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발
암의 유전자치료법 및 단백질치료법에서 주로 사용하는 유전자는 세포사멸(celldeath),특히 세포자멸사(apoptosis)에 관여하는 유전자를 target으로 하는 경우가
많다.세포자멸사에 관여하는 단백질은 많은 종의 암세포의 암화(tumoregenesis) 과정에 관여하며,특히 세포사멸억제 단백질인 Bcl-xL,Bcl-2는 암세포에서 과잉 발현하고 있음이 밝혀졌다.따라서 Bcl-xL,Bcl-2의 억제 peptide에 대한 연구가 활발하며,또한 암세포를 죽이는 killing 단백질인 Bax,Bak 등의 세포자멸사를 유도하는 유전자에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 세포내에서 무해한 상태로 존재하지만 celldeath를 유도하는
자극(stimuli)에 의해 암세포의 apoptosis를 현저하게 촉진시키는 Bcl-xL 단백질
의 돌연변이체인 Bcl-xL-C5mt(Bcl-xL-5A)에 대한 암 세포 자멸 촉진 기전 규
명을 시행하고자 하였다.기존의 방사선(tomo therapy)및 화학적 암 치료법의 효과를 극대화 시킬 수 있으며,부작용이 적고 안정성이 높은 유용 단백질치료제
(proteindrug)의 개발을 위한 기초적 연구자료 획득을 본 연구의 핵심목표로 하
였다.다양한 apoptosis 유도물질(항암제 등)을 처리하여,Bcl-xL-C5mt에 대해
가장 효과적인 자극제가 etoposide와 actinomycin D이라는 사실을 밝혔으며,다
양한 종류의 암 세포주에 대한 Bcl-xL-C5mt의 효과를 분석하여,Jurkatcell와
JR-T2의 leukemia(백혈병)에서 유래된 T 세포주에 가장 효과적이라는 사실을
-i
i-mutant들(5G,5D,5S,5C,5K)을 구축하여 각각의 apoptosisactivity를 분석하였
다.Bcl-xL-C5mt의 세포자멸사 mechanism을 상세히 규명하고자,Bcl-xL-C5mt
의 cellularlocalization,Bax translocation,mitochondria에서의 cytochorome c
release, mitochondria fragmentation(단편화), homodimerization, Bax와의
heterodimerization 등을 분석하였다. 그 결과, wild type Bcl-xL이 주로
mitochondria에 발현 하는데 반해 Bcl-xL-C5mt는 cytosol에 발현되며,
Bcl-xL-C5mt이 Bax와 co-transfection 하였을 경우에는 Bax 단독의
transfection에 비해 Bax의 mitochondria로의 translocation과 mitochondria에서의
cytochorome c release가 더욱 강하게 나타났다. 또한 mitochondria의
fragmentation가 빠른 속도로 발생하여 결국 세포는 사멸하게 된다. 즉,
Bcl-xL-C5mt이 Bax와 연계하여 강력한 apoptosis를 유도 한다는 사실이 증명되
었다.Cytosol에 존재하는 wild type Bcl-xL이 homodimer를 구성하는데 반해,
Bcl-xL-C5mt는 Homodimer를 구성하지 못했지만 wildtypeBcl-xL과 동일하게
Bax와의 heterodimer를 형성하였다.이러한 결과로부터,cytosol에만 존재하며
homodimer를 형성할 수 없는 Bcl-xL-C5mt이 Bax와 heterodimer를 형성하여
Bax의 translocation을 촉진하거나, 또는 wild type Bcl-xL/Bax
heterodimerization을 억제하는 dominant negative의 역할을 함으로써
Bcl-xL-C5mt이 pro-apoptosis의 기능을 가지게 된다는 mechanism을 규명하였 다.Bcl-xL-5Cmt은 정상세포에 도입되더라도 2차적인 세포사멸 stimuli가 없으 면 무해하기 때문에 tomotherapy 등의 국부적인 방선치료(방사선에 노출된 세 포는 급격하게 세포자멸사를 하기 때문에 적은량의 방사선으로도 치료가 가능함, 부작용 최소화)등에 특히 큰 효과가 기대된다.특히,Bcl-xL-C5mt은 정상적인 생체방어시스템인 apoptosis를 이용한 부작용이 적고 안정성이 높은 암 치료제로
서,수술,방사선요법,화학요법 등의 방법에 의해 치료가 어려운 암에 대한 치료 에서 2차적 암 치료(방사선요법,화학요법 등)방법으로의 효과가 기대된다. 핵
핵
-i
v-차
차
차
례
례
례
국문 요약 ……… ⅰ 차 례 ……… iv 그림 차례 ……… ⅴi 표 차례 ……… viii Ⅰ.서 론 ……… 1 Ⅱ.재 료 및 방법 ……… 6 A.세포배양 ……… 6B.Apoptosisinductcingstimulus ……… 6
C.Construct ……… 7
D.돌연변이 Bcl-xL의 과발현을 위한 construc구축 ……… 8
E.Transfection ……… 9
F.Westernblotanalysis ……… 10
G.Fluorescenceactivatedcellsorter(FACS)analysis ……… 11
H.co-Immunoprecipitationanalysis……… 11
I.Confocalmicroscopy ……… 13
Ⅲ.결 과 ……… 14
C.다양한 2차 자극에 대한 세포자멸사 촉진 효과 분석 ……… 16
D.다양한 암세포주에 과발현시킨 돌연변이 Bcl-xL (5A) 단백질의 세포자멸사 촉진 효과 분석 ……… 17
E.다양한 돌연변이 Bcl-xL 단백질에 대한 세포자멸사 촉진효과 분석 ……… 19
F.Fluorescenceactivatedcellsorter(FACS)analysis을 이용한 돌연변이 Bcl-xL 단백질의 세포자멸사 촉진 효과 분석 ……… 19
G. Jurkat, JR-T2, HCT-116, HT1080 세포주에서의 endogenousBax,Bcl-xL,p53단백질 발현 양상 분석 ……… 20
H.wildtypeBcl-xL(WT)과 돌연변이 Bcl-xL(5A)의 세포 내 위치 분석 ……… 22
I.wild type Bcl-xL(WT)과 돌연변이 Bcl-xL(5A,5S)의 homodimer형성 확인 ……… 22
J.wild typeBcl-xL(WT)과 돌연변이 Bcl-xL(5A)의 Bax와 heterodimer형성 확인 ……… 24
Ⅳ.고 찰 ……… 26 Ⅴ.결 론 ……… 29 참고 문헌 ……… 30 ABSTRACT ……… 33 B.Etoposide 농도별 돌연변이 Bcl-xL(5A) 단백질의 세포자멸사 촉진 효과 분석 ……… 15
-vi-그
그
그 림
림
림 차
차
차 례
례
례
Fig.1.A summaryofapoptosis. ……… 4
Fig.2.A classofBcl-2familyproteinandstructure. ……… 5
Fig.3.Schematicstructureofhuman Bcl-xL and a C-terminal
sequencerepresentationofthedifferentmutantsofBcl-xL. …… 7
Fig.4.Western blotanalysis ofcleaved caspase 3 in
Jurkatcelllines. ……… 15
Fig.5.Western blot analysis of cleaved PARP in
Jurkatcelllines,varietyEtoposideconcentration. ……… 16
Fig.6.Western blotanalysisofcleaved caspase3 in
Jurkatcelllines,varietyapoposisinducingreagent. ……… 17
Fig. 7. Western blot analysis of cleaved caspase 3 in
varietycancercelllines. …… 18
Fig. 8. Western blot analysis of cleaved caspase 3 in
Fig.9.ViabilityassaysofwildtypeBcl-xL andBcl-xL mutants. …… 20
Fig.10.Western blotanalysisofendogenousofendogenous
Bax,Bcl-xL,p53levelsinJurkatcelllines. ………… 21
Fig.11.Western blotanalysisofaftertransfection,p53
levelsinJurkatcelllines ……… 21
Fig.12.Confocalmicroscopic analysis ofwild type Bcl-xL(WT)
andmutantBcl-xL(5A)forcellularlocalizationinHeLacelllines. … 22
Fig.13.Bcl-xL incytosolicformshomodimers. ……… 23
Fig.14.Homodimerization ofwild type Bcl-xL(WT)
andmutantBcl-xL(5A,5S). ……… 24
Fig.15.heterodimerization with Bax,wild type Bcl-xL(WT)
-vii
i-표
표
표 차
차
차 례
례
례
Ⅰ
Ⅰ
Ⅰ.
