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약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향
오 석 준
인제대학교 E-mail: juno@inje.ac.kr 요약문 페니실린의 발견 이후, 항생제는 인류의 번영에 크게 기여하였으나, 최근 들어서 약제 내성 (藥劑耐性. drug resistance) 문제가 심각하게 대두되고 있다. 그 이유로는 항생 물질 오남용 등의 다양한 이유가 있지만, 이러한 사회적 이슈를 해결하는 것과 함께 한편으로는 약제 내성의 근본적인 기전을 이해하고 이에 대한 대비책을 마련하려는 노력이 필요하다. 그 노력의 일환으로 광범위 내성 및 다약제 내성(多藥劑耐性. multi-drug resistance, MDR) 등의 문제를 해결하기 위해 오믹스(omics) 수준에서 적용되는 연구 방법론 및 동향을 살펴보고, 그 방향성을 알아본다. Key Words: 약제 내성, 내성 기전, 정보학 도구, 항생제 내성체, 균막목 차
1. 머리말 2. 약제와 그에 대한 내성 기전 3. 서열 기반의 약제 내성 분석 4. 단백질체학 기반의 분석 5. 약제 내성에 대한 대사체학적 분석 6. 약제 내성에 관한 상호작용체 분석 7. 약제 내성과 균막(biofilm)에 관한 정보학적 접근의 예 8. 정리 및 전망 9. 참고 문헌 BRIC View 동향리포트약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 2 / 19
1. 머리말
약제(drug)는 사람의 질병이나 상태의 개선을 위해 사용하는 물질을 일컫는다. 약제 내성(drug resistance)은 어떤 이유에서든 이러한 물질의 효과가 줄어드는 현상을 뜻하는데, 주로 항생제(antibiotic), 구충제(anthelmintic) 및 항종양제(antineoplastic) 등에 대한 내성을 의미한다. 내성은 보통 resistance를 의미하지만, 좀 더 세부적이고 구체적으로는 tolerance 및 persistence 등의 개념도 있다[10]. 본 보고서에서는 기본적으로 resistance를 내성으로 다루기로 한다.
약제는 기본적으로 그 작용 대상이 정해져 있는 경우가 대부분이다. 예컨대, 항균제 (antimicrobial, 항미생물제)는 특정 무리(group) 또는 종(species)의 미생물 생육을 억제하는 약제를 뜻하며, 구충제와 항종양제는 각각 기생충과 종양에 작용하는 약제를 의미한다. 다만, 항생제와 구충제 등의 경우에는 약제의 대상이 감염 질환의 원인인 병원균이나 바이러스 또는 기생충인데 반해, 항종양제는 약제의 작용 대상이 환자의 일부라고도 볼 수 있는 종양 조직과 암세포라는 것이 차이점이다. 그러나, 약제의 표적이 사람의 정상적인 상태를 저해하는 대상이라는 점은 마찬가지라는 것 또한 사실이다. 따라서 약제 표적이 해당 약제에 대한 내성을 갖게 되면 기대하는 효과를 거둘 수 없기 때문에 그 원인과 현상에 대하여 정확하게 파악하고 대책을 수립할 필요가 있다.
2013년에 발간된 <미국 항생제 내성 위협(Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2013)>에 의하면, 2008년부터 2012년까지 미국 내에서만 항생제 내성균에 의한 감염이 연평균 약 220만 건 이상 발생하였으며, 이 가운데 3만 명 가량이 매년 사망한 것으로 알려져 있다[64]. 또 다른 자료에 의하면, 유럽에서 2만5천 명[28], 미국에서는 최소한 2만3천 명[15] 가량이 동일한 이유로 매년 사망하는 것으로 보고 있다. 뿐만 아니라, 미국에서 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile) 한 종에 의해서만 연 만4천 명이 사망한다고 한다[15]. 우리나라의 경우에는 이와 같은 약제 내성으로 인한 사망에 관한 공식적인 통계는 아직 없으며, 다른 지역의 통계와 국내 의료 환경으로 미루어 볼 때 1년에 수천에서 만 명 내외의 사망자가 약제 내성 미생물 감염에 의해 발생하는 것으로 추정하고 있다. 이와 관련하여 더욱 중요한 문제는, 항미생물제의 오남용으로 인해 약제 내성, 특히 다약제 내성(multidrug resistant, MDR) 미생물들이 급속하게 늘어나고 있다는 것이다. 영국 정부가 관련 전문가들로 구성한 <항생제 내성 심의 위원회(Review on Antimicrobial Resistance)>1가 2014년 발간한 'Antimicrobial Resistance: Tackling a crisis for the health and wealth of nations' 제하의 보고서에 의하면, 현재의 항생제 내성 확산 추세로는 2050년경 세계적으로 감염 질환으로 인한 사망자가 연간 1000만 명에 이를 것이라고 한다.
최근에는 국내에서 기존의 항생제 8종에 내성을 보이는 폐렴사슬알균(Streptococcus pneumoniae)이 발견되기도 하였다[18]. 보고에 의하면 이 검사에 적용된 항생제 8종은 페니실린 (penicillin), 세파로스포린(cephalosporins; ceftriaxone), 매크로라이드(macrolides; erythromycin, clarithromycin), 퀴놀론(quinolones; levofloxacin), 클린다마이신(clindamycin), 테트라사이클린 (tetracyclines; tetracycline, tigecycline), 트리메소프림-설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole),
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 3 / 19 카바페넴(carbapenems; imipenem) 등인데, 해당 균주들은 이 가운데 최소한 한 가지 이상의 항생제에 내성을 보였으며, 8종 항생제에 모두 내성을 보인 균주의 경우에는 반코마이신 (glycopeptides; vancomycin)과 리네졸리드(linezolid)에만 미약한 반응을 보였다.
