서
론
방사선 치료는 고 에너지 방사선에 의해 암세포가 사 멸되는 의료기술로서 체외에서 방사선을 조사하는 체외 방사선 치료와 암 조직 가까이에서 동위원소를 이용하여 치료하는 국소 방사선 치료의 두 가지 치료방법이 있다. 하지만 이러한 방사선 치료에 따르는 부작용이 다수 보 고되고 있고 (Mul et al. 2007; Mihalcea and Arnold 2008) 그 중 가장 문제되는 것이 염증성 부작용이다 (송 등 2001; 이 등 2002). 구내염의 경우 방사선이나 항암제 치 료 후 가장 흔히 나타나는 부작용이고 직장암의 경우 방 사선 치료 후 방광에 염증이 남아 있을 수도 있다. 이러 한 염증성 부작용은 암환자의 대부분에서 암 치료가 끝 난 이후에도 오랜 기간 문제를 일으키기도 한다. 따라서 방사선에 의해 유발되는 염증반응을 줄일 수 있다면 방 사선 치료로 인해 생겨나는 부작용을 상당부분 완화할 수 있을 것으로 판단된다. 실제로 염증 억제와 관련된 당 뇨 치료제인 ‘EGF’를 이용하여 동물실험에서 방사선에 의해 유발되는 구내염이 상당부분 감소하였음이 보고되 었다 (Lee et al. 2007).Monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)은 키모카인의
─ ─ 227 ──
RAW264.7
대식세포에서 방사선에 의한
MCP-1
발현 기작 연구
진창현∙박용대∙최대성∙정일윤* 한국원자력연구원 정읍방사선과학연구소
Study on the Mechanism of Radiation-induced MCP-1
Expression in RAW264.7 Macrophage Cells
Chang Hyun Jin, Yong Dae Park, Dae Seong Choi and Il Yun Jeong* Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute,
Jeongeup 580-185, Korea
Abstract-- The purpose of this study was to investigate the expression mechanism of MCP-1 in gamma-irradiated RAW 264.7 macrophage cells. MCP-1 plays an important role in attracting monocyte to injured site at the early inflammation stage. However the production mechanism of MCP-1 by gamma-irradiation in RAW 264.7 macrophage cells was almost undiscovered. We found that MCP-1 was produced in RAW 264.7 macrophage cells by irradiation with 5 Gy. And these inceases were attenuated by specific inhibitors treatment, such as NF-κκB, JNK, ERK, JAK2, and Pyk2. These results indicate that radiation-induced MCP-1 production is mediated by MyD88- and TRIF-dependent pathways in RAW 264.7 macrophage cells. Furthermore, gamma-irradiation induced heme oxygenase-1 (HO-1) expression in RAW 264.7 macrophage cells. However this induction level was reduced before MCP-1 and IFN-ββ production.
Key words : Monocyte chemotactic protein-1, Radiation, Pyk2, HO-1
* Corresponding authors: Il Yun Jeong, Tel. +82-63-570-3150, Fax. +82-63-570-3159, E-mail. [email protected]
일종으로 염증반응 초기에 monocyte와 같은 염증 세포 가 염증 부위에 모일 수 있도록 하는 역할을 담당하고 있다. MCP-1에 의해 모인 monocyte는 대식세포로 분화 하여 염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-6, IFNs 등)을 분비하 여 염증반응을 심화시킨다. 따라서 초기 염증반응에서 MCP-1의 역할은 매우 중요하다. RAW264.7 대식세포에 서 감마선에 의한 MCP-1 발현 여부에 관해서는 현재까 지 보고된 바 없다.
Proline-rich kinase-2 (Pyk2)는 다양한 자극에 의해 발현 되며 세포 이동, 증식 및 생존을 조절하는 수용체들과 결 합하여 다양한 작용에 관여한다 (Liu et al. 1997; Avraham et al. 2000). Pyk2의 타이로신 인산화가 염증반응 진행과 매우 밀접한 관계를 보인다는 연구가 보고된 바 있고 (Liu et al. 1997; Anand et al. 2008) lipopolysaccharide (LPS)에 의해 MCP-1이 생성되는 과정에 Pyk2 인산화가 중요한 역할을 담당하고 있다는 연구결과가 보고된 바 있다 (Anand et al. 2009).
Heme oxygenase-1 (HO-1)는 다양한 외부 자극에 의해 발현되어 heme을 분해하여 일산화탄소, 철, 그리고 빌리 베르딘을 생성하여 항산화와 항염증과 같은 효능을 나 타내는 효소이다 (Maines 1998; Yamada et al. 2000). 본 연구팀에서도 RAW264.7 대식세포에서 LPS에 의한 염 증반응을 억제하는 데 있어서 HO-1이 중요한 역할을 하 고 있음을 보고한 바 있다 (Jin 2010). 이에 본 연구에서는 감마선 조사에 의해서 염증세포의 일종인 RAW264.7 대식세포에서 MCP-1이 발현되는지 여부와 Pyk2를 포함하여 신호전달에 관여하고 있는 다 양한 단백질의 억제제를 통해 발현 기작을 밝히고자 하 였다.
