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Langmuir-Blodgett 방법을 이용한 온도감응성 엘라스틴 유사 폴리펩타이드의 계면 거동 연구

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(1)

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(2)

농학석사 학위논문

Langmuir-Blodgett 방법을 이용한

온도감응성 엘라스틴 유사

폴리펩타이드의 계면 거동 연구

Interfacial Behavior of Thermosensitive

Elastin-like Polypeptide

Using Langmuir-Blodgett Technique

2014년 2월

서울대학교 대학원

바이오시스템 ∙ 소재학부

바이오소재공학전공

(3)

Langmuir-Blodgett 방법을 이용한

온도감응성 엘라스틴 유사

폴리펩타이드의 계면 거동 연구

Interfacial Behavior of Thermosensitive

Elastin-like Polypeptide

Using Langmuir-Blodgett Technique

지도교수

현 진 호

논문을 농학석사 학위논문으로 제출함

2013년 12월

서울대학교

바이오시스템

∙ 소재학부

바이오소재공학전공

안 성 민

안성민의 석사 학위논문을 인준함

2014년 2월

위 원 장 김 태 일 (인)

부위원장 현 진 호 (인)

위 원 이 기 훈 (인)

(4)

초 록

본 연구에서는 Langmuir-Blodgett(LB) 방법을 이용하여 공기-물 계면에 흡착된 elastin-like polypeptide(ELP) 분자의 거동을 살펴보았다. ELP는 온도 자극에 의한 상전이(phase transition) 특성을 나타냄으로 다양한 온도 조건에서 물리적 압력에 따른 ELP의 계면 거동을 분석하기 위하여 표면압력-면적 등온선(surface pressure-area(π-A) isotherm)을 측정하였고 특정 조건하에서 계면에 형성된 단분자막을 mica 기판으로 전사하여 atomic force microscopy(AFM)으로 표면 구조를 측정하였다. 모든 조건에서 단분자막이 형성된 것으로 보아 ELP 분자가 계면에 안정적으로 흡착된다는 것을 확인하였으며 표면압력-면적 등온선의 형태와 단분자막의 표면 구조의 변화를 토대로 온도와 물리적 압력이 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조와 분자 간 상호작용에 미치는 영향을 고찰하였다.

주요어:

Elastin-like polypeptide(ELP), Langmuir-Blodgett(LB) 방법,

표면압력

-면적 등온선(Surface pressure-area (π-A) isotherm), 계면 거동

(Interfacial behavior)

(5)

목 차

초록

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

목차

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

List of Figures

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

제 1 장 서 론

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

1

제 2 장 문헌 연구

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

3

2.1 Elastin-like polypeptide(ELP)의 특성

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

3

2.2 Langmuir-blodgett(LB) 방법의 기본 이론 및 응용

∙∙∙

6

2.2.1 LB 방법의 개념

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 6

2.2.2 LB 방법을 이용한 계면에서의 분자 거동 연구

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 9

제 3 장 재료 및 방법

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

13

3.1. Elastin-like polypeptide(ELP)의 제조 및 분석

∙∙∙∙∙∙

13

3.1.1 ELP의 발현 및 정제

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 13

3.1.2 ELP의 특성 평가

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 16

3.2 Langmuir-blodgett(LB) 방법을 이용한 elastin-like

polypeptide(ELP)의 계면 거동 분석

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

17

3.2.1 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm) 측정

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 17

(6)

3.2.3 Atomic force microscopy(AFM)를 이용한 ELP

단분자막의 표면 구조 분석

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 18

제 4 장 결과 및 고찰

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

19

4.1 Elastin-like polypeptide(ELP)의 특성

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

19

4.1.1 ELP의 상전이(phase transition)

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 19

4.1.2 ELP의 이차 구조(secondary structure)

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 19

4.2 Elastin-like polypeptide(ELP)의 계면 거동

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

23

4.2.1 ELP의 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm) 분석

∙ 23

4.2.2 온도에 따른 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm)의

변화

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 28

4.3 Elastin-like polypeptide(ELP) 단분자막의 표면 구조

분석

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

31

4.3.1 온도에 따른 ELP 단분자막의 표면 구조 변화

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 31

4.3.2 특정 온도 조건하에서 물리적 압력에 따른 ELP 단분자

막의 표면 구조 변화

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙ 36

4.4 온도와 물리적 압력에 따른 계면에서의 elastin-like

polypeptide(ELP) 분자 구조와 분자 간 상호작용에 대한

도식화

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

43

4.5 계면에서의 elastin-like polypeptide(ELP) 이차구조

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

46

제 5 장 결 론

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

48

(7)

참고 문헌

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

50

(8)

List of Figures

Figure 1 Recursive directional ligation(RDL) method.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

4

Figure 2 Phase transition of elastin-like polypeptide(ELP).

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

5

Figure 3 Langmuir-Blodgett(LB) method.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

7

Figure 4 Wilhelmy plate method.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

8

Figure 5 Surface pressure – Area(π-A) isotherms: (a) gas phase, (b)

liquid phase, (c) solid phase, (d) collapse phase.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

12

Figure 6 Inverse transition cycling(ITC) method.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

15

Figure 7 Turbidity of ELP solution(1mg mL

-1

) obtained by monitoring

the absorbance at 350 nm as a function of temperature.

∙∙∙∙∙∙∙

21

Figure 8 Circular dichroism(CD) spectra of ELP solution(1mg mL

-1

) as

a function of temperatures.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

22

Figure 9 Compression surface pressure-area(π-A) isotherm for ELP as a

function of temperatures.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

26

Figure 10 Young’s modulus obtained from compression surface

pressure-area(π-A) isotherm for ELP as a function of

temperatures.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

27

(9)

compression surface pressure-area(π-A) isotherm for

temperature.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

30

Figure 12 Topography images of ELP LB films transferred on mica

substrates at 2mN m

-1

and different subphase temperatures:

(A) 10℃, (B) 20℃, (C) 30℃, (D) 40℃.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

34

Figure 13 Root mean square(RMS) roughness(Rq) of ELP LB films

transferred on mica substrates at 2mN m

-1

and different

subphase temperatures: 10℃, 20℃, 30℃, 40℃.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

35

Figure 14 Topography images of ELP LB films transferred on mica

substrates at 10℃ and different surface pressures: (A) 2mN

m

-1

, (B) 13mN m

-1

, (C) 25mN m

-1

.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

39

Figure 15 Root mean square(RMS) roughness(Rq) of ELP LB films

transferred on mica substrates at 10℃ and different surface

pressures: (A) 2mN m

-1

, (B) 13mN m

-1

, (C) 25mN m

-1

.

