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연구
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척수소뇌성운동실조증 제7형(SCA7) 또는 상염색체우성 소뇌성운동실조증 제II형(ADCA II)은 주로 소뇌와 망막의 이상기능과 퇴행에 의한 소뇌성 운동실 조와 실명을 임상적 특징으로 하는 상염색체 우성의 진행성 신경퇴행질환이다. SCA7의 유병률은 전세계적으로 인구 약 1,000,000명 당 1-4명이다.SCA7은 Ataxin-7 단백질을 코드하는 ATXN7 유전자 내의 불안정한 CAG 반복서열의 확장으로 유발된다.정상 ATXN7대립유전자에서 CAG 반복서열의 수는 4-35개 이다.돌연변이 대립유전자의 CAG 확장범위는 36에서 460개이며,이러한 CAG 반복서열 수는 질병발병의 나이와 반비례를 보인다.하지만 28-35개의 CAG를 갖는 중간형 대립유전자는 자식세대로 넘어가면서 CAG 반복서열이 확장되면서 돌연변이 대립유전자로 전환될 수 있다.Ataxin-7은 많은 CNS,비 CNS 조직들 에서 관찰되나 질병을 일으키는 증상들은 단지 몇 가지 신경계 세포(예를 들어 조롱박세포와 원뿔 및 막대 세포)에 국한된다.Ataxin-7의 기능은 완전히 밝혀지 지 못하였으나 최근 들어 히스톤 아세틸전이효소의 활성을 갖는 전사 공동활성 자복합체(TFTC 또는 STAGA)의 구성요소로 추정되고 있다. 현재까지도 SCA7을 포함한 폴리글루타민(poly Q)질환에 효과적인 치료법 은 개발되지 못하였다.돌연변이 대립유전자 발현의 억제는 SCA7의 근본적인 치 료법이 될 수 있다.최근 들어 이중가닥의 RNA(dsRNA)로 유도되는 RNA 간섭 (RNA interference,RNAi)을 이용한 방법이 표적으로 하는 유전자의 발현을 억 제하는 데에 매우 유용한 방법으로 대두되고 있다.이러한 새로운 방법은 DNA 염기서열 특이적 유전자 억제를 위한 유일한 도구가 되며 폴리글루타민 질환과 같은 기능획득성(gain offunction)질환들에 있어서 부작용이 가장 적은 잠재적 인 치료법이 될 수 있다.이 연구에서 SCA7의 치료를 위해 돌연변이 ATXN7대립유전자 특이적 또 는 비특이적인 두 종류의 RNAi시스템을 구축하고자 하였다.돌연변이 대립유전 자 특이적 RNAi시스템을 제작하기위하여 ATXN7유전자 내에 기존에 알려진 두 단일염기변이(SNP)를 이용하였다.그 중 한 SNP(G 또는 A)는 엑손 12(ORF 에 존재)에 위치하며 다른 한 SNP(G 또는 A)는 엑손 13(3‘-UTR에 존재)에 위 치한다.이들 두 SNP의 빈도를 한국인 SCA7 환자에서 밝히기 위해,16명의 SCA7 환자들로부터 두 유형의 SNP의 빈도수를 분석하였다.엑손 12의 A가 84%,G가 16%이었으며,엑손 13의 경우는 반대로 G가 84%,A가 16%로 존재하 였다.이형접합률은 31.3%로서 나타났으며,이것은 돌연변이 단백질 선별적 억제 치료가 가능한 수치이다.최초 두 SNP 유형을 조합할 경우 보다 높은 이형접합 률을 확보해 돌연변이 대립유전자 특이적 발현억제 RNAi에 보다 많은 환자의 적용이 가능하리라 판단하였다.하지만 SNP 분석결과 엑손 12의 G와 엑손 13의 A가 서로 연관되어 있는 것으로 나타나 실제로 그 가능성은 높지 않은 것으로 밝혀졌다.엑손 12의 G/A SNP를 이용하고자 A와 G를 타깃으로 하는 각각의 shorthairpin RNA(shRNA)발현 construct를 제작하였다.HeLa세포에서 이들 두 RNAiconstructRNAi-A와 RNAi-G는 SNP를 인지하는 대립유전자 특이적 방식으로 돌연변이 Ataxin-7(55Q)의 발현을 각각 약 80%,50%까지 억제하였다. 또한 이러한 RNAi적용시,세포자멸사 유도제인 staurosporine(STS)에 의해 유 도된 SK-N-SH(신경모세포종 세포주)의 세포자멸사의 진행이 억제되는 것을 일 부 확인하였다.다음으로,ATXN7 돌연변이 대립유전자 비특이적인 shRNA construct를 제작하였다.이 중 하나가 Ataxin-7의 발현을 약 80%까지 감소시켰 다.상기의 두 가지 시스템으로 제작한 shRNA는 HeLa 세포에서 돌연변이 Ataxin-7(55Q)의 과발현에 의하여 형성된 핵포함체(응집)를 눈에 띄게 감소시켰 다.이러한 결과로부터 유추해 볼 때,대립유전자 특이적 및 비특이적 돌연변이 Ataxin-7의 발현억제를 위한 두 RNAi시스템을 조합하여 사용한다면,추가적인 상승효과를 가져와 SCA7의 새로운 치료법으로서 큰 효과가 기대된다.