.
.서
서
서 론
론
론
암은 현재 우리나라의 사망률 1위를 차지하고 있을 뿐만 아니라 최근의 통계 에 의하면 매년 증가하고 있다.현재 시술되고 있는 대표적 암 치료방법으로는 외과치료(수술),방사선 치료,항암약제 등의 화학요법 치료,면역요법 등이 있 으나,환자의 암 치료에서 가장 문제시되는 것이 치료시행에 의한 정상세포의 손상 등의 부작용이기 때문에 환자에 도입할 때에 고려사항과 여러 가지 문제 점이 많다(Table1.). 최근 부작용이 적은 암 치료 연구로 가장 주목받고 있는 것이 단백질치료법이다(Harada등,2006).이 방법은 virusvector나 plasmidvector를 사용한 유전자치료
법과 달리 유전자 산물인 단백질을 치료제로 사용하기 때문에,인체 내에서 오랜 기 간 존재하여 여러 가지 변형을 일으킬 수 있는 유전자 대신에 단백질치료제를 세포 내에 도입함으로써 부작용을 줄일 수 있는 방법이다.특히,사용 용량,세포 내의 잔 류 시간 등의 조절을 쉽게 할 수 있고,세포내에서 일정기간이 지난 후 자연적으로 쉽게 분해되어 제거되기 때문에 정상세포 내에 도입되어도 세포에 손상을 주지 않 는다.유전자치료법 및 단백질치료법에서 주로 사용하는 유전자는 세포사멸,특히 세포자멸사에 관여하는 유전자를 대상으로 하는 경우가 많다(Shoemaker등,2006; Bruncko등,2007;Cao등,2007).세포자멸사는 많은 종류의 암세포의 암화과정에 관여하며,특히 세포사멸억제 단백질인 Bcl-xL,Bcl-2는 암세포에서 과잉발현하고 있음이 밝혀졌다(OlopadeOI등,1997;EspanaL 등,2004).따라서 Bcl-xL,Bcl-2
의 억제 peptide에 대한 연구가 활발하며 또한 killing단백질인 Bax,Bak등의 세포
자멸사를 유도하는 유전자에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다(Shore 등,2005;
-2-하지만,무조건 세포를 사멸시키는 killingprotein을 이용하거나,암 억제 유전자
의 도입 혹은 암 유발 유전자의 기능을 억제시키는 peptide를 이용하는 cancer
therapy의 가장 큰 문제점은,치료제의 정상세포에 도입으로 발생하는 부작용이다. 이러한 기존의 cancertherapy와 달리,세포에 다량 도입되어도 무해하지만,방사 선 등의 2차 자극에 의해 선택적으로 암세포의 세포자멸사를 현저하게 촉진시키는 단백질 치료제의 개발을 위한 기초적 연구를 수행하고자 하였다. Bcl-2family protein은 세포자멸사가 진행될 때 주로 세포의 미토콘드리아에 존 재한다.크게 세포사멸을 촉진하는 그룹과 세포사멸을 억제하는 그룹으로 분류되며 (Fig.1.),BH1,BH2,BH3,BH4의 기능부위로 구성되어 있다(Fig.2.).특히 많은 종 류의 암세포 내에서 발현량이 크게 증가되는 Bcl-xL은 암세포의 세포사를 억제하여 암세포의 대량 증식을 돕는 역할을 하는 Bcl-2familyprotein으로 잘 알려진 단백 질이다. Bcl-xL의 C-terminus의 5개 아미노산의 변화를 준 돌연변이 단백질은 Bcl-xL 의 본래의 기능인 세포사멸억제기능을 잃어버리고,세포내에서 무기능을 나타내 다가 어떠한 세포사의 유도가 진행되면 급격한 세포자살을 유도한다는 사실이
밝혀졌다(Jeong 등,2004).wildtypeBcl-xL은 세포의 미토콘드리아와 세포질에
함께 존재하는데(Hsu 등,1997;Liu 등 2003;Nijhawan,2003)반해 Bcl-xL의
C-terminus의 5개 아미노산의 변화를 준 돌연변이 Bcl-xL 단백질은 세포질에만 존재하며 세포자멸사의 유도가 없을 때는 세포내에서 아무런 작용을 하지 않기 때문에 정상세포에서 과잉으로 존재하여도 무해하다. 새로운 Bcl-xL 돌연변이 단백질은,지금까지의 유전자치료법 및 단백질치료법에서 주로 사용하는 단백질 즉,세포 내에 도입됨과 동시에 세포를 사멸시키거나 세포사멸억제 단백질의 기 능을 억제하는 분자와 달리 세포 내에 다량 도입되어도 무해한 상태로 존재하지
만 세포사를 유도하는 자극에 의해 암세포의 세포자멸사를 현저하게 촉진시키는 단백질이기 때문에,정상세포에 대한 부작용을 최소화 할 수 있는 획기적인 치료 제로서의 유용성이 기대된다.