∙∙

40

Figure 16 Topography images of ELP LB films transferred on mica

substrates at 40℃ and different surface pressures: (A) 2mN

m

-1

, (B) 21mN m

-1

.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

41

Figure 17 Root mean square(RMS) roughness(Rq) of ELP LB films

transferred on mica substrates at 40℃ and different surface

pressures: (A) 2mN m

-1

, (B) 21mN m

-1

.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

42

(10)

Figure 18 Model depicting the conformational changes and inter-

molecular interaction of ELP for variable external conditions.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

45

Figure 19 Circular dichroism(CD) spectrum of ELP LB film transferred

on quartz substrates at 10℃ and 25mN m

-1

.

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙

47

(11)

제 1 장 서 론

자극 감응성 고분자(stimuli-responsive polymer)는 온도, pH, 빛, 전자기장 등의 다양한 자극에 반응하여 가역적, 비가역적으로 물리적, 화학적 성질이 변하는 기능성 고분자이다[1]. 온도 감응성 고분자 중 하나인 elastin-like polypeptide(ELP)는 엘라스틴 섬유의 기본적 단위인 트로포엘라스틴의 아미노산 서열을 기반으로 한 인공적인 생체 모방 고분자 물질이다. 유전자 재조합 기술로 합성된 ELP는 다른 합성 고분자에 비해 분자량의 조절이 용이하여 정확한 분자량을 가지며 좁은 온도 범위에서 안정적인 상전이(phase transition) 특성을 보인다. 또한, 생체에 거부 반응을 일으키지 않고(biocompatible) 생분해성(biodegradable)이 우수하여 단백질 정제 및 분리[2], 바이오센서[3], 약물 및 유전자 전달시스템[4, 5], 조직공학[6, 7] 등의 다양한 분야에 중요한 소재로 활용되고 있다. Langmuir-blodgett(LB) 방법은 양친매성 분자들을 기체-액체 계면상에 전개한 후, 물리적으로 압축하여 단분자막을 형성하고 고체 기판 위에 전사시켜 단층의 박막을 제조하는 기술로 잘 알려져 있다[8]. 광학적, 전기적, 생물학적 특성을 나타내는 양친매성 유∙무기 물질들을 이용하여 트랜지스터(transistor)[9], 바이오센서(biosensor)[10], 생체막(biomembrane)[11] 모델 등을 제작한 다양한 연구 사례가 다수 보고 되었다. 또한, LB 방법은 표면압력-면적 등온선(surface pressure-area(π-A) isotherm)을

(12)

측정하여 기체-액체 계면에 흡착된 양친매성 물질의 분자 거동을 분석하는 일반적인 방법이다[12]. 표면압력-면적 등온선의 형태를 통해 계면상에 형성된 단분자막의 상태(phase)와 구조 변화를 예측할 수 있다. 최근 자극 감응성 고분자가 다양한 의학 분야에 주로 응용되면서 인체 조직을 구성하는 바이오 계면에서의 분자 거동을 살펴보기 위해 LB 방법을 이용한 연구[13-15]가 수행되고 있으며 Poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAAm)[16-18]와 더불어 대표적인 온도 감응성 고분자인 ELP의 계면 거동에 대한 이해가 요구되고 있다. 용액 내에서와 계면에서의 분자 구조 및 분자 간 상호작용은 차이를 나타낼 수 있으므로 LB 방법을 이용한 계면에서의 분자 거동 연구는 중요하다. 본 연구에서는 LB 방법을 이용하여 다양한 온도 조건에서 물리적 압력에 따른 공기-물 계면에 흡착된 ELP 분자의 거동 변화를 살펴보고자 하였다. 표면압력-면적 등온선을 측정하였고 특정 조건하에서 계면에 형성된 단분자막을 mica 기판으로 전사하여 atomic force microscopy(AFM)으로 표면 구조를 측정하였다. 표면압력-면적 등온선의 형태와 단분자막의 표면 구조의 변화를 토대로 온도와 물리적 압력이 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조와 분자 간 상호작용에 미치는 영향을 분석하였다.

(13)

제 2 장 문헌 연구

2.1 Elastin-like polypeptide(ELP)의 특성

ELP는 엘라스틴 섬유의 기본적 단위인 트로포엘라스틴의 아미노산 서열을 기반으로 한 인공적인 생체 모방 고분자 물질이다. ELP는 ‘Val-Pro-Gly-Xaa-Gly’의 반복적인 아미노산 서열(Xaa는 Proline을 제외한 임의의 아미노산)을 가지며 유전자 재조합 기술(recursive directional ligation(RDL) method)을 이용하여 합성된다(Figure 1).

합성된 ELP는 좁은 온도 범위에서 안정적인 상전이 특성을 나타낸다. 상전이 특성은 온도에 의한 ELP 분자의 이차구조 변화와 관련 있다. 랜덤 코일(random coil)에서 베타-턴(β-turn)으로의 이차구조 변화는 ELP 분자의 소수성을 증가시킨다. 상전이 현상이 발생하는 특정 온도(phase transition temperature, Tt)를 중심으로, 특정 온도 이상에서 수용액 내 ELP는 소수성 상호작용에 의해 응집체(aggregation)를 형성하며 특정 온도 이하에서 ELP는 수용액 상에 잘 분산되어 있는 상태로 존재한다(Figure 2). 온도에 따른 흡광도의 변화를 측정하여 최대 흡광도의 50%에 해당하는 온도를 ELP 용액의 상전이 온도(Tt)로 정의한다. 상전이 온도는 ELP의 분자량, ELP 농도, 'Xaa'에 첨가되는 아미노산의 종류, 용액 안의 이온세기(ionic strength) 등에 의해 영향을 받게 된다[19].