이처럼 약제 내성 병원균들이 급속하게 확산되고 있음에도 세계적으로 제약회사들은 항미생물제 개발에 소극적으로 임하고 있다. 신약 개발에서부터 임상 적용까지는 대규모 임상 시험 등의 상당한 자원을 투여해야 하는데 오랜 시간을 투자해서 막상 개발 약제를 실제 임상에 적용하게 되더라도 적용 환자의 예상이 쉽지 않을 뿐만 아니라 얼마 지나지 않아 내성 미생물이 나타나기도 해서, 개발 비용의 회수에 어려움을 겪게 되기 때문에 항생제를 개발하는 제약회사는 줄어들고 있다[25]. 이는, 영국 <항생제 내성 심의 위원회(Review on Antimicrobial Resistance)>의 2016년 5월 보고서 'Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations'에서 볼 수 있는 것처럼 2003년부터 2013년까지의 의약 분야의 벤처 투자 자금 규모 대비 신규 항생제 개발 투자 규모가 전체의 5%도 되지 않는다는 사실로도 알 수 있다. 이처럼 많은 문제점을 인식하고 있음에도 불구하고 특히 항생제 내성과 관련된 어려움은 쉽게 해결될 것으로 보이지 않는바, 미국2, 유럽 연합(EU)3을 비롯한 전 세계 국가들이 세계 보건 기구(World Health Organization, WHO)4를 중심으로 다양한 프로그램들을 진행하고 있다.
본 보고서에서는 기본적인 약제 내성 기전과, 이와 관련하여 발생하는 다양한 약제 내성 문제를 해결하기 위해서 적용되는 여러 가지 생명정보학적 접근과 연구 동향을 알아 보고, 이 분야의 미래 발전 방향을 가늠해 보고자 한다.
2. 약제와 그에 대한 내성 기전
항생제의 역사는 1928년 플레밍(Alexander Fleming)이 페니실린(penicillin)을 발견하면서 시작되었다고 해도 과언이 아니다[29][30]. 그렇지만, 페니실린과 같은 락탐 계열의 항생제는 발견과 거의 비슷한 시기에 다른 세균에서 만들어지는 효소(e.g. β-lactamase)에 의해 분해될 수 있다는 사실도 알려졌다[1]. 이것은 다른 종류의 항생제의 경우에도 크게 다르지 않다[52]. 항생제의 주요 작용 기전으로는 세포벽 합성 저해, 단백질 합성 저해, 그리고 핵산 합성 및 교정 저해 등이 있다[102]. 세균에는 대략 200개 내외의 필수 단백질들이 있으나 이 가운데 약제의 표적으로 삼는 것은 매우 소수이다. 현재까지 항생제의 표적으로 성공적인 결과를 보이고 있는 유전자는 대략 3종류인데, 리보좀과 세포벽 생성에 관여하는 단백질 그리고 핵산의 구조 변형 및 합성에 작용하는 효소들(DNA gyrase, DNA topoisomerase, DNA-directed RNA polymerase, etc.)이 그것들이다[21][52]. 이들은 결국 앞서 언급한 항생제의 주요 작용에 관여하는 유전자들이다.
약제 내성은 항생제 등의 이와 같은 여러 기능을 약화 또는 무력화하는 약제 표적의 작용으로서, 기본적으로 약제 내성에는 다음과 같은 기전(mechanism of antibiotic resistance)이
2 https://www.cdc.gov/drugresistance/
3 http://ec.europa.eu/research/health/index.cfm 4 http://www.who.int/antimicrobial-resistance/en/
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 4 / 19 있다[7][85]. 1) 세포막 수송 체계 변화에 의한 약제의 세포 내 농도 최소화(불투과 vs 유출) 2) 표적의 변형(유전자 변이의 유무 여부) 3) 생화학적 변형에 의한 약제의 불활성화 4) 약제의 효능을 회피하기 위한 대사 과정의 변형 이러한 약제 내성 기전은 비단 세균이나 진핵 생물인 진균과 바이러스뿐만 아니라 종양 세포에 대해서도 기본적으로 유사하다고 볼 수 있다[40][58]. 즉, 세포벽, 세포막, 바이러스 외피 등의 구조적 요소와 효소를 포함한 단백질, 핵산, 그리고 엽산(folic acid) 등 기타의 여러 물질의 작용과 대사에 영향을 주는 방식으로 약제의 작용을 저해 또는 회피한다. 예컨대, 항암제(화학 요법) 내성의 경우에는 3가지 약제 유출 단백질(drug efflux pump)의 작용에 따라 내성도 변화하게 된다[71].