본 연구에서는 다양한 apoptosis 유도물질(Etoposide, Actinomycin D,
Staurosporine,sFas Ligand,Radiation,H2O2 등)을 처리하여,Bcl-xL-C5mt에
대해 가장 효과적인 자극제를 발굴(screening)하였고,다양한 종류의 암 세포주에
대한 Bcl-xL-C5mt의 효과를 분석하였다. 또한, Bcl-xL(5A) 이외의 다양한
Bcl-xL c-terminalmutant들(5G,5D,5S,5C,5K)을 구축하여 각각의 apoptosis
activity를 분석하였다.Bcl-xL(5A)의 세포자멸사 mechanism을 상세히 규명하고
자, Bcl-xL(5A)의 cellular localization, homodimerization, Bax와의
heterodimerization 등을 분석하여 Bcl-xL(5A)이 pro-apoptosis의 기능을 가지게
된다는 mechanism을 규명하였다.기존의 방사선(tomotherapy)및 화학적 암 치
료법의 효과를 극대화 시킬 수 있으며,부작용이 적고 안정성이 높은 유용 단백
-4-T T Taaabbbllleee111...TTThhheeerrraaapppyyyooofffmmamaallliiigggnnnaaannntttcccaaanncncceeerrraaannnddmdmmeeeccchhhaaannniiisssmmm... 분류 치료방법 작용기전 효과 부작용 기타 국소요법 수술요법 - -있다 관혈적 방사선요법 일정 종양과 정상 조직의 성질에 의존 비관혈적 전신요법 화학요법 약제에 따라 다르다 면역요법 -C D 95 , TN F -R P ro -C as pase 8 C a sp ase-8 tB id B id B ax /B a k D rug s, U .V, G row th fac tor
D ep rival e tc . G en etic alteration B a x P ro-C a spase 3 P ro-C a spase 9 S u bs trates: P AR P , L am ins, F od rin, F AK , P AK -2, P K C … C ytoc hrom e c IC AD /C AD C AD IC AD cle aved C asp ase 9 Ap af-1 C a sp ase 3 B cl-2 B c l-x L “B H 3 o n ly ” (B im , B a d , B ik … ) AIF IAP s S m ac + H trA2 E nd o G C ell m em bra ne D N A
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F F Fiiiggg...111...AA sA ssuuummmmmmaaarrryyyooofffaaapppoooppptttooosssiiisss...F F
-6-I
I
II
I
I.
.
.재
재료
재
료
료 및
및
및 방
방
방법
법
법
A A
A...세세세포포포 배배양배양양(((ccceeellllllcccuuullltttuuurrreee)))
HCT-116 (human colorectal carcinoma), HeLa (human epithelial
adenocarcinomas by cervix and uterine), Hep G2 (human hepatocellular
carcinoma),L929(mousefibroblast),NIH3T3(mouseembryonicfibroblast)세
포주들은 1% antibiotics(Gibco BRL., U.S.A)와 10% FBS(WelGENE INC.,
South Korea)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium/high
glucose,HycloneLabaratoriesINC.,U.S.A)배지에서 37℃,5% CO2조건으로 배
양하였다.
HT1080(humanfibrosarcoma),Jurlat(humanacuteT cellleukemia),LNCaP
(human prostate carcinoma), L-M (mouse fibroblast by subcutaneous
connective tissue; areolar and adipose), T24 (human urinary bladder
carcinoma)세포주들은 1% antibiotics (Gibco BRL.)와 10% FBS (WelGENE
INC.)를 첨가한 RPMI1640(Hyclone Laboratories INC.)배지에서 37℃,5% CO2
조건으로 배양하였다. B
B
B...AAApppoooppptttoosossiiisssiiinnnddduuuccciiinnngggssstttiiimmmuuullluuusss
TopoisomeraseⅠinhibitor인 Etoposide(Sigma Aldrich Co., U.S.A),
Transcription inhibitor인 ActinomycinD(BiosShopINC.,Canada),non-selective
proteinkinaseinhibitor인 Staurosporin(CellSignalingTechnologyINC.,U.S.A.),
recombinanthuman solubleFasLigand(Biovision INC.,U.S.A.),DNA에 손상을
C C
C...CCCooonnnsststtrrruuucccttt
pEYFP-C1(Clonetech labaratories,INC.,Japan)vector에 cloning된 Bcl-xL
construct와 pCMV3B vector에 cloning된 Bcl-xL construct,
pcDNA3.1(Invitrogenco.,U.S.A)vector에 cloning된 wild-typeBax를 사용하였
다.본 연구에서는,Bcl-xL의 C-tail부분의 마지막 5개의 아미노산을 다른 아미
노산으로 치환하여 만든 6종의 돌연변이 Bcl-xL construct를 구축하였다.
Alanine으로 치환한 Bcl-xL(Bcl-xL 5A),Glycine으로 치환한 Bcl-xL(Bcl-xL
5G), Aspartic acid으로 치환한 Bcl-xL(Bcl-xL 5D), Serine으로 치환한
Bcl-xL(Bcl-xL 5S),Cysteine으로 치환한 Bcl-xL(Bcl-xL 5C),Lysine으로 치환
한 Bcl-xL(Bcl-xL 5K)의 돌연변이 Bcl-xL construct를 wildtypeBcl-xL과 함
께 사용하였다.세포자멸사를 촉진시키기 위해 pro-apopticprotein인 Bax를 함
께 사용하였다.대조군으로는 pEYFP-C1vector와 pcDNA3.1에 cloning되어있는
Bax를 세포에 과발현시켜 돌연변이 Bcl-xL과 비교하였다. F F Fiiiggg... 333... SSSccchhheeemmmaaattitiiccc ssstttrrruucucctttuuurrreee oooff hf hhuuummmaaannn BBBccclll---xxxLLL aaannnddd aaa CCC---ttteeerrrmmmiiinnnaaalll s s seeeqqquuueeennncceceerrreeeppprrreeesseseennntttaaatttiiionoonnooofffttthhheeedddiiiffffffeeerrereennntttmmmuuutttaaannntttsssooofffBBcBcclll---xxxLLL...
-8-D D
D...돌돌돌연연연변변변이이이 BBBccclll---xxxLLL 단단단백백백질질질의의의 과과발과발발현현현을을을 위위위한한한 cccooonnnssstttrrruuucccttt구구구축축축
Bcl-xL 단백질의 C-terminus의 마지막 5개의 아미노산이 Alanine이 아닌 다
른 아미노산으로 바뀌어도 세포자멸사를 촉진하는지 알아보기 위하여 다양한 돌 연변이 Bcl-xL(5G,5D,5S,5C,5K)을 cloning하였다.해당 돌연변이 Bcl-xL에 사용 하고자 하는 제한효소 부분을 포함한 primer를 다음과 같이 제작하였다. Bcl-xL wildtype: F,5'-GCAGATCTACCATGTCTCAGAGCAACCG-3' BglⅡ 5G R,5'-CTGAATTCTCATCCACCTCCACCTCCTGAGCCCAGCAGAACCACG-3' EcoRⅠ 5D R,5'-CTGAATTCTCAATCGTCATCGTCATCTGAGCCCAGCAGAACCACG-3' EcoRⅠ 5S R,5'-CTGAATTCTCATGACGATGACGATGATGAGCCCAGCAGAACCACG-3' EcoRⅠ 5C R,5'-CTGAATTCTCAGCAGCAACAGCAGCATGAGCCCAGCAGAACCACG-3' EcoRⅠ 5K R,5'-CTGAATTCTCACTTCTTCTTCTTCTTTGAGCCCAGCAGAACCACG-3' EcoRⅠ
pEYFP-C1vector에 cloning되어 있는 wildtypeBcl-xL(WT)을 주형으로 하여
Pfu-X DNA polymerase(SolGentco.,Ltd.southKorea)를 사용하여 95℃ 20초,
62℃ 30초,72℃ 30초를 12 cycle 반복하여 PCR로 증폭하였다.증폭된 산물은
Visualizer(Seoulin ScientificCo.,Ltd,south Korea)로 확인하여 해당 유전자의
증폭된 부분을 gelextraction(GeneAllBiotechnology,south Korea)을 통해 DNA
를 추출한 뒤,제한효소 HindⅢ와 EcoRⅠ(New England BioLabs,Inc.,U.S.A.)