(14)
(15)
(16)

2.2 Langmuir-blodgett(LB) 방법의 기본 이론 및

응용

2.2.1 LB 방법의 개념

LB 방법은 기체-액체 계면에 흡착된 양친매성(amphiphilic) 분자들을 물리적인 방법으로 압축하여 안정적인 단분자막(Langmuir film)을 형성하고 고체 기판 위에 전사시켜 단층의 초박막 (Langmuir-Blodgett film)을 제조하는 기술이다(Figure 3). 양친매성 분자는 친수성 부분과 소수성 부분으로 이루어진 분자를 말한다. 기체-액체 계면에서 양친매성 분자의 친수성 부분은 액체 방향으로 소수성 부분은 기체 방향으로 배열되며 계면에 흡착된 분자는 계면 장력을 낮추는 계면활성(surface activity) 특성을 나타낸다. LB 방법은 표면압력(surface pressure)을 측정하여 계면상에 형성된 단분자막의 상태를 분석한다. 표면압력은 기체-액체 계면에 흡착된 분자가 계면상에서 확산하려고 하여 생기는 2차원의 압력으로 순수한(pure) 액체의 표면장력(surface tension)과 분자들이 전개된 액체의 표면장력의 상대적인 차이로 측정된다. 일반적으로 Wilhelmy plate를 사용하여 수식(Wilhelmy equation) 을 통해 표면장력을 측정한다(Figure 4).

(17)
(18)
(19)

2.2.2 LB 방법을 이용한 계면에서의 분자 거동 연구

LB 방법을 이용하여 기체-액체 계면에 흡착된 양친매성 물질의 분자 거동을 분석하는 방법은 계면에 형성된 단분자막을 측정하는 직접적인 방법과 고체 기판 위에 전사시켜 단층의 초박막을 측정하는 간접적인 방법으로 나뉜다[23-26].

직접적인 방법은 interfacial shear rheometry, surface potential sensor, polarization modulation infrared reflection adsorption spectroscopy(PM-IRRAS), brewster angle microscopy(BAM) 등의 장비를 이용하여 계면에 형성된 단분자막의 상태와 물리∙ 화학적 특성을 실시간으로 확인할 수 있다.

간접적인 방법은 고체 기판 위에 전사된 단분자막을 atomic force microscopy(AFM), scanning electron microscope(SEM), transmission electron microscopy(TEM), ellipsometer, Circular dichroism(CD) spectroscopy, Fourier transform infrared spectroscopy(FT-IR)으로 측정하여 계면상에 형성된 단분자막의 표면 구조, 두께, 분자 구조 및 분자 간 상호작용을 간접적으로 분석한다. 계면에 흡착된 양친매성 물질의 분자 거동을 분석하기 위한 직∙간접적인 방법들 중 가장 일반적인 방법은 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm) 측정이다. 표면압력-면적 등온선은 바(barrier)를 움직여 분자들이 흡착된 계면의 면적을 감소시키는

(20)

과정(compression)에서 표면압력의 변화를 측정한 그래프이다. 표면압력-면적 등온선의 형태는 단분자막의 상태를 나타낸다.

일반적으로 단분자막의 상태는 표면압력-면적 등온선의 형태에 따라 gas phase, liquid phase, solid phase, collapse phase 네 가지 구간으로 나뉜다(Figure 5)[27]. Gas phase는 계면에 흡착된 분자들 사이의 거리가 분자 간 상호작용을 무시할 수 있을 정도로 충분히 넓어 표면압력이 천천히 증가하는 구간이다. Liquid phase는 분자들이 좁은 간격을 유지하며 활발한 분자 간 상호작용으로 단분자막을 형성하는 구간으로 표면압력의 증가율이 점차적으로 증가한다. Solid phase는 표면압력이 급격하게 증가하는 구간이다. 분자 간 간격이 거의 없을 정도로 분자들이 밀집되어 액체의 표면장력이 급격히 감소하며 분자가 일정한 방향으로 배열되어 결정 구조의 단분자막을 형성하기도 한다. 마지막으로 collapse phase는 표면압력이 급격하게 줄어드는 구간으로 단분자막이 더 이상의 물리적 압력을 견디지 못하고 겹쳐지면서 다분자막(multilayer film)을 형성하게 된다. 계면에 안정적으로 흡착된 분자들은 subphase로 사용되는 액체의 종류, pH, 온도 등 외부 조건에 따른 hydrophobic interaction, electrostatic repulsion, steric repulsion, chain entanglement 등의 분자 간 상호작용으로 다양한 형태의 단분자막 구조를 형성한다. 여러 종류의 소수성 사슬과 친수성 사슬로 이루어진 양친매성 이중 공중합체(diblock copolymer)를 이용하여 물리적 압력에 따라

(21)

다양한 형태의 단분자막 구조를 형성하려는 연구[28-32]가 보고되었으며 최근에는 계면에서의 자극 감응성 고분자의 분자 거동을 살펴보려는 연구가 수행되고 있다[33, 34].

(22)

Figure 5. Surface pressure – Area(π-A) isotherms: (a) gas phase, (b)

liquid phase, (c) solid phase, (d) collapse phase

(23)

제 3 장 재료 및 방법

3.1. Elastin-like polypeptide(ELP)의 제조 및 분석

3.1.1 ELP의 발현 및 정제

Recursive directional ligation(RDL) 유전자 재조합 방법으로 본 실험실에 구축되어 있는 [(VPGVG)14(VPGKG)]8[VPGVG]40 서열의 ELP 유전자가 삽입된 발현 벡터를 E.coli BLR(DE3)에 도입하여 ELP를 발현시켰다.

80μL ampicillin(50mg mL-1)을 포함하는 50mL CircleGrow medium(Q-biogene, USA)으로 구성된 배양액에 ELP 발현 유전자가 들어있는 E.coli BLR(DE3)세포를 접종하고 37℃, 150rpm의 교반배양기(shaking incubator)에서 12시간 1차 배양하였다. 1차 배양된 세포들은 2000rpm에서 2분간 원심 분리한 후 새로운 배양액을 첨가하여 resuspension 시켰다. 800μL ampicillin(50mg mL-1)을 포함하는 500mL CircleGrow medium으로 구성된 배양액에 2차 접종하여 37℃, 220rpm의 교반배양기에서 48시간 2차 배양하였다.