재료 및 방법
1. 세포배양과 감마선 조사RAW264.7 대식세포는 10% fetal bovine serum (FBS), 페니실린 (100 U ml-1)과 스트렙토마이신 (100μg ml-1)이
포함되어 있는 DMEM 배지에서 37�C, 5% CO2조건으로
배양하였다. 감마선 조사는 한국원자력연구원 방사선과 학연구소 (Jeongeup, Republic of Korea) 내 Gammacell 40 exactor (Cs-137)을 사용하여 흡수선량이 1, 5 Gy가 되도 록 조사하였다.
2. ELISA를 이용한MCP-1과 IFN-ββ측정
MCP-1과 IFN-β 발현양을 측정하기 위해서 RAW264.7
대식세포를 2×105cell ml-1농도로 6-well plate에 24시 간 배양한 뒤 감마선을 조사하였다. 감마선 조사 후 CO2 배양기에서 추가 배양한 뒤 시간에 따라 배양 상등액을 포집하였다. 배양 상등액에 존재하는 MCP-1과 IFN-β 양 은 ELISA Kit (R & D systems)를 사용하여 제조사에서 권장하는 실험방법에 따라서 측정하였다.
3. Quantitative real-time PCR 수행
RAW264.7 대식세포를 2×105cell ml-1농도로 6-well
plate에 24시간 배양한 뒤 감마선을 조사하였다. 감마선
조사 후 CO2배양기에서 추가 배양한 뒤 시간에 따라
세포를 포집하였다. 포집된 세포로부터 전체 RNA는 RNeasy Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 분리하였다. 분리된 전체 RNA로부터 Advantage RT-for-PCR kit (Clontech, Mountainview, CA, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였고 Chromo4 real-time PCR 장비 (Bio-Rad)와 iTaq SYBRRGreen Supermix (Bio-Rad)를 사용하 여 Real-time PCR을 수행하였다. HO-1과β-actin의 PCR 은 45 cycles (94�C for 20 s, 60�C for 20 s and 72�C for 30 s) 조건으로 수행하였으며 이때 사용한 Primer는 바이오니 아에서 합성하였으며 염기서열은 다음과 같다. HO-1, for-ward primer 5′-TTACCTTCCCGAACATCGAC-3′, reverse primer 5′-GCATAAATTCCCACTGCCAC-3′; β-actin, for-ward primer 5′-TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′, reverse primer 5′-GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC-3′. 증폭된 PCR 산물의 특이성은 melting curve 분석을 통해 확인하였으며 β-actin의 발현양을 기준으로 HO-1의 발 현양을 측정하였다.
결과 및 논의
1. 감마선 조사가 RAW264.7 대식세포에서 MCP-1 발현에 미치는 영향 감마선 조사로 인해 다양한 세포에서 염증반응이 유발 된다는 것은 보고된 바 있지만 (Lutgendorf 2009; Mihaes-cu et al. 2010) 그 과정에 있어서 MCP-1이 관여하고 있 는지에 대해서는 보고된 바 없다. 이에 본 연구에서는 대표적인 염증세포의 하나인 RAW264.7 대식세포를 이 용하여 감마선 조사를 통해 염증반응이 유발되는지 여 부와 그 과정에서 MCP-1이 발현되는지 여부를 판단하 고자 하였다. RAW264.7 대식세포에 0, 1, 5 Gy 감마선을 조사하였을 경우 24시간이 지나면 MCP-1발현양이 감마 선의 선량에 비례해서 증가하는 것을 확인하였다 (Fig.1). 따라서 RAW264.7 대식세포에서 감마선에 의해 유발 된 염증반응에 MCP-1이 관여하고 있음을 알 수 있다. RAW264.7 대식세포에 LPS 자극을 주었을 경우 MCP-1 은 4시간 이후면 발현되기 시작하였지만 (Jin et al. 2010) 감마선의 경우 그보다 훨씬 늦은 24시간 이후에 발현되 는 차이를 보였다. 2. 감마선에 유도된 MCP-1 발현에 신호전달 억제제의 영향 감마선에 의해 염증반응이 유발되고 그 기작에 관한 연구가 보고되었다 (Mihaescu et al. 2010). 앞선 결과에서 RAW264.7 대식세포가 감마선 자극에 의해 MCP-1을 발 현하는 것을 확인하였기 때문에 이에 대한 기작에 관해 알아보고자 하였다. MCP-1이 발현되는 기작에 있어서 Pyk2 인산화가 p38과 NF-κB를 활성화시킨다는 보고가
