 는 경 향 성 없 이 본 래 의 형 태 가 유 지 되 는 것 을 확 인 할 수 있었으며, 2주와 4주 관찰 결과 지지체는 점도 물질의 생성과 미끄러운 특성을 확인 할 수 있었다. 7주에서는 공극의 일부가 많이 채워 진 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 성숙화 과정이 진행되면서 지지체에는 접종된 세포의 의하여 점성의 세포 외 기질이 형성되고, 시간이 경과 하면서 이러한 세포외 기질이 지지체의 공극에 축적되는 것을 간접적으로 나타내는 지표가 된다. 내시경 결과, 이식 후 2주 관찰 결과에서는 결손 된 부분에 이식된 지지체의 이탈이나 변형은 관찰 되지 않았으며, 결손 된 부분과 지지체가 이식된 부분의 뚜렷한 경계를 어렵게 찾을 수 있었다. 이식 후 1개월에 관찰 결과 이식된 지지체의 일부가 토끼 기관의 내부 쪽으로 성장한 것을 확인 할 수 있었다. 그러나 이식 후 2개월에 관찰 결과 1개월에에서 관찰되었던 이식된 지지체가 기관 내부로 성장하는 형태는 더 이상 관찰 할 수 없었으며, 기관 내부의 표면과 유사한 형태로 이식된 지지체와 결손 부위의 경계는 관찰 되지 않았다. 기관
４３ 결손 부위에 PCS 지지체를 이식 2주, 1개월, 2개월 후에 토끼 기관을 적출하여 기 관 의 외 형 을 관 찰하 였 다 . 이 식 된 지 지체 의 이 탈 이 나 변 형은 관 찰 되 지 않았으며, 주변 조직과의 공극 또한 관찰 되지 않았으며, 지지체와 기관 결손 부위가 연결된 형태를 보였다. 2주 결과 이식된 지지체는 기관결손 부위에서 부착되어 주위 조직과 융합되어 고정된 것을 확인 할 수 있었다. 이식 1개월 후에는, 2주째와 유사하게 주변조직과 융합되어 있었으며, 접촉 시 강도가 높아진 것을 확인 할 수 있었다. 이식 2개월 후 이식한 지지체는 결손부위의 크기와 유사하게 되었으며, 주변 조직과 비교 하였을 때 외형적인 특성이 유사한 것을 보였다. 시간이 지남에 따라 지지체가 기관에 흡수되는 것을 확인 할 수 있었다. H&E 염색결과 이식 후 2주째 기관의 외측으로 조직의 성장이 관찰 되었으며, 고배율로 확대 하여 관찰 하였을 때 결손 된 기관의 연골부위와 공극을 보이며 완전하게 주변 조직과 융합은 되지 않은 경향성을 보였다. 이식 후 1개월째에는 기관 내측으로 육아조직의 성장이 관찰 되었으며, 이러한 육아조직의 성장은 기관 표면에서 역 ‘T’ 형태이며 작은 대식 세포와 이물이 다량 관찰 된 것으로, 기관 조직의 표면에서 유래된 것이 아니라 내부의 호흡에 의한 이물질이나 그로 인한 대식세포의 부착에 의하여 발생된 것으로 보였다. 이식 후 2개월에는 1개월 지지체에서 관찰되던 기관 내측으로의 육아조직의 성장을 관찰 할 수 없었으며, 이식된 지지체가 주변 조직과 결합된 양상을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 이식 초기에 결손 된 조직을 수복하기 위하여 이식된 지지체의 세포에 의하여 세포외 기질이 생성되며, 이식 중기에는 생성된 세포 외 기질 주변으로 호흡 이물질이나 대식 세포들이 부착되며, 이식 말기에는 생성된 세포 외 기질이 성숙화 되면서 표면에 부착 되었던 이물질이 이탈되는 현상에 의한 것이라 생각된다. safranin-O 염색결과. 이식 2주와 1개월째 지지체와 지지체 사이에서 세포가 균일하게 분포한 것을 확인 할 수 있었으나 세포 외 기질의 분비는 관찰 할 수 없었다. 반면 이식 2개월 후에는 고배율에서 붉은 색으로 세포외 기질이 국소적으로 염색된 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 이식된 지지체는 시간이 경과함에 따라 세포 외 기질을 생성하는 것을 확인 할 수 있었다. 최근의 기관
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조직공학에서는 연구의 초점을 섬모에 두고 연구를 하기시작 하였다 (Grimmer et al., 2004). 기관상피는 위중층 섬모원주상피로 섬모세포, 점액세포, 중간형세포, 바닥세포 등으로 구성되며 이중 섬모세포는 기관상피의 주 구성세포로 공기의 전 달 뿐 아 니 라 먼 지 나 미 생 물 같 은 환 경 오 염 물 로 부 터 호 흡 기 조 직 을 보호하는 역할을 한다 (Rhodin, 1966; Plopper et al., 1986; Montgomery et al., 1990). 하나의 섬모상피세포의 CBF를 측정하는 것이 최초로 가능해진 것은 optical spectrum analysis system에 이르러 가능해졌다 (Kennedy and Duckett, 1981). CBF가 점막의 부위마다 조금씩 다르긴 하지만, 하나의 섬모상피의 섬모들은 비교적 일정한 주파수 (frequency)로 움직이고, 일정 부위의 섬모상피세포들은 동일한 주파수 대역 (frequency range)를 가진다. 섬모운동계 (ciliary system) 는 매우 역동적이고, 섬모의 운동을 조절하는 인자 역시 매우 다양하다. CBF의 조절에 관여하는 인자는 기계적 (Sanderson and Dirksen, 1989; Dirksen and Sanderson, 1990), 전기적 (Aiello et al., 1991; Weiss et al., 1992; Wong and Yeates, 1992), 그리고 호르몬에 의한 것 (Villalon et al., 1989)등 이 있다. 지지체 이식 2주, 1개월, 2개월째 기관을 채취하여 섬모의 움직임을 확인한 결과 정상섬모의 움직임과 거의 비슷한 움직임을 보였고, 이식 후 2주와 1개월에 떨어져있던 움직임이 이식 2개월 후에는 정상적으로 회복되었다. 2개월 후에 조직에서 관찰한 결과 역시 시간이 지날수록 정상적인 섬모와 형태적으로도 비슷하다는 것을 볼 수 있었다.