을 이용하여 PCR로 증폭된 돌연변이 Bcl-xL과 pEYFP-C1vector에 coloning된
wild typeBcl-xL을 절단한 후,T4 ligase(Promega Co.,U.S.A.)를 사용하여 1
6℃에서 12시간 이상 Ligation반응하였다. Ligation산물은 E.coll DH5α
competent cell에 transformation하고 Kanamycin이 들어있는 LB agar배지에
plating하여 37℃에서 배양하였다.배양 후,형성된 colony에 대하여 다음의
primer를 이용하여 colonyscreeningPCR을 시행하였다.
pE3FP-C1F,5-GATCACCTCGGCATGGACGAGCTGTA-3'
R,5'GTATGGCTGATTATGATCAGTTATCTAGAT-3'
ColonyscreeningPCR은 3step(95℃ 30초,60℃ 30초,72℃ 1분,25cycle반복)
으로 PCR하여 증폭시키고,확인하였다.Colony screening PCR을 통해 해당 유
전자가 coloning되었다고 확인이 된 colony는 kanamycin을 포함한 LB broth에
배양하여 plasmid minikit(WelGENE Inc.,south Korea)를 이용하여 plasmid
DNA를 추출한 뒤,cloning에 사용한 두 제한효소를 이용하여 절단하여 insert
를 확인한 뒤 sequencing하여 construct를 구축하였다(Fig.3).
E E
E...TTTrrraaannnsssffefeeccctttiiiooonnn
wild-typeBcl-xL(WT),mutantBcl-xL,wild-typeBax를 세포에 과발현시키
-10-GOLD(WelGene INC.) HeLa, HT1080, LNCaP, L929, NIH3T3 세포주에
WelFect-EX PLUS(WelGeneINC.)를 사용하여Bcl-xL과 Bax를 2:1의 비율로 세
포에 transfection하였다.Transfection후 13시간동안 배양하고 세포자멸사를 유도
하는 Etoposide(Sigma Aldrich Co., U.S.A), Actinomycin D(BiosShop INC.,
Canada),Staurosporin(CellSignaling Technology INC.,U.S.A.),soluble Fas
Ligand(Biovision INC.,U.S.A.),Radiation등을 처리하고 4시간,6시간,30시간 후
에 세포를 수집하였다. F
F
F...WWWeeessstteteerrrnnnbbbllloootttaaannnaaalllyyysssiiisss
Bcl-xL과 Bax를 co-transfection한 세포들에 lysis buffer(20mM Tris (pH
7.5),150mM NaCl,1% Triton X,2mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic
acid),50㎍/㎖ PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride,Sigma Aldrich Co.),
Proteaseinhibitorcocktail,SigmaAldrich Co.)와 혼합하여 단백질을 추출한 뒤
여기서 얻어진 시료를 Bradfordproteinassay(Bio-RadlabU.S.A.)방법으로 정
량 분석하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis)Loading buffer(5X)와 섞은 후,95℃에서 5분간 가열하였다.이
를 각각 80㎍씩 loading한 후 8～15% SDS-PAGE gel에 전기영동하여 분리하고,
PVDF membrane(MilliporeCorporation,U.S.A.)에 흡착이동시켜 다음과 같이 각
각의 특이항체로 Western blot analysis를 시행하여 분석하였다.1차 항체로
cleaved caspase-3(1:500, Cell Signaling Technology, INC.),
PARP(Poly(ADP-ribose)polymeraase)(1:500,Santa cruzBiotehchnology,INC.,
U.S.A.),Bax(1:500,Cell Signaling Technology,INC.),Bcl-xL (1:500,Cell
사용하고, 2차 항체로는 HRP(horseradish peroxidase가 conjugation된 goat
anti-rabbitantibody(1:5000,SantacruzBiotechnology,INC.)를 이용하여 반응시
킨 뒤 WEST-ZOL Plus(iNtRON Biothchnology,southKorea)를 처리하여 필름
에 현상하였다. G
G
G...FFFllluuuooorrreeesssccceeennnccceeeaaaccctttiiivvvaaattteeedddccceeellllllsssooorrrttteeerrr(((FFFAACACCSSS)))aaannnaalallyyysssiiisss
세포사가 얼마나 일어났는지 확인하기 위해 Annexin V-PE Apoptosis
detectionkit(BD BiosciencePharmigen,U.S.A.)을 사용하여 형광표지세포분리기
(Becton Dickinson Bioscience, U.S.A.)로 분석하였다. pEYFP-C1 vector와
pcDNA3.1+Bax, pEYFP-C1+Bcl-xL(WT)과 pEYFP-C1+Bcl-xL(5A)와
pcDNA3.1+Bax를 2:1의 비율로 co-transfection하고 13시간 배양한 뒤,세포사를
유도하는 Etoposide25μM을 처리하고 6시간 뒤에 세포를 수집하였다.수집한 세
포를 차가운 PBS(Phosphatebufferedsaline,HycloneLaboratoriesINC.)로 2번
washing한 뒤 1X106의 세포를 1X Annexin V binding buffer(BD Bioscience
pharmigen)400㎕에 부유시킨 후,100㎕씩 4개의 5㎖ culturetube에 옮기고 각
각 non-staining, 7-AAD(7-amono-actinomycin D), Annexin V-PE,
7-AAD+AnnexinV-PE를 5㎕씩 넣고 빛이 차단된 실온에서 15분간 염색하였다.
각각의 tube에 400㎕의 1X Annexinbinding buffer를 넣어 가볍게 섞어준 다음,
형광표지세포분석기를 사용하여 측정된 결과를 WinMDI 2.9(Joseph Trotter,
ScrippsResearchInstitute,U.S.A.)로 분석하였다.
H H
H...cccooo---IIImmmmmmuununnoooppprrereeccciiipppiiitttaaatttiiiooonnnaaannnaaalllyyysssiiisss
-12-세포들에 1X celllysis buffer(10mM HEPES (pH 7.4),150mM NaCl,0.1%
BSA( bovine serum albumin, 1% Triton X, 50㎍/㎖ PMSF
(Phenylmethanesulfonyl fluoride, Sigma Aldrich Co.), Protease inhibitor
cocktail,Sigma Aldrich Co.)와 혼합하여 ice에서 10분간 반응시키고 dounce로
40번 찧어서 단백질을 추출한 뒤 여기서 얻어진 시료를 DC Protein Assay Kit
(Bio-Rad laboratories,INC.,U.S.A.)방법으로 정량 분석하여 input으로 100㎍을
SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)
Loading buffer(5X)와 섞은 후,95℃에서 5분간 가열하였다.IP할 500㎍은 cell
lysis buffer로 200㎕을 맞추고 Protein A/G PLUS Agarose beads(Santa Cruz
Biotechnology,INC.)50㎕를 넣고 4℃에서 1시간 반응시켜 pre-clearing 한다.