합성된 ELP는 inverse transition cycling(ITC) 방법으로 정제하였다(Figure 6). 이 방법은 온도변화에 의한 ELP의 상전이 특성을 이용하여 ELP를 분리 추출할 수 있다. 2차 배양된 세포들을 4℃, 4000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하고 mL

(24)

1X PBS(phosphate buffer silane, pH 7.4)을 첨가하여 resuspension 시켰다. 음파파쇄(sonication) 방법으로 세포들을 물리적으로 파괴시켰으며 방출된 내용물만을 분리하기 위하여 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상층액을 회수하였다. 여러 종류의 단백질과 DNA, RNA 등이 포함되어 있는 상층액에서 DNA와 RNA를 제거하기 위하여 1mL PEI(polyethyleneimine, 10%, X)를 첨가하였다. 중성 pH에서 양전하를 띠는 PEI와 음전하를 띠는 핵산은 강한 정전기적 인력으로 결합한다. 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 단백질만 포함되어 있는 상층액을 회수하였다. 여러 종류의 단백질 중 ELP만을 분리하기 위하여 ELP의 상전이 특성을 이용하였다. 단백질 용액에 NaCl을 첨가하고 용액의 온도를 40℃로 높여 ELP가 응집할 수 있도록 하였다. 40℃, 12,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 ELP를 제외한 다른 종류의 단백질과 일부 남아있을 수 있는 DNA와 RNA를 제거하였다. 4℃ 1X PBS을 첨가하여 침전된 ELP를 resuspension 하였으며, 위 과정을 여러 번 반복하여 높은 순도의 ELP를 얻었다.

(25)
(26)

3.1.2 ELP의 특성 평가

UV-vis spectrophotometer(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)를 이용하여 본 연구에서 사용된 ELP 수용액(1mg mL-1)의 대략적인 Tt를 측정하였다. 10℃에서 60℃까지 온도를 증가시키면서 350nm에서 ELP 수용액의 흡광도 변화를 측정하였다.

온도 자극에 의한 ELP의 상전이 현상은 ELP 분자의 이차구조 변화와 관련이 있으므로 Circular dichroism(CD) spectroscopy (Chirascan plus, Applied Photophysics, USA)를 이용하여 ELP

분자의 이차구조를 분석하였다. 10℃에서 40℃까지 온도를

증가시키면서 190nm~260nm의 파장(wavelength) 범위에서 흡광도를 측정하였다.

(27)

3.2 Langmuir-blodgett(LB) 방법을 이용한

Elastin-like polypeptide(ELP)의 계면 거동 분석

3.2.1 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm) 측정

100% 에탄올(ethanol)과 1차 탈이온수(deionized water, pH 6)로 세척한 LB trough에 1차 탈이온수를 넣어 공기-물 계면을 형성하였다. Platinum Wilhelmy plate를 공기-물 계면상에 위치시켜 표면압력을 측정하였다. 물의 온도를 10℃로 유지한 후, 40μL ELP 수용액(1mg mL-1)을 표면 상에 전개하였다. 공기-물 계면에 ELP 분자가 안정적으로 흡착할 수 있도록 5분간의 완화 시간(relaxation time) 이후 온도를 증가시켜 특정 온도(10℃, 20℃, 30℃, 40℃)로 유지하였다. 20분간 특정 온도를 유지한 후, 양쪽에 위치한 바(barrier)를 1mm min-1의 속도로 움직여 ELP 분자가 흡착된 계면의 면적을 감소시키면서 표면압력-면적 등온선을 측정하였다.

3.2.2 LB 방법을 이용한 ELP 단분자막 제조

일정한 표면압력으로 유지된 ELP 단분자막은 vertical dipping

method를 이용하여 공기-물 계면상에서 mica 기판 위로

전사되었다. 원하는 표면압력에 도달한 후, 표면압력을 유지하면서 1min min-1의 속도(dipping rate)로 mica 기판을 계면에서 수직방향으로 들어올렸다. Mica 기판 위로 전사된 ELP 단분자막은 물과 동일한 온도 조건하에서 건조되었다.

(28)

3.2.3 Atomic Force Microscopy(AFM)를 이용한 ELP

단분자막의 표면 구조 분석

Non-contact mode AFM(XE-100, Park system, Korea)을 이용하여 mica 기판 위로 전사된 ELP 단분자막의 표면 구조를 측정하였다. Probe는 PPP-NCHR(Force constant: 42N/m, Resonance frequency: 330kHz)를 사용하였으며 측정속도(scan rate)는 0.5Hz, 측정크기(scan size)는 500nm×500nm이었다. 각 시료마다 최소 세 곳의 위치를 무작위로 선정하여 측정함으로써 재현성(reproducibility)을 확인하였다. 얻어진 AFM 이미지는 XEI(Park system, Korea) 프로그램을 이용하여 이미지 처리(flatten) 및 표면 분석(RMS roughness)을 실시하였다.

(29)

제 4 장 결과 및 고찰

4.1 Elastin-like polypeptide(ELP)의 특성

4.1.1 ELP의 상전이(phase transition)

수용액 상에서 ELP는 온도 자극에 의한 상전이 특성을 보인다. 상전이 현상이 발생하는 특정 온도 이상에서 ELP는 소수성 상호작용으로 주변 분자들과 응집체를 형성하여 용액을 불투명하게 한다. 상전이 온도는 온도에 따른 ELP 용액의 흡광도 변화로 측정한다. Figure 7은 본 연구에 이용된 ELP 수용액(1mg mL-1)의 상전이 온도를 측정한 결과이다. UV-vis spectrophotometer를 이용하여 온도를 증가시키면서 350nm에서의 흡광도 변화를 관찰하였다. 40℃ 이상의 온도에서 흡광도의 변화가 나타났으며 45℃에서 급격히 증가하기 시작하여 55℃부터는 완만한 증가를 보였다. 따라서, ELP 수용액의 상전이 온도는 50℃로 추정할 수 있다.