일반적으로 항생 물질에 대한 내성은 자연 내성(intrinsic resistance)과 획득 내성(acquired resistance)으로 구분할 수 있다. 자연 내성의 특징은 크게 두 가지로 볼 수 있는데, 하나는 특정 항생제에 민감한 표적이 해당 미생물에는 없는 경우이며, 또 다른 하나는 미생물의 세포막 조성의 차이로부터 오는 경우를 들 수 있다. 후자의 예를 보자면, 그람 음성균(Gram-negative)들은 기본적으로 세포막에 음이온 인지질이 적기 때문에 Ca2+에 의한 댑토마이신(daptomycin)의 효과를 감소시켜 내성을 나타내고[75], 그람 양성균(Gram-positive)에 효과적인 반코마이신(vancomycin)은 그람 양성균 외곽의 두꺼운 펩티도글리칸(peptidoglycan) 층의 교차 결합(crosslink)을 저해하는데 그람음성균의 외막을 통과할 수 없어서 효과를 내지 못한다[97]. 항균제 내성(antimicrobial resistance) 5에 있어서 이러한 자연 내성은 약제의 유효성에 대한 대상의 분류에 의한 것으로 원칙적으로 개개의 종(species)에 적용할 경우에는 문제가 되지 않는 측면이 있다. 예컨대, 그람 양성 및 그람 음성 세균(bacteria)에 모두 효과적인 것으로 알려져 있는 트리클로산(triclosan)은 그람 음성인 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 성장 억제에는 효과적이지 않은데, 이는 유사한 분류군 내에서도 상이한 종간 특성에 따른 현상이다[19][116]. 이에 반해, 획득 내성은 원래 어떤 종이 갖고 있던 유전학적∙생화학적 성질이 생물의 본질인 동적 특성으로 인해 변형되면서 해당 제제에 대하여 내성이 생기는 현상을 의미한다. 이와 같은 약제 내성의 대표적인 획득 기전으로는 기존의 유사 기능 유전자의 돌연변이[33]와 플라스미드(DNA plasmid), 전위유전단위(transposon), 그리고 인테그론(integron) 등 외부의 mobile 약제 내성 유전자를 도입하는 수평적 유전자 이동(horizontal gene transfer)이 있다[7][88]. 예컨대, 오래전부터 전 세계에서 지속적으로 문제가 되고 있는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 있어서 세포벽 합성에 관여하는 유전자인 embB (arabinosyltransferase B)의 306번째 코돈(codon)에 변이가 발생하면, 에탐부톨(ethambutol, EMB) 등과 관련된 항생제에 내성이 생긴다[81][95]. 이외에도 M. tuberculosis의 여러 유전자 돌연변이에 의한 내성 발생과 그 기전이 보고된 바 있다[114]. 또한,
5 '항미생물제 내성'이라고도 함. 세균뿐만 아니라 바이러스 및 진균도 포함한 광의의 미생물에 대한 약제의
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 5 / 19 후자의 예로는 NDM-16을 들 수 있다[112]. 2010년 국내에서도 존재가 보고된 바 있는 항생제 분해 효소 NDM-1의 유전자[117]는 클레브시엘라(Klebsiella)를 비롯한 다양한 세균의 플라스미드에 존재하며 동종 또는 타 균종으로 내성을 전달하는 역할을 한다[48]. 이처럼 미생물의 약제 내성 요인에는 병원균 원래의 내성에서부터 부적절한 항생제 처방과 판매에 의한 유전적 변형까지 그 종류가 매우 다양하다. 특히, 최근 들어서 문제가 되고 있는 다양한 항균제의 오남용이 병원균 약제 내성의 선택적 발생을 부추기는 측면이 있음을 부정할 수 없다. 이에 따라, 최근에는 미국 전염병학회 (Infectious Diseases Society of America, IDSA)에서 인체에 다양한 감염증을 일으키는 주요 표적으로 선정한 6가지 병원균인 ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, and Enterobacter species)[79]에 대하여 주의를 환기시키고, 이들에 대한 항생 물질 개발에 주력하는 등의 노력을 기울이고 있다[9]. 또한, 주의해야 할 다제 내성 그람 음성 박테리아(Multidrug-resistant gram-negative, MDRGN)에 대해서도 이미 감염에 주의할 필요성이 보고된 바 있다[60]. 약제 내성으로 주의해야 할 이들 대표적인 병원균을 아래 표에 정리해 보았다. 표 1. 대표적인 약제 내성 박테리아 구분 내용 그람염색
메티실린 내성 포도알균* Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) G+ 반코마이신 내성 포도알균* Vancomycin-Resistant S. aureus (VRSA) G+ 반코마이신 내성 장내구균* Vancomycin-Resistant Enterococci (VRE) G+ 카바페넴 내성 장내균* Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae (CRE) G+ 다제내성 녹농균* (그람음성 간균) Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa (MRPA) G- 다제 내성 아시네토박터균* Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii (MRAB) G- 플루오로퀴놀론 내성 녹농균 Fluoroquinolone-Resistant P. aeruginosa (FQRP) G- * 다제 내성 6종은 2010년 12월 30일에 전면 개정하여 시행된 '감염병의 예방 및 관리에 관한 법률'에서 법정 감염병 중 지정 감염병으로 등록 관리. 이와 같은 항균제 내성뿐만 아니라 항바이러스제 및 항암제의 내성에 대한 문제점 해결을 위해서는 구체적인 세부 기전을 이해할 필요가 있다.
3. 서열 기반의 약제 내성 분석
현재 병원균과 바이러스의 약제 내성과 관련하여 일어나고 있는 수많은 문제들은 인간의 약제 오남용에 의해 더욱 촉진되는 측면이 강하다. 생명체는 복잡도 수준의 고하를 떠나서 그 속성 상 자율적이면서도 역동적일 수 밖에 없다. 따라서 약제 표적의 입장에서는 자신의 생존을 위해6 New Delhi Metallo-beta-lactamase 1. Extended-Spectrum beta-Lactamase (ESBL) 생산균 감염 치료에 효과적
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 6 / 19 약제의 효과를 최소화시키는 방향으로 반응하기 때문에, 약제의 세포 내 유입 최소화, 유입된 약제의 배출 또는 변형 등의 방법으로 피해를 줄이려 하게 된다. 그 결과가 약제 내성으로 나타나게 되는데, 이때 항균제의 경우 내성 여부를 확인하기 위해서는 기본적으로 혈액 배양(과 분리 배양)을 통한 항균제 감수성 검사(antimicrobial susceptibility test, AST)를 거치게 되며, 그 결과를 확인하기 위해서는 기존의 전통적인 방식으로는 3일(60시간)의 시간이 소요된다. 그런데, Garnacho-montero 등의 다변량 분석 결과에 의하면, 적절한 항생제 처치를 받지 못할 경우 패혈증 환자의 생존율은 시간 당 9%씩 떨어진다고 한다[35]. 그러므로 감염 초기의 병원균 식별이 매우 중요하다.