4℃로 맞춘 Microcentrifuge에서 10초 spin down 시키고 상층액을 1.5㎖ tube에
옮긴다.옮긴 상층액에 Myc-Tag antibody(1:100 CellSignaling Technology,
INC.)를 넣어 4℃에서 overnight으로 반응시킨 후,Protein A/G PLUS Agarose
beads를 10㎕넣고 4℃에서 3시간 반응시킨다.4℃로 맞춘 Microcentrifuge에서 1
분 spin down 시키고 pellet을 500㎕의 celllysis buffer로 5번 washing한다.
pellet에 20㎕의 2X SDS loading buffer를 넣고 Vortexing하여 잘 섞어 준 뒤,
Microcentrifuge에서 30초 spin down 시켜 100℃에서 2분간 가열하고
Microcentrifuge에서 1분 spin down 시켜 이를 각각 loading한 후 15%
SDS-PAGE gel에 전기영동하여 분리하고, PVDF membrane(Millipore
Corporation,U.S.A.)에 흡착이동시켜 다음의 항체를 이용하여 Western blot
analysis를 시행하여 분석하였다. 1차 항체로 Bcl-xL(1:200, Santa Cruz
Biotechnology,INC.)와 Bax(1:500,CellSignalingTechnology,INC.)를 사용하였
antibody(1:5000,Santa cruzBiotechnology,INC.,U.S.A.)를 이용하여 반응시킨
뒤 WEST-ZOL Plus(iNtRON Biothchnology,south Korea)를 처리하여 필름에
현상하였다. I
I
I...CCCooonnnfffooocccaaalllmmimiicccrrrooossscccooopppyyy
돌연변이 Bcl-xL(5A)단백질의 세포내 위치(cellularlocalization)를 확인하기
위하여,pEYFP-C1에 clooning한 wild type Bcl-xL과 돌연변이 Bcl-xL(5A)를
HeLa cell에 transfection하여 과발현시킨 후,공초점 현미경(CarlZeiss LSM
510, Germany)으로 관찰하였다. Mitochondria의 염색을 위하여
-14-I
I
II
I
II
I
I.
.
.결
결
결 과
과
과
A A A...돌돌돌연연연변변변이이이 BBBcclcll---xxxLLL (((555AAA))단)단단백백백질질질의의의 세세세포포포자자자멸멸멸사사사 촉촉촉진진진 효효효과과과 분분분석석석Bcl-xL의 C-terminalmutant인 Bcl-xL(5A)에 의한 Apoptosis촉진효과를 확
인하고자,pEYFP-C1 vector에 cloning된 wild type Bcl-xL(WT),pEYFP-C1
vector,pEYFP-C1에 cloning된 Bcl-xL(5A)를 Jurkat cell에 transfection하여
caspase3activityassay(cleavedcaspase3)를 실시하였다.Pro-apoptoticBcl-2
family member인 Bax와의 co-transfection, apoptosis 유도물질인
Etoposide(Topoisomerase Ⅱ inhibitor)처리를 단독 또는 공동으로 처리하였을
때를 비교하였다.그 결과,Bcl-xL(5A)은 Bax와 co-transfection 되었을 때(단독
또는 Etoposide와 공동)vector(V)와 비교하여 강력한 apoptosis를 촉진한다는 것
이 밝혀졌다.돌연변이 Bcl-xL(5A)와 pcDNA3.1vector에 cloning되어 있는 wild
typeBax를 2:1의 비율로 co-transfection하고 13시간 배양한 뒤,Etoposide100μ
M을 처리하고 6시간 뒤에 세포를 수집하여 Western blotanalysis 방법으로
cleaved caspase 3 단백질의 발현량 차이를 확인하였다.그 결과,대조군인
pEYFP-C1vector와 pcDNA 3.1에 cloning된 wildtypeBax를 과발현시켰을 때
보다 돌연변이 Bcl-xL(5A)단백질과 Bax를 과발현시켰을 때 cleaved caspase3
F F Fiiiggg...444...WWWeesessttteeerrrnnnbbblllotoottaaannnaaalllyyyssisiisssooofffcccllleeeaaavvveeedddcccaaassspppaaassseee333iiinnnJJJuuurrrkkkaaatttccceeellllllllliiinnneeesss... B B B...EEEtttoooppopoosssiiidddeee농농농도도도별별별 BBBccclll---xxxLLL--c-cc555mmmttt(((555AAA)))의의의 세세세포포포자자자멸멸멸사사사 유유유도도도 효효효과과과 분분분석석석
Etoposide의 농도의존성 apoptosis를 확인하기 위하여 wild typeBcl-xL(WT)
과 pEYFP-C1 vector,Bcl-xL(5A)를 pcDNA3.1 vector에 cloning된 wild type
Bax와 co-transfection하여 과발현시키고,Etoposide를 각각 5uM,10uM,25uM
농도로 처리하고 6시간 후에 세포를 수집하여 Western blot 방법으로
PARP(Poly(ADP-ribose)polymeraase)activityassay(cleavedPARP)를 수행한
결과,Bcl-xL-C5mt(5A)에 의한 apoptosis는 Etoposide농도에 의존적이라는 것
-16-F F Fiiiggg...555...WWWeeesssttteeerrrnnn bbblloloottt aaannnaaalllyyysssiiisss ooofff cccllleeeaaavvveeeddd PPPAAARRRPPP iiinnn JJJuuurrkrkkaaattt ccceeellllllllliiinnneeesss,,, E E Etttooopppooosssiiidddeeecccooonnnccceeennntttrrraatattiiiooonnn... C C C...다다다양양양한한한 22차2차차 자자자극극극에에에 대대대한한 세한 세세포포포자자자멸멸멸사사사 촉촉촉진진진 효효효과과과 분분분석석석 돌연변이 Bcl-xL(5A) 단백질을 Jurkat 세포주에 과발현시키고 다양한 Apoptosis유도 물질을 주어 세포자멸사 촉진 효과를 wildtypeBcl-xL(WT)과
pEYFP-C1 vector를 대조군으로 하여 비교하였다.wild type Bcl-xL(WT)과
pEYFP-C1vector,돌연변이 Bcl-xL (5A)을 wildtypeBax와 co-transfection하
여 과발현시키고 13시간 배양한 후,각각 Oxidative sTranscription inhibitor인
Actinomycin D을 1㎍
/
㎖ 농도로 처리하고 6시간 뒤에 세포를 수집,non-selectiveprotein kinaseinhibitor인 Staurosporine을 0.2μM/㎖ 농도로 처리
하고 4시간 뒤에 세포를 수집,sFasLigand100ng/㎖ 농도로 처리하고 4시간 뒤
10Gy의 Radiation을 방사하고 30시간 뒤에 세포를 수집하여 Western blot
analysis방법으로 cleavedcaspase3단백질의 발현량 차이를 확인한 결과,대조
군에 비해 발현량의 차이가 크지 않았다(Fig.6.). F F Fiiiggg...666...WWWeesessttteeerrrnnn bbblllootottaaannnaaalllyyyssisiisssooofffcccllleeeaaavvveeeddd cccaaassspppaaassseee333iiinnn JJJuururrkkkaaatttccceeellllllllliiinnneeesss,,, v v vaaarrriiieeetttyyyaaapppoooppptttooosssiiisssiiinnnddduuuccciiinnngggrrereeaaagggeenenntttsss... D D D...다다다양양양한한한 암암암 세세세포포포주주주에에에 과과과발발발현현현시시시킨킨 돌킨 돌돌연연연변변변이이이 BBBccclll---xxxLLL(((555AAA)))단단단백백백질질질의의의 세세세포포포자자자멸멸멸 사 사 사 촉촉촉진진진 효효효과과과 분분분석석석 다양한 암세포주 Jurat,HepG2,LNCaP,L929,NIH3T3,HCT-116,T24, HT1080,HeLa를 사용하여 돌연변이 Bcl-xL 단백질의 세포자멸사 촉진효과를
분석하기 위하여 pEYFP-C1 vector에 cloning되어 있는 돌연변이 Bcl-xL과
-18-co-transfection하고 13시간 배양한 뒤,Etoposide100μM을 처리하고 6시간 뒤에
세포를 수집하여 Western blotanalysis 방법으로 cleaved caspase 3 단백질의
발현량 차이를 확인하였다.그 결과,대조군인 pEYFP-C1vector와 pcDNA 3.1
에 cloning된 wildtypeBax를 과발현시켰을 때보다 돌연변이 Bcl-xL(5A)단백질
과 Bax를 과발현시켰을 때 Jurkat,HepG2,T24세포주에서 cleavedcaspase3의
단백질 발현량이 증가하였다(Fig.7.). F F Fiiiggg...777...WWWeeesssttteeerrrnnn bbbllloootttaaannnaaalllysyyssiiisss ooofffcccllleeeaaavvveeeddd cccaaassspppaaassseee 333 iiinnn vvvaaarrriiieeettytyy cccaaannnccceeerrr c c ceeellllllllliiinnneeesss...