있었다 (Anand et al. 2009). 이에 본 연구에서는 Pyk2를 포함하여 염증반응에 관여하고 있는 다양한 신호전달 단백질의 특정 억제제를 이용하여 MCP-1 발현 기작에 관해 간접적으로 유추해보고자 하였다. 염증반응의 경우 외부 자극에 의해 Toll-like receptor-4 (TLR4)가 활성화 되면 MyD88과 TRIF가 관여하는 두 가지 경로가 활성 화되고 이후 단계별로 신호 전달이 이루어진다. 본 연구 에서는 TRIF가 관여하여 활성화되는 경로 중 JAK2를 억제하기 위해 AG490을 사용하였고 MyD88 경로에서는 ERK, p38, JNK, NF-κB와 Pyk2를 억제하기 위해 각각 PD98059, SB203580, SP600125, TPCK와 AG17를 사용 하였다. 그 결과 p38 억제제인 SB203580을 처리하였을 경우만 제외하고 모든 억제제에서 감마선에 의한 MCP-1 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 따라서 RAW264.7 대식세포에서 감마선에 의해 MCP-1이 발현 되는 기작은 TRIF와 MyD88 경로 모두 관여하고 있으 며 MAPK중 유일하게 p38 단백질만이 관여하지 않고 있음을 확인하였다. 3. 감마선 조사가RAW264.7 대식세포에서 IFN-ββ발현에 미치는 영향
IFN-β의 경우 RAW264.7 대식세포에서 TRIF 수용체
경로를 통해 생성되게 된다. 감마선에 의한 MCP-1 생성 에 TRIF 경로가 관여하고 있음을 IFN-β 생성 측정을 통 해 확인해보고자 하였다. 그 결과 RAW264.7 대식세포 에 5 Gy를 조사하였을 경우 Fig. 3에 나타낸 바와 같이 0 0 1 4 8 24 50 100 150 200 250 300 350 0 Gy 1 Gy 5 Gy MCP-1 (pg ml -1) Time (h)
Fig. 1. Effects of gamma irradiation on MCP-1 production in
RAW-264.7 macrophage cells. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Inhibitor PD A AG SP SB TP 5 Gy -MCP-1 (pg ml -1)
Fig. 2. Effects of several inhibitors on MCP-1 production induced
by gamma irradiation in RAW264.7 macrophage cells. (PD: PD98059, A: AG17, AG: AG490, SP: SP600125, SB: SB203580, TP: TPCK). PD: 40μM, A: 10 μM, AG: 20 μM, SP: 50μM, SB: 10 μM, TP: 50 μM. Inhibitors were treated for 1 h prior to irradiation.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 IFN-β (pg ml -1) 0 4 8 12 24 Time (h)
Fig. 3. Effects of gamma irradiation (5 Gy) on IFN-β production in
MCP-1과 마찬가지로 24시간 이후 발현이 증가하고 있 음을 확인하였다. 4. 감마선 조사가 RAW264.7 대식세포에서 HO-1 발현에 미치는 영향 앞서 언급한 바와 같이 RAW264.7 대식세포에서 MCP-1이 발현되는 시간이 LPS보다 감마선을 조사하였을 경 우 훨씬 늦은 것을 알 수 있었다. 따라서 그 원인을 알아 보고자 감마선에 의한 HO-1 발현양을 알아보고자 하였 다. HO-1의 경우 외부자극이 주어졌을 경우 초기에 세포 를 보호하기 위해 만들어지는 효소의 일종이다 (Maines 1998; Yamada et al. 2000). Fig. 4에서 보듯이 RAW264.7 대식세포에 5 Gy를 조사하였을 경우 12시간까지 일정 수준으로 HO-1 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있지 만 24시간 이후에는 조사 이전 수준까지 떨어지는 것을 알 수 있었다. 따라서 RAW264.7 대식세포에 5 Gy를 조 사하였을 경우 초기에는 HO-1과 같은 항산화 단백질 발 현을 통해 방어기작을 작동시키지만 24시간 후부터는 항산화 방어기작에 관여하는 단백질 생성이 줄어들게 되 고 염증성 인자들 생성이 활성화되는 것으로 판단된다.