최근 들어 이러한 병원균의 확인 속도와 정확도를 개선하기 위한 기술 개발이 활발하게 진행되고 있다[101]. 이러한 맥락에서 미생물의 부분 또는 전장 유전체 서열 분석이 유용하게 활용될 수 있는데, 예컨대 결핵균(M. tuberculosis)의 전체 유전체 서열(whole genome sequence, WGS)이 결정된 이후[12][22], 유전체 수준의 연구를 지속하면서, 약제 내성뿐만 아니라 전염성과 병원성 등과 관련된 유전체의 변이를 확인할 수 있게 되었다. Zhang 등에 따르면, 고병원성 결핵균의 여러 변종들의 전장 유전체 서열 분석을 통해 대량 유전체 결실(large genomic deletion, LGD) 부위가 3곳에 이르는 사실을 확인하였다[113]. 이 가운데 2개의 LGD는 주로 반복 서열(repetitive sequence)들로서 속성상 결손에 취약한 것을 알 수 있었으며, 다른 하나의 LGD는 katG와 furA 유전자를 포함하는 부위인데, 이 두 유전자는 이소니아지드(isoniazid, INH)의 내성과 관련이 있다[3]. 이외에도 M. tuberculosis의 약제 내성과 관련된 10가지 이상의 유전자와 해당 약제에 대해서 잘 알려져 있다[2]. 이와 같이 항생제 내성과 관련이 있는 서열 다형성(large sequence polymorphisms, LPSs) 및 integron[65] 등을 포함한 구체적이고도 세밀한 내용은 해당 미생물 군에 대한 유전체 서열을 비교 검증하는 것이 가장 확실하다고 할 수 있겠다. 현재 질병 관리 본부의 결핵 관리 지침에는 진단을 위한 전통적인 방법으로 환자의 첫 배양 분리 균주에 대하여 항결핵제에 대한 약제 감수성 검사를 실시하도록 하고 있다. 상황에 따라서 유전체 정보를 이용하는 신속 내성 검사에 Xpert MTB/RIF[104]를 사용한 검출 방법을 권고하고 있으나, 단독으로 적용하기에는 아직 보완되어야 할 사항들이 있다. 참고로, 결핵균의 약제 내성 관련 정보는 Tuberculosis Drug Resistance Mutation Database(표 2)에 정리되어 있다[82]. 이와 같이 전장 유전체 염기서열 정보로부터 항결핵제 내성 여부 및 각 돌연변이 종류의 신속한 결정을 통하여 좀 더 세밀하고 환자 특이성에 적절한 진료와 처방을 목표로 하여 온라인 도구를 개발하는 등의 다양한 연구가 진행되고 있다[23].
약제 내성 관련 서열 정보의 분석을 통하여 새로운 유전자를 찾아낸 예로는 방선균 (Actinomycetes)과 다른 박테리아에서 널리 퍼져 있던 리파마이신 내성 유전자(rifamycin-resistance gene)인 rph (rifampin phosphotransferase)를 발견한 경우를 들 수 있다[91]. RPH 이종상동성 유전자(ortholog)는 Bacillus cereus를 포함한 리팜핀 감수성 세균(rifampin-sensitive bacteria)에서부터 Listeria monocytogenes 등의 병원균에 이르기까지 광범위한 세균들에게서 발견되는데, 여러 방선균 속(放綿菌 屬)이 보유하고 있는 리팜핀 불활성화 효소(rifampin-inactivation enzyme)의 upstream 영역에 잘 보존된 조절 부위인 리팜핀 동반 요소(rifampin-associated element, RAE) 및 rph의 ortholog를 계통발생학적 분석(phylogenetic analysis)을 통하여 발굴하고, 이들을 원래의 종과 다른 세균에서 이종 발현(heterologous expression)해 보면 실제 임상에서 사용되고 있는 리파마이신계
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 7 / 19 항생제들에 대해서 상당한 정도의 내성을 나타낸다. 이는 항생제 내성체(antibiotic resistome)의 한 예로서[27][108], 잠재적 항생제 내성의 발견 가능성을 시사한다고 할 수 있다.