4.1.2 ELP의 이차 구조(secondary structure)

ELP의 상전이 특성은 온도에 의한 ELP 분자의 이차구조 변화와 관련이 있다. Circular dichroism(CD) spectroscopy를 이용하여 온도에 따른 ELP 분자의 이차구조 변화를 측정하였다. 온도가

(30)

온도가 증가할수록 198nm의 peak은 감소하고 212nm의 peak은 증가하는 것을 확인하였다. 측정된 결과는 온도 증가에 의해 ELP 분자의 이차구조가 랜덤 코일(random coil)에서 베타-턴(β-turn)으로 변했다는 것을 의미한다. 또한, 40℃ 이하의 온도에서 이차구조 변화가 나타나는 것으로 보아 이차구조 변화가 상전이 현상과 관련이 있는 것으로 사료된다.

(31)

Figure 7. Turbidity of ELP solution(1mg mL

-1

) obtained by

(32)

Figure 8. Circular dichroism(CD) spectra of ELP solution(1mg

mL

-1

) as a function of temperatures.

(33)

4.2 Elastin-like polypeptide(ELP)의 계면 거동

4.2.1 ELP의 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm) 분석

LB 방법을 이용하여 다양한 온도 조건에서 물리적 압력에 따른 공기-물 계면에서의 ELP 분자 거동의 변화를 분석하고자 하였다. ELP 분자들이 흡착된 계면의 면적을 감소시키는 과정에서 측정된 표면압력-면적 등온선은 계면에 형성된 ELP 단분자막의 상태를

나타낸다. 일반적인 표면압력-면적 등온선은 형태에 따라

단분자막의 상태를 gas phase, liquid phase, solid phase, collapse phase 네 가지 구간으로 나눈다. 하지만, 모든 온도 조건에서 ELP의 표면압력-면적 등온선은 일반적인 표면압력-면적 등온선과 다른 형태를 보였다.

문헌을 토대로 ELP의 표면압력-면적 등온선 형태에 따른 ELP 단분자막의 상태는 expanded phase(gas phase), dense phase(liquid-solid phase), transition phase, collapse phase 네 가지로 구분해볼 수 있다(Figure 9). Expanded phase는 계면에 흡착된 ELP 분자들 사이의 거리가 분자 간 상호작용을 무시할 수 있을 정도로 충분히 넓어 표면압력이 천천히 증가하는 구간이다. Dense phase는 표면압력의 증가율이 증가하면서 표면압력이 급격하게 증가하는 구간으로 ELP 분자들이 좁은 간격을 유지하며 활발한 분자 간의 상호작용으로 단분자막을 형성한다. Transition phase는 표면압력이 급격하게 증가하지만 dense phase와 달리

(34)

표면압력의 증가율이 감소하는 구간이다. 일반적인 표면압력-면적 등온선에 나타나지 않는 독특한 형태이며 문헌에 따르면 압력에 의한 분자 구조의 변화 또는 단분자막 내 분자의 재배열로 인하여 나타난다고 한다. 마지막으로 collapse phase는 표면압력의 증가율이 급격하게 줄어드는 구간으로 계면에 안정적으로 흡착되어 단분자막을 형성한 ELP 분자들이 계면에서 탈착되어 부분적으로 단분자막이 겹쳐진 다분자막(multilayer film)을 형성하게 된다. 일반적으로 collapse phase는 표면압력이 급격하게 감소하는 구간이지만 ELP의 표면압력-면적 등온선에서 collapse phase는 표면압력 증가율만 급격하게 감소할 뿐 표면압력은 계속 증가하는 추세를 보인다. 이는 계면에 흡착된 ELP 분자들과 탈착된 분자들 사이에 상호작용이 강하게 형성되어 있다고 예측해 볼 수 있다. 또한, 실험적으로 얻어진 표면압력-면적 등온선 결과들을 토대로 제시된 수식을 이용하여 물리적 압력에 따른 ELP 단분자막의 상태를 추가적으로 살펴보았다(Figure 10).

Young

smodulus (K) = C

= −A

π

Young

smodulus ( K) = C

≅ −

π

− π

ln

− ln

Compressibility(C)는 압축에 의해 물질의 부피가 변화하기 쉬운 정도를 나타내는 수치이며, π는 표면압력, A는 면적을 의미한다. 식을 통해 얻어진 Young’s modulus 값은 단분자막의

(35)

강도(stiffness)를 나타내는 수치이다. Young’s modulus 최대값은 가장 단단한 구조의 단분자막이 형성되었다는 것을 나타내며 이차함수 형태의 추세선을 이용하여 최대값(변곡점)을 예측하였다. 최대값을 나타내는 표면압력을 중심으로 ELP 단분자막은 Young’s modulus 값이 증가하는 dense phase와 감소하는 transition phase로 구분되며 온도 조건에 따라 다른 구조를 보일 것으로 사료된다.

(36)

Figure 9. Compression surface pressure-area(π-A) isotherm for

ELP as a function of temperatures.

(37)

Figure 10. Young’s modulus obtained from compression surface

pressure-area(π-A) isotherm for ELP as a function of temperatures.

(38)

4.2.2 온도에 따른 표면압력-면적 등온선(π-A isotherm)의

변화

수용액 상에서 ELP는 온도 자극에 의한 상전이 특성을 보인다. 상전이 현상은 ELP의 이차구조 변화에 의한 분자 간 소수성 상호작용의 증가로 발생한다. 수용액 내에서와 마찬가지로 공기-물 계면에 흡착된 ELP 분자도 온도에 의한 영향을 받을 것으로 예상하였다. 따라서, LB 방법을 이용하여 공기-물 계면에 흡착된 ELP의 분자 구조 및 분자 간 상호작용에 온도가 미치는 영향을 살펴보았다. ELP 수용액의 상전이 온도와 ELP 분자의 이차구조 변화 온도를 고려하여, ELP 분자가 독립적인 개체로 계면에 흡착될 수 있는 온도 조건(10℃, 20℃, 30℃, 40℃)에서 표면압력-면적 등온선을 측정하였다. 물의 온도가 증가할수록 표면압력의 증가가 넓은 면적에서 나타났다. 온도에 의한 표면압력-면적 등온선의 전반적인 이동은 표면압력-면적 등온선 위의 두 점(y=10mN m-1, y=15mN m-1 )을 지나는 직선 그래프의 x절편(y=0) 값으로 비교하였으며 이 값을 ELP가 존재하기 위해 필요한 최소면적(limiting interfacial area)으로 정의하였다. Figure 11은 계면에 흡착된 ELP 분자의 수가 동일하다고 가정하였을 때 온도가 증가함에 따라 ELP 분자가 계면상에 차지하는 면적이 증가했다는 것을 의미한다.