결
론
본 연구에서는 염증세포의 일종인 RAW264.7 대식세 포를 이용하여 감마선에 의한 염증 유발에 MCP-1이 관 여하는지 여부와 그 발현기작에 관해 조사하였다. 감마 선에 의한 MCP-1 발현기작에 대해서는 추가 실험이 필 요하며 MCP-1이 염증반응 초기에 염증세포를 모으는 역할을 담당하기 때문에 MCP-1의 발현을 억제할 수 있 다면 방사선에 의한 염증 부작용을 해소하는 데 도움이 될 것으로 판단된다.사
사
본 연구는 농림수산식품부 농림기술개발사업의 지원 에 의해 이루어진 것입니다.참 고 문 헌
송미희, 이경자, 구혜수, 오원용. 2001. 방사선조사에 의한 쥐 폐손상에 방사선보호제로서 Captopril의 역할에 관한 연 구. 대한방사선종양학회지. 19(2):190-198. 이우승, 김석연, 박성욱, 오병희, 이명묵, 최윤식, 박재형. 2002. 흰쥐에서 방사선 조사로 유발된 혈관의 이완기능 장애 에 미치는 스테로이드 효과. Korean Circulation J. 32(3): 215-223.Anand AR, Bradley R and Ganju RK. 2009. LPS-induced MCP-1 expression in human microvascular endothelial cells is mediated by the tyrosine kinase, Pyk2 via the p38 MAPK/ NF-κB-dependent pathway. Mol. Immunol. 46(5):962-968. Anand AR, Cucchiarini M, Terwilliger EF and Ganju RK. 2008. The tyrosine kinase Pyk2 mediates lipopolysaccharide-in-duced IL-8 expression in human endothelial cells. J. Immu-0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Relative HO-1 mRNA levels
(HO-1/
β
-actin)
0 4 8 12 24
Time (h)
Fig. 4. Effects of gamma irradiation (5 Gy) on expression of HO-1
mRNA in RAW264.7 macrophage cells.
Fig. 5. Possible model for the mechanism of MCP-1 production by
gamma irradiation in RAW 264.7 macrophage cells. This model is based on the data in this report and previous reports. Gamma irradiation activates Toll-like receptor 4 (TLR4), which causes activation of MyD88-dependnet and TRIF-dependent pathways. 5 Gy TLR4 TRIF TBK1 IRF3 IFN-β MCP-1 STAT-1 IFNR NF-κB ERK JNK Pyk2 MyD88
nol. 180:5636-5644.
Avraham H, Park SY, Schinkmann K and Avraham S. 2000. RAFTK/Pyk2-mediated cellular signaling. Cell Signal. 12: 123-133.
Jin CH, Lee HJ, Park YD, Choi DS, Kim DS, Kang SY, Seo KI and Jeong IY. 2010. Isoegomaketone inhibits lipopoly-saccharide-induced nitric oxide production in RAW264.7 macrophages through the heme oxygenase-1 induction and inhibition of the interferon-β-STAT-1 pathway. J. Agric.
Food Chem. 58:860-867.
Lee SW, Jung KI, Kim YW, Jung HD, Kim HS and Hong JP. 2007. Effect of epidermal growth factor against radiothera-py-induced oral mucositis in rats. Int. J. Radiat. Oncol. Biol.
Phys. 67:1172-1178.
Liu ZY, Ganju RK, Wang JF, Ona MA, Hatch WC, Zheng T, Avraham S, Gill P and Groopman JE. 1997. Cytokine sig-naling through the novel tyrosine kinase RAFTK in Kaposi’s sarcoma cells. J. Clin. Invest. 99:1798-1804.
Lutgendorf SK. 2009. Positive affect and radiation-induced inflammation: insights into inflammatory regulation? Brain
Behav. Immun. 23:1066-1067.
Maines MD. 1998. Heme oxygenase: Function, multiplicity,
regulatory mechanisms and clinical application. FASEB J.
2:2557-2568.
Mihaescu A, Santen S, Jeppsson B and Thorlacius H. 2010. p38 Mitogen-activated protein kinase signaling regulates vascu-lar inflammation and epithelial barrier dysfunction in an experimental model of radiation-induced colitis. Br. J. Surg.
97:226-234.
Mihalcea O and Arnold AC. 2008. Side effect of head and neck radiotherapy: optic neuropathy. Oftalmologia 52(1):36-40. Mul VE, Van Geest AJ, Pijls-Johannesma MC, Theys J,
Vers-chueren TA, Jager JJ, Lambin P and Baumert BG. 2007. Radiation-induced bullous pemphigoid: a systematic review of an unusual radiation side effect. Radiother. Oncol. 82(1): 5-9.
Yamada N, Yamya M, Okinaga S, Nakyama K, Shibahara S and Sasaki H. 2000. Microsatellite polymorphism in the heme oxygenase-1 gene promoter is associated with susceptibility to emphysema. Am. J. Hum. Genet. 66:187-195.
Manuscript Received: August 20, 2010 Revision Accepted: Septemer 14, 2010