이와 같은 유전체 수준의 염기 서열 정보의 활용은 또 다른 약제 내성 병원균인 아시네토박터(Acinetobacter baumannii)의 유전체 분석 등을 통하여, 콜리스틴 내성(colistin resistance)은 pmr 유전자 좌(locus)의 돌연변이에 의해 일어난 것이며 이 돌연변이는 약제의 존재 등 환경의 선택 압력에 따라 영향을 받는 것임을 알게 해 주었다[90]. 뿐만 아니라, 전체 유전체 정보를 통하여 아시네토박터의 카바페넴 내성(carbapenem resistance)이 접합 플라스미드(conjugative plasmid)에서 비롯되었음을 알 수 있었으며, 이를 통하여 다제 내성 기전의 실체를 확인할 수 있도록 해 주었다[41]. 또한, 여러 아시네토박터 계통의 비교 유전체 연구(comparative genomics)를 통하여, 60개 이상의 단일 염기 다형성(single-nucleotide polymorphism, SNP)을 확인하였으며[93], 전사체 및 단백질체를 조사하여 항미생물제 노출 하에서는 포린(porin) 단백질의 발현량이 감소되는 사실을 확인하였다[86]. 유전체 서열 분석을 통해 알 수 있는 사실 가운데 언급할 만한 것은, 진단 초기에 이미페넴 내성(imipenem resistant)에 콜리스틴(colistin)과 리팜핀(rifampin)에는 감수성인 아시네토박터가 분리된 환자에게 콜리스틴과 리팜핀을 4주 간 처치한 후, 다시 아시네토박터를 분리하였더니 콜리스틴 및 리팜핀 내성 균주가 발견된 경우이다[80]. 이때 이러한 내성의 분자적 기전을 가장 확실하게 확인하는 방법은 신속하게 전체 유전체 서열을 결정하여 비교 분석하는 것이다. 아울러, 최적화된 약제 조합과 개인 맞춤 의료에 필요한 정밀한 분석을 위해서, 단백질의 기능과 특성을 염기 서열 수준에서 알아보는 심화 돌연변이 탐색(deep mutational scanning)이 좋은 방법론이 될 수 있다[31][32].
유전체 수준의 내성 기전 연구에 있어서 최근에 주목받고 있는 영역으로 메타 유전체학 (metagenomics)이 있으며[38], 메타 유전체 분석을 위한 시스템으로는 IMG/M[62][63] 등이 있다. 특히, 배양이 용이하지 않은 환경 세균류에 관한 약제 내성 유전자의 분포와 다양성, 그리고 그 근원에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이에 대한 연구를 위해서는 메타 유전체를 중심으로 하는 접근 방법이 필요하다[85]. 예컨대, 2013년 Loman 등이 수행한 연구를 보면, 2011년 독일에서 있었던 시가 독소 대장균 (Shiga-toxigenic Escherichia coli O104:H4) 환자의 대변으로부터 얻은 시료에 대하여, WGS를 시행함으로써 전체 항미생물 작용의 조절과 제어 기전 및 새로운 내성 요소를 발견할 수 있는 기반을 마련하였다[57]. 이러한 메타 유전체 분석을 통해 내성 결정 인자(resistance determinant)를 찾기 위한 근거를 준비하여, 이로부터 내성 병균의 확산을 감시하는 새로운 진단 시험법 개발하고 나아가 임상에 적용할 수 있는 새로운 항균제를 개발할 수 있을 것이다. 이를 위해서는 신약 후보 물질 발굴을 위한 표적 메타 유전체학[96]뿐만 아니라, 항생제 내성 유전자 연구를 위한 메타 전사체학(metatranscriptomics)[5][102]도 함께 고려하는 것이 좋을 것이다.
4. 단백질체학 기반의 분석
단백질체 분야의 연구 수준도 발전을 거듭한 결과, 그람 음성 세균에 대하여 외막(outer membrane)의 포린(porin)과 유출 요소(efflux component)에 대한 유전체 수준의 접근[6], 그리고약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 8 / 19 단백질체학 및 정보학적 분석을 통한 40여 가지 외부 세포막 단백질의 작용 연구[53] 등 다양한 분야의 연구 결과를 보고하기에 이르렀다.
최근에는 MALDI-TOF 질량 분석법과 나노-액체 크로마토그래피(nano-LC)를 이용한 단백질체 분석을 통하여 세포탁심(cefotaxime) 가수분해 β-lactamase (CTX-M-1), Amp-C β-lactamase (CMY-2), metallo-β-lactamase (VIM), TEM β-lactamase 및 아미노글리코사이드 변형 효소인 KanR 등의 대장균 임상 세포주의 항생제 내성 표지자들을 확인할 수 있음을 보고하였다[39]. 특히, Li 등은 약제의 배출을 통한 내성 기전에 관하여 20여 종에 달하는 그람 음성균의 구체적인 단백질의 세부 작용에 이르기까지 자세하게 정리하여 보고한 바 있다[55]. 종양의 약제 내성에 대한 단백질체 수준의 연구로는 췌장암(pancreatic cancer)에 대하여 항암제인 젬시타빈(gemcitabine)을 처리하고 그 단백질체의 거동을 분석한 보고가 있다[17]. 분석 결과에 의하면 항암제 내성 세포에서는 생합성 및 해독 작용에 관여하는 단백질의 발현이 증가하였으며, 반면에 항암제 감수성 세포에서는 혈관 수송, 칼슘 의존 신호 조절 단백질 등의 발현량이 많은 것으로 나타났다. 이외에도 항암제에 의한 내성은 단백질 상호 작용과 정보학적 분석 및 면역 탁본법(immunoblot)에 의하면 종양 억제 단백질인 p53와도 연관 관계가 있는 것으로 나타났다. 이외에도 항 혈소판제제(antiplatelet drug)에 대한 단백질체학적 접근을 시도한 연구[61]와 난소암(ovarian cancer)에 있어서 DNA 메틸화(DNA methylation)에 의해 약제 내성을 갖게 되는 현상에 관여하는 유전자와 그 작용에 대하여, 단백질 상호 작용(protein interaction)과 생물학적 과정(biological process)의 정보 결합 등 정보학적 방법을 적용하여 구명하고자 한 연구 등이 있다[110].