10℃에서 랜덤 코일 구조를 가질 것으로 예상되는 ELP는 베타-턴 구조 보다 유연하여 빽빽한 구조의 단분자막을 형성할 수 있으며

(39)

물리적 압력에 의해 lysine을 포함한 친수성 사슬이 가라앉았을 가능성이 있어 40℃ 보다 ELP 분자가 계면상에 차지하는 면적이 작은 것으로 생각해 볼 수 있다. 반면에, 40℃에서 표면에 흡착된 ELP는 랜덤 코일 구조보다 단단한 베타-턴 구조를 가질 것으로 예상되며 이차구조 변화에 의한 소수성의 증가로 ELP 분자는 계면에 강하게 고정되고 ELP 분자 간 상호작용으로 독특한 형태의 단분자막 구조를 형성하여 10℃ 보다 ELP 분자가 계면상에 차지하는 면적이 큰 것으로 추측해 볼 수 있다.

또한, 온도 변화는 dense phase와 transition phase에서의

표면압력 증가율에도 영향을 미친다. 표면압력의 증가율은

표면압력-면적 등온선 위의 두 점(y=10mN m-1, y=15mN m-1)을 지나는 직선 그래프의 기울기로 측정하였으며 온도가 증가할수록 표면압력의 변화폭이 감소하였다. Expanded phase에서 dense phase로 변하는 표면압력에서 형성된 단분자막의 구조가 표면압력 증가율에 영향을 주었을 것으로 생각된다.

(40)

Figure 11. Variation of limiting interfacial area and gradient of

compression surface pressure-area(π-A) isotherm for temperature.

(41)

4.3 Elastin-like polypeptide(ELP) 단분자막의 표면

구조 분석

4.3.1 온도에 따른 ELP 단분자막의 표면 구조 변화

온도에 의한 표면압력-면적 등온선의 전반적인 이동은 ELP 분자의 이차구조 변화에 따른 단분자막의 표면 구조와 관련이 있을 것으로 가정하였다. 온도에 따른 ELP 단분자막의 표면 구조 변화를 확인하기 위하여 expanded phase에서 dense phase로 변하는 표면압력(2mN m-1)에서 형성된 단분자막을 mica 기판 위로 전사하였으며 AFM을 이용하여 표면 구조를 측정하였다(Figure 12).

10℃에서 전사된 ELP 단분자막은 전체적으로 평평한 표면 구조에 불균일한 구멍들이 존재하였다(Figure 12A). 랜덤 코일 구조를 갖는 ELP는 유연하고 electrostatic repulsion, steric repulsion, chain entanglement과 같은 분자 간 상호작용 특성을 나타내어 계면을 전체적으로 덮으며 양전하를 띄고 있는 lysine 잔기를 포함한 친수성 사슬이 친수성이고 음전하를 띄고 있는 mica 기판의 표면에 강한 흡착력을 보여 평평한 구조를 보였을 것으로 사료된다. 또한, 불균일한 구멍들은 단분자막을 형성한 분자들 사이에 생긴 빈 공간으로 ELP 사슬과의 수소결합으로 존재하였던 물 분자가 건조과정에서 기화되면서 생성된 것으로 생각된다. 20℃에서 전사된 ELP 단분자막은 온도에 의해 베타-턴 구조로 변한 소수성 사슬이 주변 소수성 사슬과의 소수성 상호작용으로

(42)

집합체(domain)를 형성하려는 형태를 보였다(Figure 12B). 30℃에서 전사된 ELP 단분자막은 불균일한 라멜라(lamellar) 구조를 형성하였다(Figure 12C). AFM 이미지에서 나타난 밝은 부분(높은 지형)은 베타-턴 구조로 변한 ELP 소수성 사슬 간 소수성 상호작용으로 형성된 집합체이며 밝은 부분을 감싸고 있는 형태의 어두운 부분(낮은 지형)은 소수성 사슬과 분리된 랜덤 코일구조의 친수성 사슬일 것으로 추정된다. 양전하를 띄고 있는 lysine 잔기를 포함한 친수성 사슬은 친수성이고 음전하를 띄고 있는 mica 기판의 표면에 강한 흡착력을 보여 소수성 집합체 보다 낮은 지형을 형성하였을 것으로 생각된다. 40℃에서 전사된 ELP 단분자막은 30℃에서 형성되었던 불균일한 라멜라 구조와 비슷한 구조를 유지하고 있지만 친수성 사슬의 이차구조 변화가 표면 조도(roughness)의 급격한 증가에 영향을 준 것으로 판단된다(Figure 12D and Figure 13). 이전 온도에서는 소수성 사슬과 친수성 사슬이 분리되어 같은 평면상에 존재했지만 40℃에서는 소수성 사슬과 친수성 사슬 모두 이차구조의 변화가 일어났고 소수성 사슬은 공기 방향으로 친수성 사슬은 물 방향으로 배열되어 표면조도가 증가하였을 것이다. 30℃에서 소수성 사슬의 집합체 주위로 형성되었던 친수성 사슬의 위치가 변했음에도 불구하고 양전하를 띤 lysine 잔기의 electrostatic repulsion으로 인하여 30℃와 비슷한 불균일한 라멜라 구조를 유지하는 것으로 생각된다.

(43)

온도에 따른 ELP 단분자막의 구조 변화를 확인하고 ELP 분자의 이차구조 및 ELP 분자 간 상호작용을 분석하여 온도에 의한 표면압력-면적 등온선의 전반적인 이동이 이차구조 변화와 관련이 있다는 것을 증명하였으며 30℃와 40℃에서 형성된 독특한 라멜라 구조로 ELP 분자가 소수성 사슬과 친수성 사슬로 이루어진 이중 공중합체의 특성을 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

(44)

Figure 12. Topography images of ELP LB films transferred on

mica substrates at 2mN m

-1

and different subphase temperatures:

(A) 10℃, (B) 20℃, (C) 30℃, (D) 40℃.

(45)

Figure 13. Root mean square(RMS) roughness(Rq) of ELP LB

films transferred on mica substrates at 2mN m

-1

and different

subphase temperatures: 10℃, 20℃, 30℃, 40℃.