E E
E...다다다양양양한한한 돌돌돌연연연변변변이이이 BBBccclll---xxxLLL 단단단백백백질질질에에에 대대대한한한 세세세포포포자자자멸멸멸사사사 촉촉촉진진진 효효효과과과 분분분석석석
Bcl-xL(5A)이외에 더욱 효과적으로 apoptosis를 유도하는 Bcl-xL mutant를
발굴하기위하여 다양한 Bcl-xL c-terminal영역 mutant들(5G,5D,5S,5C,5K)
을 구축하였다(Fig.3.).wildtypeBcl-xL(WT)과 각각의 mutant를 Jurkat세포
주에 Bax와 co-transfection 한 후 etoposide를 처리하여 Western blotanalysis
방법으로 apoptosisactivity를 분석하였다(Fig.8.).Mutant들 중에서 5S는 5A와
비슷한 효과(pro-apoptosis기능)를 보였으며,5D,5C,5K는 5A에 비해 약하게
apoptosis를 유도하였고,5G는 Bcl-xL의 anti-apoptosis기능을 그대로 유지하고
있었다.이결과로부터,5A와 5S가 가장 효과적으로 세포자멸사를 촉진한다는 것 을 확인하였다(Fig.8.). F F Fiiiggg...888...WWWeesessttteeerrrnnn bbblllootottaaannnaaalllyyyssisiisssooofffcccllleeeaaavvveeeddd cccaaassspppaaassseee333iiinnn JJJuuurrrkkkaaatttccceeellllllllliiinnneeesss,,, v v vaaarrriiieeetttyyymmmuuutttaaannntttBBBccclll---xxxLLL... F F F...FFFllluuuooorrreeesssccceeennnccceee aaaccctttiiivvvaaatteteeddd ccceeellllllssosoorrrttteeerrr(((FFFAAACCCSSS)))aaannnaalallyyysssiiisss을을을 이이이용용용한한한 돌돌돌연연연변변변이이이 B B Bccclll---xxxLLL 단단단백백백질질질의의의 세세포세포포자자자멸멸멸사사사 촉촉진촉진진 효효효과과과 분분분석석석 돌연변이 Bcl-xL 단백질의 세포자멸사 촉진 효과를 분석하기 위해
-20-Fluorescenceactivatedcellsorter(FACS)analysis를 이용하여 분석하였다.wild
typeBcl-xL(wt)가 발현된 암세포는 Bax 단백질이 과잉으로 발현된 세포자멸사 의 조건하에서 세포의 사멸을 억제 시키는 역할을 하였다(5.2%의 세포만 사멸). 반대로 Vector만 도입된 세포는 세포자멸사(apoptosis)의 조건하에서 42.6%의 세포가 사멸되었다. 하지만, 두 종류의 돌연변이 단백질, Bcl-xL Δ5C와 AAAAA(5A)는 각각 61.2%와 89.2%의 세포사멸을 보여,Bcl-xL의 본래의 기능 을 잃었을 뿐만 아니라 Vector와 비교하여 세포자멸사를 크게 촉진하는 것을 확 인하였다(Fig.9.) F F Fiiiggg...999...VVViiiaababbiiillliiityttyyaaassssssaaayyysssooofffwwwiiillldddtttyyypppeeeBBBccclll---xxxLLLaaannndddBBBccclll---xxxLLLmmmuuutttaaannntttsss... G G G...JJJuuurrrkkkaaattt,,,JJJRRR---TT2T22,,,HHHCCCTTT--1-11111666,,,HHHTTT110100888000세세세포포포주주주에에에서서서의의의 BBBaaaxxx,,,BBBccclll---xxxLLL,,,ppp555333단단단 백 백 백질질질 발발발현현현 양양양상상상 분분분석석석 Bcl-xL(5A)의 세포자멸사 유도가 세포자멸사 관련 단백질의 세포내 발현량의 차이에 의한 것일 가능성을 확인하기 위하여,암 세포주에서 endogenous Bax,
포주 중에서 Bcl-xL(5A)의 효과가 적은 HCT-116과 HT1080 세포주에 비해
Bcl-xL(5A)의 효과가 가장 큰 Jurkat과 JR-T2세포주에서의 endogenousBax와
p53의 발현량이 매우 낮았다.또한,Bcl-xL(5A)와 Bax의 transfection 이후의
p53의 발현량의 차이를 비교한 결과 p53의 발현량에는 변화가 없었다. F F Fiiiggg...111000...WWeWeesssttteeerrrnnnbbbllloootttaaannnaaalllysyyssiiisssooofffeeennndddooogggeeennnooouuusssBBBaaaxxx,,,BBBccclll--x-xLxLL,,,ppp555333llleveevveeelllsssiiinnn J J Juuurrrkkkaatatt,,,JJJRRR--T-TT222,,,HHHCCCTTT---11111166,6,,HHHTTT111000888000ccceeellllllllliiinnneeesss... F F Fiiiggg...111111...WWWeeesssttteeerrrnnn bbblllotoottaaannnaaalllyyysssiiisssooofffaaafffttteeerrrtttrrraaannnsssfffeeeccctttiiiooonnn,,,ppp55533l3lleeevvveeelllsssiiinnn JJJuuurrrkkkaaattt
-23-c c ceeellllllllliiinnneeesss... H H H...wwwiiillldddtttyyypppeeeBBcBcclll---xxxLLL(((WWWTTT)))과과과 돌돌돌연연연변변변이이이 BBBccclll---xxxLLL(((555AAA)))의의의 세세세포포내포내내 위위위치치치 분분분석석석
공초점 현미경을 이용하여, HeLa cell에서 wild type Bcl-xL(wt)이 주로
mitochondria에 발현 하는데 반해 Bcl-xL(5A)는 cytosol(세포질)에 발현하는 것