5. 약제 내성에 대한 대사체학적 분석
질량 분석법(mass spectrometry)의 급속한 발전에 따라서 대사체 분야도 많은 진전이 있었다. 예를 들면, 병원균 감염 시 여러 가지 항생 물질을 처리하였을 경우에 일어나는 혈액 내 물질의 변화를 다변량 분석 등의 방법을 통하여 대사체학적으로 탐지함으로써 포도알균(Staphylococcus aureus)에서 항생제 내성에 의해 변화되는 대사 산물의 생성 양상을 파악하여 분자 수준의 구체적인 작용 기전을 알아 본 보고가 있다[4]. 또한, 아시네토박터(A. baumannii)의 폴리믹신(polymyxin) 저항성 연구를 위하여, 액체 크로마토그래피와 질량 분석을 이용한 약제 감수성 및 저항성 균주의 각 대사체 분석에 다변량 및 일변량 분석을 적용하여 분석한 보고가 있는데, 이는 약제 감수성 및 내성 균주를 치우침 없이 비교 분석한 비표적 대사체학(untargeted metabolomics) 연구라고 할 수 있다[59]. 분석 결과, 특정 아미노산과 5탄당 인산 경로(pentose phosphate pathway, PPP) 및 TCA 회로 대사 산물의 차이가 뚜렸하였으며, 지질 다당질(lipopolysaccharide)과 펩티드글리칸 (peptidoglycan) 등의 생합성 대사 물질의 차이가 두드러진 것으로 나타났다.항암제 내성에 관한 대사체 수준의 연구도 다양한데, 예를 들면 미토콘드리아와 암 연구를 위한 대사체학적 접근[66]을 비롯하여, 위암(gastric cancer) 및 그 약제에 대한 내성에 대한 대사체학[83], 그리고 유방암 세포의 adriamycin 약력학과 내성에 대한 대사체학적 접근[13] 등이 그것들이다. 또한, 식도의 편평세포 암종(squamous cell carcinoma)에 대한 개인 종양학 관점에서
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 9 / 19 연구한 보고가 있으며[46], 췌장암 및 대장암 요법에 대한 약제 내성에 있어서의 다양한 전체론적 접근법에 대해서는 Sarkar의 보고를 참고할 만하다[83].
6. 약제 내성에 관한 상호작용체 분석
결핵균(M. tuberculosis)의 약제 내성 유전자 탐색에 마이크로어레이(microarray) 실험 자료에 단백질 상호작용체(interactome)를 적용하여 관련 유전자 군의 발굴 가능성이 확인된 이후[74], Chen 등은 M. tuberculosis에 이소니아지드와 에티온아마이드(ethionamide) 등을 처리하고 이에 따른 유전자 발현 양상에 대하여 무작위 행보법(random walk method)을 활용한 분석으로 다제 내성과 관련된 유전자의 거동을 보고하였다[16]. 이 연구에 따르면, M. tuberculosis에 해당 약제를 처리하여 얻은 미국 NCBI 7 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스의 마이크로어레이(microarray) 자료[8]를 분석함에 있어, 상호작용체 네트워크(interactome network)인 STRING 8 데이터베이스 [93][103]의 정보 및 광범위 약물 데이터베이스인 DrugBank 데이터베이스[50][107] 정보에 더하여 유전자 발현 분석에 있어서 표현형과 관련 유전자 및 단백질로 구성된 복잡한 생물학적 네트워크 분석에 효율적인 것으로 알려진 무작위 행보법을 적용하여[45], 다제 내성에 관여할 것으로 예측되는 유전자군을 선별하였다. 그 결과, 지방산과 NADH 및 ATP 관련 대사와 유출 펌프, 그리고 SOS 반응 및 세포막 단백질(glycine-rich)과 세포벽 대사 관련 유전자 군이 다제 내성과 관련이 있는 것으로 나타났다. 이미 이전의 보고에서 약제 내성 관련 유전자들은 다음 유형들로 대별할 수 있다고 한 바 있다[67]. a) 약제 유출 단백질 b) 시토크롬(cytochrome P450) 및 다른 약제 변형 효소 c) SOS 반응 관련 유전자d) 수평적 유전자 이동(horizontal gene transfer, HGT) 관련 유전자
이러한 내용을 참조하여 새로운 방법론을 적용한 연구 결과를 분석해 볼 필요가 있다.