(46)

4.3.2 특정 온도 조건하에서 물리적 압력에 따른 ELP

단분자막의 표면 구조 변화

ELP의 표면압력-면적 등온선은 모든 온도 조건에서 일반적인 표면압력-면적 등온선과 다른 형태를 보였으며 단분자막의 강도를 나타내는 Young’s modulus 값을 통해 물리적 압력에 따라 다른 구조의 ELP 단분자막이 형성되었을 것으로 예상하였다. 또한, transition phase에서 ELP 분자의 이차구조 변화 또는 재배열이 표면압력 증가율의 감소에 영향을 미쳤을 것으로 추측하였다. 표면압력-면적 등온선과 Young’s modulus 결과를 토대로 특정 온도 및 표면압력 조건하에서 ELP 단분자막의 표면 구조 변화를 확인하여 물리적 압력에 따른 계면에서의 ELP 분자 거동을 분석하였다. ELP는 좁은 온도 범위에서 안정적인 상전이 특성을 나타내며 Tt는 ELP의 분자량, ELP 농도, 'Xaa'에 첨가되는 아미노산의 종류, 용액 안의 이온세기 등에 의해 영향을 받게 된다. 물리적 압력에 의한 계면 면적의 감소는 ELP 농도의 증가와 같은 효과를 나타낼 수 있으며 ELP 농도가 증가할수록 상전이 온도가 감소하여 ELP의 이차구조 변화를 일으킬 것이라 가정할 수 있다. 10℃에서 랜덤 코일 구조를 갖는 ELP는 2mN m-1에서 불균일한 구멍들이 존재하지만 전체적으로 평평한 표면 구조의 단분자막을 형성하였다(Figure 14A). Young’s modulus 최대값을 나타내는 표면압력(13mN m-1)에서 형성된 ELP 단분자막은 2mN m-1에서의

(47)

표면 구조보다 균일한 구조를 나타내었다(Figure 14B). 계면상에서 ELP는 분자들 사이의 빈 공간이 없는 최대한 밀집된 분포로 존재하며 단단한 단분자막을 형성하였을 것이다. 25mN m-1에서 형성된 ELP 단분자막의 구조는 transition phase에서의 이차구조

변화를 보여준다. 전체적으로 균일한 구조를 보였던 낮은 표면압력(2mN m-1, 13mN m-1)에서의 단분자막과 달리 표면 조도가 증가하고 불균일한 집합체가 형성되었다(Figure 14C and Figure 15). 최대한 밀집된 분포에서 이차구조의 변화가 일어났기 때문에 불균일한 라멜라 구조가 형성되지 못했지만, 불균일한 집합체를 형성하는 분자 간 상호작용으로 보아 물리적 압력(ELP 농도)에 의한 이차구조 변화가 일어났을 것으로 사료되며 집합체를 형성하는 과정에서 분자들 사이에 생성된 빈 공간이 transition phase에서 나타나는 표면압력 증가율의 감소에 영향을 미쳤을 것으로 추측된다. 또한, 베타-턴 구조의 집합체는 랜덤 코일 구조보다 단단하며 소수성의 증가로 계면에 강하게 고정되기 때문에 표면압력 증가율은 감소하지만 표면압력은 증가하는 것으로 생각된다. 40℃에서 ELP 분자는 소수성 사슬과 친수성 사슬 모두 이차구조 변화가 일어나 집합체를 형성함으로 transition phase에서 ELP 분자의 재배열이 표면압력 증가율의 감소에 영향을 미쳤을 것으로 가정하였다. 21mN m-1에서 ELP 단분자막은 집합체 간 소수성 상호작용으로 집합체의 크기와 표면 조도가 증가하고 2mN m-1에서

(48)

형성된 불균일한 라멜라 구조가 변형된 것을 확인하였다(Figure 16 and Figure 17).

특정 온도 및 표면압력 조건에 따른 ELP 단분자막의 구조 변화를 확인하고 ELP 분자의 이차구조 및 ELP 분자 간 상호작용을 분석하여 transition phase에서 ELP 분자의 이차구조 변화 또는 재배열에 의해 표면압력 증가율이 감소한다는 것을 증명하였다. 또한, Young’s modulus 최대값을 나타내는 표면압력에서 ELP는 단단한 구조의 단분자막을 형성한다는 것을 확인하였다.

(49)

Figure 14. Topography images of ELP LB films transferred on

mica substrates at 10℃ and different surface pressures: (A) 2mN

m

-1

, (B) 13mN m

-1

, (C) 25mN m

-1

.

(50)

Figure 15. Root mean square(RMS) roughness(Rq) of ELP LB

films transferred on mica substrates at 10℃ and different surface

pressures: (A) 2mN m

-1

, (B) 13mN m

-1

, (C) 25mN m

-1

.

(51)

Figure 16. Topography images of ELP LB films transferred on

mica substrates at 40℃ and different surface pressures: (A) 2mN

m

-1

, (B) 21mN m

-1

.

(52)

Figure 17. Root mean square(RMS) roughness(Rq) of ELP LB

films transferred on mica substrates at 40℃ and different surface

pressures: (A) 2mN m

-1

, (B) 21mN m

-1

.

(53)

4.4 온도와 물리적 압력에 따른 계면에서의 ELP 분자

구조와 분자 간 상호작용에 대한 도식화

표면압력-면적 등온선의 형태와 단분자막의 표면 구조의 변화를 토대로 온도와 물리적 압력에 따른 계면에서의 ELP 분자 구조와 분자 간 상호작용을 도식화하였다(Figure 18). 온도의 증가는 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조에 영향을 미쳤다. 일정 온도 이상에서 ELP 소수성 사슬이 먼저 베타-턴 구조를 형성하여 ELP가 계면상에 강하게 고정되고 소수성 사슬 간 소수성 상호작용에 의해 집합체를 이루어 소수성 사슬과 친수성 사슬이 동일 평면상에 분리된 상태로 존재하게 된다. 이러한 ELP 분자의 이차구조 변화는 계면상에 불균일한 라멜라 구조의 ELP 단분자막을 형성한다. 또한, ELP 친수성 사슬이 베타-턴 구조를 형성하는 온도에 도달할 경우, 소수성 사슬은 강한 소수성에 의해 공기 방향으로 배열되며 양전하를 띤 lysine 잔기를 포함한 친수성 사슬은 물과의 상호작용(hydration)에 의해 물 방향으로 배열된다. 소수성 사슬과 친수성 사슬의 배열 변화로 표면 조도가 증가하며 친수성 사슬 간 전하 반발력으로 인하여 불균일한 라멜라 구조를 형성하는 것으로 사료된다. 특정 온도에서 물리적 압력에 의한 계면 면적의 감소는 ELP 분자의 농도를 증가시킨다. ELP 농도의 증가는 ELP 분자의 이차구조 변화와 관련이 있으며 온도의 증가로 인한 이차구조