을 확인하였다(Fig.12.). F F Fiiiggg...111222...CCoCoonnnfffooocccaaalllmmimiicccrrrooossscccoopoppiiiccc aaannnaaalllyyysssiiisss ooofff wwwiiilllddd tttyyypppeee BBBccclll---xxxLLL aaanndndd mmmuuutttaaannnttt B B Bccclll---xxxLLL((5(55AAA)))fffooorrrcceceelllllluuulllaaarrrlllooocccaaallliiizzzaaatttiiionoonniiinnnHHHeeeLLLaaaccceeellllllllliiinnneeesss... I I I...wwwiiilllddd tttyyypppeee BBBccclll---xxxLLL(((WWWTT)T))과과과 돌돌돌연연연변변변이이이 BBBccclll---xxxLLL(((555AAA,,,555SSS))의)의의 hhhooommmooodddiiimmmeeerrr형형형성성성 확 확 확인인인
Cytosol에 존재하는 wildtypeBcl-xL은 서로의 c-tail을 주고받는 homodimer
를 형성하고 있으며,이 homodimer형성이 Bcl-xL의 anti-apoptoticfunction에
매우 중요하다는 사실이 보고되어 있다(Jeong 등,2004.,Fig.13.)Cytosol에 존재
여 myc-tagging을 한 Bcl-xL construct와 myc-tagging을 하지않은 Bcl-xL
construct를 HeLa cell line에 co-transfection하여 myc 항체로
immunoprecipitation(IP)를 하였다 그 결과, wild type Bcl-xL(WT)과 달리
pro-apoptosis function을 하는 Bcl-xL(5A)와 Bcl-xL(5S)는 homodimer를 형성
하지 못했다(Fig.14.).
F F
-24-F F Fiiiggg... 111444.. H. HHooommmooodddiiimmmeeerrriiizzzaaattitiiooonnn ooofff wwwiiilllddd tttyyypppeee BBBccclll---xxxLL(L((WWWTTT))) aaannnddd mmmuuutttaaannnttt B B Bccclll---xxxLLL(((555AAA))),,,(((555SSS)))... J J J...wwwiiillldtddttyyypppeeeBBBcclcll---xxxLLL과과과 돌돌돌연연연변변변이이이 BBBccclll---xxxLLL의의의 BBBaaaxxx와와와 HHHeeettteeerrrooodddiiimmmeeerrr형형형성성성 확확확인인인
Wild typeBcl-xL(WT)은 Bax와 heterodimer를 형성함으로써,Bax의 기능을
억제하고 Bcl-xL이 anti-apoptoticfunction을 수행한다는 사실이 보고되어 있다
(Letal등,2002).HeLa 세포주에서 Bcl-xL(5A)가 Bax와 heterodimer를 형성하
는지의 여부를 확인하기 위하여, myc-tagging을 한 Bcl-xL construct와
myc-tagging을 하지 않은 Bax construct를 co-transfection하여 myc 항체로
immunoprecipitation(IP)를 하였다. IP한 결과, Bcl-xL(5A)가 wild type
Bcl-xL(WT)과 동일하게 Bax와 heterodimer를 형성하는 것을 확인하였다(Fig.
F F Fiiiggg...111555...HHHeeettteeerrrooodddiiimmmeeerrriiizzzaatattiiiooonnn wwwiiithtthh BBBaaaxxx aaannndd wd wwiiilllddd tttyyypppeee BBBccclll---xxxLLL(((WWWTTT))) aaannnddd m m muuutttaaannntttBBBccclll---xxxLLL(((555AAA)))...
-26-I
I
IV
V
V.
.
.고
고
고 찰
찰
찰
Bcl-xL(5A)의 pro-apoptoticfunction에 대한 기전을 규명하고자,Bcl-xL(5A)
의 cellularlocalization,homodimerization,Bax와의 heterodimerization등을 분석
하였다. wild type Bcl-xL(WT)이 주로 mitochondria에 발현하는데 반해
Bcl-xL(5A)는 cytosol(세포질)에 발현하였다.
Cytosol에 존재하는 wild type Bcl-xL(WT)은 서로의 c-tail을 주고받는
homodimer를 형성하고 있으며,이 homodimer형성이 Bcl-xL의 anti-apoptosis
function에 매우 중요하다는 사실이 보고되어 있다(Jeong 등,2004).Cytosol에
존재하는 Bcl-xL(5A)와 Bcl-xL(5S)가 homodimer를 형성하는지의 여부를 확인
한 결과, wild type Bcl-xL(WT)과 달리 pro-apoptosis function을 하는
Bcl-xL(5A)와 Bcl-xL(5S)는 homodimer를 형성하지 못했다.
wild tupeBcl-xL(WT)은 Bax와 heterodimer를 형셩함으로써,Bax의 기능을
억제하고 Bcl-xL이 anti-apoptoticfunction을 수행한다는 사실이 보고되어 있다.
Bcl-xL(5A)가 Bax와 heterodimer를 형성하는지의 여부를 확인한 결과,wild
type(WT)과 동일하게 Bax와 heterodimer를 형성하였다. 이런 결과로부터,
cytosol에만 존재하며 homodimer를 형성할 수 없는 Bcl-xL(5A)가 Bax와
heterodimer를 형성하여 Bax의 translocation을 촉진하거나, 또는 wild type
Bcl-xL(WT)/Bax heterodimerization을 억제하는 dominant negative의 역할을
함으로써 Bcl-xL(5A)이 pro-apoptosis의 기능을 가지게 된다는 가설을 세우게
F F
-28-V
V
V.
.