이후, 무작위 행보법은 암조직에서 항암제의 내성과 관련된 유전자의 조절 양상을 알아 보는 데 적용되기도 하였는데, Guo 등은 아드리아마이신(adriamycin, ADR)과 빈크리스틴(vincristine, VCR) 등에 내성이 있는 위암(gastric cancer) 세포의 약제 내성 기전을 알아 보기 위하여, iTRAQ와 LC-MS/MS를 결합한 실험과 단백질 상호작용체 분석을 종합하여 두 가지 항암제에 대한 내성 관련 유전자들을 제안하였다[37]. 이를 좀 더 자세히 보면, DrugBank에서 추출한 약물 관련 단백질 정보와 GLAD4U[44]로 수행한 PubMed 자료에 대한 텍스트 마이닝 결과를 기준으로 HPRD9[47]에서 상호 작용이 없는 단백질들을 제외하여 얻은 아드리아마이신 관련 11개와 빈크리스틴 관련 12개의
7 National Center for Biotechnology Information. 미국 국립생물공학정보센터. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. 8 Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 10 / 19 초기 단백질을 시작점으로 편의 무작위 행보법(biased random walk)을 적용한 ProteinRank 방법으로 검증하였다. 분석 결과에서는 ABCB1, ABCB8, ABCB11, 그리고 CYP3A4 등의 단백질이 항암제 내성과 관련성이 높은 것으로 나타났다. 여기까지 전체적인 약제 내성 관련 연구 분야에 대해 알아 보았으며, 참고로 약제 내성 관련 데이터베이스를 (표 2)에 소개하였다. 표 2. 약제 내성 관련 데이터베이스 명칭/설명/참고 문헌 데이터베이스 URL ARDB http://ardb.cbcb.umd.edu/ 세균 항생제 내성 유전자 데이터베이스. [56] ARGs-OAP http://smile.hku.hk/SARGs 항생제 내성 유전자 (ARGs) - 온라인 분석 파이프라인 [111] BacMet http://bacmet.biomedicine.gu.se/ 살균제 및 금속 내성 유전자 데이터베이스. [70] CARD 2017 http://arpcard.mcmaster.ca 항생제 내성 종합 데이터베이스 [43]
HIV Drug Resistance Database http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/RESDB/
항HIV제제 내성 유발 HIV 유전자 돌연변이 데이터베이스. [78, 87] https://hivdb.stanford.edu/ MvirDB http://mvirdb.llnl.gov/ 단백질 독소, 독성 인자 및 항생제 내성 유전자 데이터베이스. [115] TBDReaMDB https://tbdreamdb.ki.se/Info/ 결핵 약제 내성 돌연변이 데이터베이스 [82] TBDB http://www.tbdb.org/ 스탠퍼드 결핵 데이터베이스 [34, 77]
7. 약제 내성과 균막(biofilm)에 관한 정보학적 접근의 예
일찍이 도뇨관(urinary catheter)에 형성된 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 균막(biofilm)에 의한 약제 내성의 가능성이 보고된 이후[68], 균막과 약제 내성 간의 관련성에 대하여 꾸준히 연구, 보고되어 왔으며[51], 최근 들어 이의 기전에 대한 연구가 좀 더 구체화되고 있다. 예를 들어, 칸디다 혈증(~ 血症, candidemia)에 대하여 적절한 항생제 처치를 시행하지 못할 경우 환자의 사망률에
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 11 / 19 영향을 주게 되고, 그 이유가 칸디다 균의 균막에 의한 것이라는 보고가 있는데[98][99], 이와 같은 균막 형성과 약제 내성 간의 연관성에 관하여 좀더 구체적인 원리를 파악하기 위해 전사체 수준의 연구가 진행되었다. 해당 보고에서 Rajendran 등의 연구자들은 칸디다(Candida albicans)의 균막 고형성(high biofilm forming, HDF) 분리주(isolate)가 아르기닌(Arg), 프롤린(Pro), 아스파트산(Asp), 그리고 글루탐산(Glu) 등의 아미노산 대사 회로 관련 유전자들이 활성화된 반면, 균막 저형성(low biofilm forming, LDF) 분리주는 퓨린과 녹말, 그리고 자당(sucrose) 등의 대사량이 증가함을 확인하였다[73]. 특히, 이 가운데 공통 요소인 아스파트산 아미노기 전달 효소(aspartate aminotransferase, Aat1)와 균막 형성의 정도가 효소의 양에 의존적인 양상을 보였다.
앞에서도 이미 언급되었으며 다제 내성 전염병균으로 중요한 자리를 차지하고 있는 그람 음성균인 아시네토박터(A. baumannii)의 비교 전사체학(comparative transciptomics) 분석 연구 결과 또한 약제 내성과 균막 간 관계의 중요성을 관련 유전자 발현을 통해 알려 주고 있다[54]. 이 보고에 따르면, 균막 형성 및 지수기 생장 환경(exponential growth condition) 하에서 각각 전체 전령RNA (messenger RNA, mRNA)의 발현 정보를 분석한 결과, 균막 형성 환경 하에서 배양된 경우에 지수기 생장(exponential growth) 환경에서 배양된 경우보다 균막 생성 및 유지와 관련된 특정 신호 전달 체계와 전사 인자 관련 유전자의 발현 정도가 더 높은 것으로 나타났다. 이는 전사체의 발현 분석을 통하여, 균막 형성과 이에 따른 약제 내성의 내부 기전을 파악함으로써 내성 극복을 위한 표적을 발굴하는데 도움이 되는 정보를 얻을 가능성을 높인 것이다. 또한, 아시네토박터의 균막 형성과 다제 내성에 대해서는 단백질체 수준에서의 연구도 이루어지고 있는데, Cabral 등은 이 균의 지수적 생장기와 정체기, 그리고 균막 생성의 각 환경에서 각각의 균체에 대해 MALDI-TOF/TOF와 iTRAQ 10 /SCX-LC에 이은 MS/MS 방법을 적용한 비교 단백질체학적 연구를 통하여, 다양한 세포 표면 단백질과 우로카나아제(urocanase)와 같은 히스티딘 (His) 아미노산 대사에 관여하는 요소들이 균막 생성과 유지에 필요함을 확인하였다[11]. 이와 같은 단백질체 수준의 연구는 여러 병원균으로 확대되고 있다. 예컨대, 최근에는 Sun 등이, 다양한 숙주에서 분리되며 간농양 등의 원인균인 그람음성막대 병원균 Edwardsiella tarda에 대하여[20], 역시 iTRAQ 등을 이용한 단백질체 분석으로 항생제 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline)에 대한 해당 병원균의 내성을 알아 본 결과, 균막 형성의 중요성과 관련된 여러 단백질의 발현 양상과 그 영향이 약제 내성과 관련이 있음을 보고하였다[92]. 연구팀은 실험과 관련 단백질체 정보 분석을 통하여 리보좀 등의 단백질 합성과 관련된 요소들의 발현량이 증가함을 확인하였으며, 세균의 TCA 회로(tricarboxylic acid cycle)에서 중요한 역할을 하는 MaeB (NADP-dependent malic enzyme) 효소의 돌연변이가 균막의 형성을 통하여 옥시테트라사이클린에 대한 내성을 증가시키는 것을 확인하였다.