(54)

변화와 동일한 현상을 보인다. 마찬가지로 계면에서 ELP는 온도에 따른 분자 배열과 비슷한 구조를 형성한다. 하지만, 최대한 밀집된 분포에서 이차구조의 변화가 일어나기 때문에 불균일한 라멜라 구조를 나타내지는 않지만 불균일한 집합체를 형성한다. 또한, 이차구조 변화 온도 이상에서 물리적 압력은 ELP 분자의 재배열에 영향을 준다.

(55)

Figure 18. Model depicting the conformational changes and

(56)

4.5

계면에서의

elastin-like

polypeptide(ELP)

이차구조

앞서 언급한 연구 결과는 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조가 용액 내에서와 마찬가지로 온도에 따라 랜덤 코일에서 베타-턴으로 변할 것이라는 가정하에 특정 조건에서 형성된 ELP 단분자막의 표면 구조 및 분자 간 상호작용을 분석하였다. 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조를 직접적으로 측정할 수 없었기 때문에, 용액 내에서와 계면에서의 분자 구조가 차이를 보일 수 있음에도 불구하고 ELP 분자의 이차구조 변화를 연계하여 서술하였다는 점은 본 연구의 한계점으로 볼 수 있다. 하지만, 본 연구는 문헌을 토대로 CD spectroscopy를 이용하여 quartz 기판 위로 전사한 ELP 분자의 이차구조를 측정함으로써 간접적으로나마 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조 변화를 분석할 수 있다는 가능성을 제시하고자 하였다. 비록 ELP 단분자막을 전사한 모든 조건에서는 단분자막의 두께가 너무 얇아 유의적인 CD 스펙트럼(spectrum) 결과를 얻는 것이 불가능 하였으나, 단분자막을 적층하여 다분자막 형태로 측정한 경우에는 일부 조건에 있어 유의미한 결과를 확인할 수 있었다(Figure 19). 용액 내에서 측정된 CD 스펙트럼과 다른 형태를 나타내는 것으로 보아 추후 연구에서 온도와 물리적 압력에 의한 ELP 분자의 이차구조 변화를 고찰함에 있어 물과의 상호작용을 배제한 측정 조건 및 다분자막 구조의 영향을 고려해야 할 것으로 사료된다.

(57)

Figure 19. Circular dichroism(CD) spectrum of ELP LB film

transferred on quartz substrates at 10℃ and 25mN m

-1

.

(58)

제 5 장 결 론

다양한 온도 조건에서 물리적 압력에 따른 공기-물 계면에서의 elastin-like polypeptide(ELP) 분자 거동의 변화를 살펴보기 위하여 본 연구에서는 Langmuir-Blodgett(LB) 방법을 이용하였다. 표면 압력-면적 등온선(π-A isotherm)과 특정 조건 하에서 형성된 단분자막의 표면 구조의 변화를 토대로 온도와 물리적 압력이 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조와 분자 간 상호작용에 미치는 영향을 확인하였다.

표면압력-면적 등온선 형태에 따라 expanded phase(gas phase), dense phase(liquid-solid phase), transition phase, collapse phase 네 가지 구간으로 단분자막 상태를 구분하였으며 모든 조건에서 단분자막이 형성된 것으로 보아 ELP 분자가 계면에 안정적으로 흡착된다는 것을 확인하였다. 온도에 따른 표면압력-면적 등온선의 이동과 단분자막의 표면 구조의 변화를 토대로 계면에 흡착된 ELP 분자의 이차구조 및 분자 간 상호작용의 변화를 분석하였다. 이차구조 변화에 의한 소수성의 증가는 ELP 분자를 계면에 강하게 고정시키며 분자 간 소수성 상호작용으로 단단한 형태의 단분자막 구조를 형성하였다. 또한, 30℃에서 형성된 불균일한 라멜라 구조는 ELP 분자가 소수성 사슬과 친수성 사슬로 이루어진 이중 공중합체(diblock

(59)

copolymer)의 특성을 나타낸다는 것을 증명하였다. 특정 온도 및 표면압력 조건에서 형성된 ELP 단분자막의 표면 구조와 물리적 특성(Young’s modulus)을 분석하여 온도에 따라 물리적 압력이 ELP 분자의 이차구조 및 분자 간 상호작용에 미치는 영향이 다르다는 것을 증명하였다. 10℃, transition phase에서 표면압력 증가율의 감소는 ELP 분자의 이차구조 변화와 관련이 있으며 40℃, transition phase에서 표면압력 증가율의 감소는 ELP 분자의 재배열과 관련 있다는 것을 확인하였다.

(60)

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Abstract

Interfacial Behavior of Thermosensitive

Elastin-like Polypeptide

Using Langmuir-Blodgett Technique

Seong Min Ahn

Department of Biosystems & Biomaterial Science and Engineering

The Graduate School

Seoul National University

Herein, we investigated the air-water interfacial behavior of

elastin-like polypeptide(ELP), an artificial biopolymer based on VPGXG(X

is any amino acid except Proline) pentapeptide repeats, in accordance

with temperature. The compression surface pressure-area isotherm

was obtained and the deposition onto mica substrates was performed

under variable external conditions using Langmuir-Blodgett

technique. The morphology of the ELP monolayer was subsequently

imaged using atomic force microscopy. ELP monolayers could be

prepared with high stability at the air-water interface. The

conformational changes and intermolecular interactions of ELP could

be assumed as a function of temperature and surface pressure through

the research.

(68)

Keyword: Elastin-like polypeptide(ELP), Langmuir-Blodgett(LB)

technique, Surface pressure-area(π-A) isotherm, Interfacial

behavior

참조

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