.결
결
결 론
론
론
본 연구에서는 다양한 apoptosis 유도물질(Etoposide, Actinomycin D,
Staurosporine,sFas Ligand,Radiation,H2O2 등)을 처리하여,Bcl-xL-C5mt에
대해 가장 효과적인 자극제를 발굴(screening)하였고,다양한 종류의 암 세포주에
대한 Bcl-xL-C5mt의 효과를 분석하였다. 또한, Bcl-xL(5A) 이외의 다양한
Bcl-xL c-terminalmutant들(5G,5D,5S,5C,5K)을 구축하여 각각의 apoptosis
activity를 분석하였다.Bcl-xL(5A)의 세포자멸사 mechanism을 상세히 규명하고
자, Bcl-xL(5A)의 cellular localization, homodimerization, Bax와의
heterodimerization 등을 분석하여 Bcl-xL(5A)이 pro-apoptosis의 기능을 가지게
된다는 mechanism을 규명하였다.기존의 방사선(tomotherapy)및 화학적 암 치 료법의 효과를 극대화 시킬 수 있으며,부작용이 적고 안정성이 높은 유용 단백 질치료제(proteindrug)의 개발에 도움이 되기를 기대한다.본 연구를 통하여,세 포내에서 존재해도 무해하지만 세포사를 유도하는 자극을 받으면 다른 어떤 종 류의 세포사 유도 단백질보다 효과적으로 세포자살을 유도하는 Bcl-xL(5A)의 다 양한 암세포에 대한 효과를 검증하였으며,세포자살 극대화 방안을 밝혔다.또한, Bcl-xL(5A)의 세포자멸사 기전에 대한 가설을 세울 수 있었다. 부작용이 적은 암 치료제를 개발하기 위하여 국내․외의 많은 연구그룹에서 연 구를 진행 중이다.특히,암세포의 암 억제 유전자(TP53)에 대한 유전자치료법 연 구가 왕성히 진행되고 있다.현재 사용되고 있는 암,특히 악성 종양의 치료방법 으로는 수술,항암제 투여(화학요법),방사선요법,면역요법 등이 있다.암 환자가 치료를 받을 때 가장 많이 나타나는 부작용은 정상적인 세포손상과 면역 및 조혈 기능 저하로,이러한 휴유증,부작용이 암 치료를 계속할 지 여부를 결정짓는 중
요한 관건이 되고 있다.무조건 세포를 사멸시키는 killing protein을 이용하거나, 암억제 유전자의 도입 혹은 암 유발 유전자의 기능을 억제시키는 분자를 이용한 기존의 암 치료법과 달리,세포에 다량 도입되어도 무해하지만,방사선 등의 2차 자극에 의해 선택적으로 암세포의 세포자멸사를 현저하게 촉진시키는 단백질치료 제의 개발을 위한 기초적 연구를 진행하였다. 돌연변이 Bcl-xL (5A,5S)단백질의 암 치료용 단백질 치료제로서의 가능성을 기대할 수 있다.
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JiYoungMin
DepartmentofBiomedicalSciences
TheGraduateSchool,AjouUniversity
(SupervisedbyAssistantProfessorSeon-YongJeong)
Theeraofmoleculartargettherapyhasclearlyarrived.Recently,approaches
with chemicalcompounds or protein molecules such as biologically active
peptidesillustratethepowerofthenoveltherapiesthatwillbeused in the
coming future. Apoptosis (programmed cell death) is a cellular
self-destructionmechanism thatisessentialforavarietyofbiologicalevents,
such as developmentalsculpturing,tissue homeostasis,and the removalof
unwanted cells.Thestudy ofapoptosishasgained significantimportancein
human disease and its clinical management. In situation of tumoral
transformation,triggering ofapoptosis in malignantcells willbe a way of
-34-apoptosispathwaysrepresentsausefultherapeuticstrategy todestroy cancer
cells.
TheBcl-2family membersarecentralregulatorsofapoptosisthatpromote
or inhibit cell death by regulating the permeabilization of the outer
mitochondrialmembrane.Thisfamily comprisesboth pro- and anti-apoptotic
members. Multiple members of the human Bcl-2 family of
apoptosis-regulating proteins have been identified and can be divided into
threedifferentgroupsbased on Bcl-2homology (BH)domainsand function.
Theanti-apoptoticmembers,such asBcl-2and Bcl-xL,typically haveBH1
through BH4 domains.The pro-apoptotic members can be divided into two
groups:thosewith BH1,BH2and BH3domains,such asBax and Bak,and
those with only BH3 domains,such as Bad,Bid and Bim.Experimental
therapiestargeting Bcl-2-family mRNAsorproteinsarecurrently in clinical
testing,raising hopes thata new class ofanticancer drugs may soon be
available.
Bcl-xL is found both in the cytosol and attached to mitochondrial
membranes in healthy cells and tissues. Cytosolic Bcl-xL exists as a
homodimer.Duringapoptosis,thecytosolicfractionofBcl-xL translocatesand
inserts into mitochondria.In the previous report, wefound a new molecule,
Bcl-xL(5A),whichfunctions asstrongpro-apoptoticmoleculareventhoughit
derived from anti-apoptoic protein, Bcl-xL. Bcl-xL(5A) is an AAAAA
C-terminalsubstitution mutantofBcl-xL in theC-terminalhydrophobic tail
this molecule and confirming the usefulness of this molecule for novel
anti-cancerapproach thatsensitizecancercells toapoptosis.
OverexpressionofBcl-xL(5A)inHeLacellscausedadramatic celldeath.In
orderto revealthatthis celldeath is a apoptotic celldeath,we performed
severaltests including Bax translocation to the mitochondria, cytochrome c
release from the mitochondria, caspase 3 activation (cleavage), and
mitochondria fragmentation. During early stages of apoptosis, the
pro-apoptoticproteinsBax translocates to theoutermitochondrialmembrane
(OMM) and, almost instantly after translocation, concentrates into
submitochondrialpunctate foci.Bcl-xL(5A)expressed cells showed increased
Bax translocation, cytochrome c release, caspase 3 activation, and
mitochondria fragmentation,indicating the pattern of apoptotic cell death.
Experimentof co-expression of Bcl-xL(5A) with Bax revealed thatapoptosis
byBcl-xL(5A)is dependentonBax expression.Ofthevarious cancelllines,
highestcytotoxic effectofBcl-xL(5A)was observed in the cells ofJurkat
and JR-T2, thatare T cells derived from leukemia. Apoptotic stimulation
testsshowedthatetoposideand actinomycineD promoted cytotoxiceffectof
Bcl-xL(5A). Mutagenesis analysis revealed a correlation between the
capability ofhomodimerformation and the antiapoptotic activity ofBcl-xL.
Mutagenesis of the C-tail was used to find out more effective Bcl-xL
mutants form (strong sensitizer). A SSSSS C-terminal substitution mutant
(5S) showed as same effect as Bcl-xL(5A) in cytotoxicity. A GGGGG
C-terminalsubstitution mutant(5G)had biological anti-apoptoticactivity.
TheC-terminalhydrophobictailsoftwo Bcl-xL moleculesare involved in
homodimerformation. Badbinding toBcl-xL dissociatesthehomodimers and
-36-Bcl-xL is also required to mediate Bcl-xL/Bax heterodimer formation. Both
mitochondrialimport and antiapoptotic activity ofdifferent Bcl-xL mutants
correlatewith theirability to form homodimers. To clarify the pro-apoptotic
mechanism ofBcl-xL(5A), I examined the homodimerformation ofBcl-xL
mutantsandheterodimer formationofBcl-xL mutantswith Bax. Contraryto
wildtype,Bcl-xL(5A)loseits homodimerizationabilitybutstillhasitsability
ofheterodimerization with Bax, suggesting that Bcl-xL(5A) may function as
a dominantnegativemoleculeagainst towildtypeBcl-xL.
Theresultssuggest thatanew typeof therapeuticmolecule, Bcl-xL(5A), is
usefulforcancertherapy.Therationaldesignofnovelapproaches towardthe
developmentof selectiveinduction ofapoptosisin cancercells willpave the
wayfortheenhancedand cancer-selectivecancertherapy.
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