최근, 미국 샌디에고 캘리포니아 대학의 Süel 교수 등은 고초균(Bacillus subtilis)의 YugO11의 TrkA12 부위 돌연변이를 이용한 여러 실험과 수학적 모델링을 통하여, 균막의 형성이 미생물 집단의
10 isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification 11 칼륨 통로 단백질; potassium channel protein. 12 Potassium uptake protein
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 12 / 19 신호 전달에 의해 조절되며 이러한 신호를 이용하여 원거리에 있는 다른 종(녹농균; P. aeruginosa)의 미생물과도 교류하는 현상을 보고하였다[42]. 참고로, TrkA에 의한 칼륨 이온(K+)의 흡수가 항산균의 일종인 Mycobacterium smegmatis에서 세포막 전위(membrane potential)와 pH 항상성, 그리고 다제 감수성(multidrug susceptibility)을 조절한다는 보고가 있었다[14].
이외에도 균막과 항생제 내성과의 관계에서 세포막에 존재하는 유출 펌프(efflux pump) 단백질이 균막의 생성과 유지에 중요한 역할을 한다는 연구 결과와 관련하여[49], 유비저(類鼻疽, melioidosis) 원인균(Burkholderia pseudomallei)에 있어서 녹농균의 유출 수송체(efflux transporter) 이종상동성 유전자(異種相同性 遺傳子, ortholog)를 정보학적 방법으로 추정하고, 이에 대한 저해제를 시험함으로써 해당 유출 수송체 단백질이 균막의 형성에 직접 기여할 뿐만 아니라 항생제 내성에도 관여함을 밝힌 보고가 있다[89].
8. 정리 및 전망
약제 내성에 대한 과학적인 접근을 위해서는 특정 방법론이 중요하다기 보다는 자료 주도적이고(data-driven), 중립적이며(neutral), 편향되지 않은(unbiased) 학제적 지식의 종합적 통합이 필요하다. 예컨대, 방선균류(Actinomycetes)는 항미생물질, 항종양물질, 그리고 이외의 다양한 의료용 항미생물제 선발을 위한 훌륭한 자원이며, 다양한 분야를 복합적으로 구성하여 실험을 설계하면 미량의 대사 산물도 프로파일링이 가능할 것으로 보고 있다[109]. 이렇게 신규 항생 물질을 고려할 때에는 그 대상에 대하여 다음과 같이 항생제 내성체의 관점에서 시야를 확장할 필요가 있다[27][108].
1) 병원균의 내성 유전자(resistance elements found in pathogenic bacteria)
2) 항균제 생성균의 내성 유전자(resistance elements found in antibiotic-producing bacteria) 3) 드러나지 않은 내성 유전자(cryptic resistance genes)
4) 잠재적 내성 유전자 변환 가능 유전자(precursor genes that encode proteins with modest antibiotic resistance activity, or affinity to antibiotics)
예를 들면, 간단하게는 관련된 항생제 내성 유전자(antibiotic resistance genes, ARGs) 데이터베이스[43]에 메타게놈 자료로부터 해당 유전자를 찾아내는 분석 파이프라인을 적용하는 방법을 생각해 볼 수 있겠다[111]. 한편으로는 신속한 진단을 위해서, 발광 염기 서열 결정법 (pyrosequencing) 및 실시간(real-time) 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 등의 앰플리콘 서열 결정(amplicon sequencing) 실험 방법과 다양한 생물정보학적 도구를 포함한 차세대 약제 감수성 시험 분석(next generation rapid drug susceptibility test, Next Gen-RDST) 등의 임상에의 적용을 시도하고 있다[24].
새로운 약제의 개발에는 표적의 선발과 이에 대한 약제의 분자 결합 모사(molecular docking simulation)가 필요하다. 참고로, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics,
약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향 오석준 Page 13 / 19 SIB)13에서 운영하는 Click2Drug14을 보면, 컴퓨터 이용 약물 설계(computer-aided drug design, CADD)와 관련된 정보와 다양한 전산 도구들을 볼 수 있다. 예컨대, 화합물 및 단백질 정보를 정리해 놓은 데이터베이스라든가 화합물 구조 표현 방식, 분자 모델링, 결합 부위 예측, 화합물 선별과 표적 예측, 리간드 설계, 결합 자유 에너지 계산 도구, QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) 및 ADME/Tox (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion/Toxicity) 관련 도구들과 이에 대한 전반적인 내용을 확인할 수 있다. 이외에도 최근 급격하게 발전하고 있는 면역 요법에 정보학적 방법론을 적용하는 것[69]과 컴퓨터를 이용한 백신(보조제) 설계 분야[100] 또한 다른 방식으로 약제 내성의 극복에 도움이 될 것이다. 약제 내성에 대한 새로운 해결책을 마련하는 데에는 약제와 그에 대응하는 미생물의 진화 사이에 상존하는 원리에 대한 근본적인 고민이 필요하다. 이와 함께, 약제 내성을 발현하는 생물학적 반응에 대응하는 속도를 높이고 수행하는데 필요한 비용을 줄이기 위해서 다양한 정보학적인 접근법을 적극적으로 활용하는 것이 필요하다 하겠다.
9. 참고 문헌
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The views and opinions expressed by its writers do not necessarily reflect those of the Biological Research Information Center. 오석준(2017) 약제 내성 문제에 대한 정보학 관련 연구 동향. BRIC View 2017-T04
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