４５ V. 결 론 최근 들어 조직공학 및 재생의학 기반의 인공장기 개발 기술이 발전하면서 인공재료만을 사용하는 것이 아니라 생체 조직을 함께 사용함으로써 연골 및 기관의 제작에 많은 성과가 있었다. 그러나 괄목할만한 발전에도 불구하고, 골격을 이루기 위해 개발된 수많은 조직공학적 연골들은 기계적, 생화학적, 조직학적 특징에서 아직 자연 연골조직을 대치할 수 있을 만큼의 특성을 보여주지는 못하고 있다. 또한 생산된 연골을 임상적으로 이용하기 위해서는 배양 및 증식과정에서 발생할 수 있는 오염 및 감염, 면역 반응과 같은 문제들이 먼저 해결 되어야 한다. 이러한 방법들은 여러 단계로 나누고 복잡하다. 줄기세포의 경우는 긴 배양시간이 필요하고 생체 내에 이식을 했을 때 활성화된 조직으로 만드는 시간이 수개월이상 소요된다는 것 때문에 임상에서 제한이 있었다. 본 연구에서는 천연재료인 돼지연골을 사용하여 탈 세포 한 후 다공성 지지체인 PCS를 제작하였으며 지지체에 토끼 연골 세포를 접종하여 부분 손상된 토끼 기관에 이식하여 기관의 재건을 확인하고자 하였다. 연골세포를 접종한 PCS는 우리가 원하는 만큼의 기관 형성에 필요한 환경을 제공하고 있지 않는 것으로 판단된다. 다른 지지체 또한 사용하여 PCS 지지체가 기관연골재생에 얼마나 효과적으로 형성되었는지 확인 해봐야 할 것 같다. 본 논문의 결과는 이후의 In vivo 실험을 통한 토끼에서 얻은 동종 연골세포의 배양 방법을 확립하고 기관절제 동물실험모델의 구축과 개선 및 기관 내에 관한 기술과 임상적 연구 및 적용에 필요한 기초자료가 될 것으로 생각된다.
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참고문헌
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- ABSTRACT -
Radiologic, Histologic and Functional Evaluation after Implantation
of Cultured Trachea Allograft :in vivo study
Background: Commonly known as praying about how hard of a reconstruction, cartilage
grafts, anastomosis country EP and the glass plate or Sophie. The sum of the areas of narrowing it after removing the door if possible, all the way to the ideal treatment in patients with anastomosis hard liquor, this is not applicable. The sum of the door hard impossible to treat successfully a narrowing airway occlusion and remove enough parts that parts of the Agency's shortcomings, which are caused by you and will need to refinance. Shortcomings in order to rebuild parts of the EP-let, such as alcohol or commonly cartilage tissue is used, this is limited, the new agency's buildings and are willing to use water injection attempt. But in this case, rebuilding and injection duration, short after the additional aid is necessary, and this plant was destroyed or inflammation of the immune response and can lead to complications. The Agency, in the case of the plants, as well as the reconstruction and rebirth of cartilage parts played quickly and the mucous membrane and want to make the most important. The new agency's buildings or infusion water has persisted.
Object: In this study, the natural material pig cartilage extracellular using synthetic materials
and made with natural ingredients to overcome the shortcomings of delay and maximize the benefits to increase the mechanical strength of the perforated scales and implanted in the rabbit with the support agencies, the Agency seeks to make research the possibility of reconstruction.
Materials and methods: Pig cartilage cells and crushing ride throughout the process and
after compression, produced in powder form as a liaison, salt extraction by third dimension PCS (Porcine Cartilage Substance derived Scaffold) produced 5 mm in height, diameter and 12mm. Allied to the scaffolds created from the knee cartilage cells of the Hare (1x106cells/scaffold) is implanted by inoculated for the strength and characteristics of the organization intends to give 7 weekly culture. 4 of the scaffolds that cultivate adult rabbit mm x 6 mm (diameter x height) institutional shortcomings were implants, 2 weeks, 1 month,