핵
핵핵심심심어어어:::척수소뇌성 운동실조증 제7형(SCA7),상염색체우성 소뇌성운동실조증 제II형(ADCA II),폴리글루타민 질환,Ataxin-7,RNA 간섭(RNAi),대립유전자 특이적 RNAi,단일염기변이(SNP)
차
차
차 례
례
례
국문요약 i 차례 iv 그림 차례 vi 표 차례 vii I.서론 1 II.재료 및 방법 13 A.주요 실험재료 13 B.SCA7에 대한 분자유전학적 분석 13 1.조직별 CAG 반복서열 수 분석 13 2.ATXN7의 두 SNP 타입 분석 14 C.Ataxin-7발현 벡터 제작 16 1.PCR 프라이머 디자인 16 2.RNA 추출 및 cDNA 합성 16 3.ATXN7유전자 클로닝 18 4.Ataxin-7발현 벡터 제작 19 D.shRNA 발현 벡터 제작 20 1.PCR 프라이머 디자인 20 2.인간의 U6프로모터 클로닝 21 3.shRNA 발현 벡터 제작 21F.Westernblotting 26 G.공초점현미경 관찰 27 III.결과 28 A.주요 SCA 유형별 유병률 분석 28 B.SCA7환자 조직별 CAG 반복서열 수 분석 28 C.ATXN7유전자의 두 SNP타입 분석 32 D.Ataxin-7과 shRNA 발현 벡터 제작 36 E.돌연변이 대립유전자 비선별적 RNAi의 효과 확인 36 F.돌연변이 대립유전자 선별적 RNAi의 효과 확인 39 G.공초점현미경을 통한 RNAi의 효과 확인 39 H.돌연변이 대립유전자 선별적 RNAi적용 후 세포자멸사 확인 42 IV.고찰 44 V.결론 50 참고문헌 51 ABSTRACT 58
그
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그림
림
림 차
차
차례
례
례
Fig.1. SchematicdiagramsofSCA-relatedgeneandprotein,
ATXN7andAtaxin-7 1118 Fig.2. AnticipationinSCA7 9 Fig.3. PathologicalhallmarksofSCA7 10 Fig.4. ProgressedstudiesofSCA7orpolyglutaminediseasesin
eachdevelopmentstepofpolyglutaminedisease 11111 Fig.5. SchematicdiagramsoftwostrategiesforRNAionATXN7 12 Fig.6. PedigreeofakindredofSCA7patientsdonatingtheir
bodiesforourstudy 11115 Fig.7. RNAi-targetedregionsandsequencesinATXN7 23 Fig.8. SchematicdiagramsofshRNA modelandoneof
designedprimersforshRNA 11125 Fig.9. AnalysisofCAG repeatsaccordingtotissuetypesin
SCA7patient'Father'donatinghisbodyforourstudy 11130 Fig.10.AnalysisofCAG repeatsaccordingtotissuetypesin
SCA7patient'Daughter'donatinghisbodyforourstudy 11131 Fig.11.TwotypesofsequencingdataoftwoSNP typesin
ATXN7from 16koreanSCA7patients 11133 Fig.12.Distributionchartsof2SNP typesinATXN7according
toKorean,chineseandJapanese 11135 Fig.13.SchematicdiagramsofAtaxin-7-expressingvectorand
RNAi-inducingvector 11137 Fig.14.Effectofmutantallele-non-specificRNAionWestern
blottinginHeLa 11138 Fig.15.Effectofmutantallele-specificRNAionWesternblotting
inHeLa 11140
Fig.16.Effectsof2RNAisystemsonconfocalmicroscopyin
표
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차례
례
례
Table1.PrimersforcloningofATXN7gene 17
Table2.PrimersforcloningofhumanU6promoterand shRNA-expressingnvectors
111
24
Table3.PrevalenceofSCA subtypesinKorea,Japanandworldwide 29
Table4.AnalysisoftwoSNP typesinATXN7of16KoreanSCA7 patients
111
I
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I.
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서 론
론
론
척수소뇌성운동실조증(spinocerebellarataxia,SCA)또는 상염색체 우성 소 뇌성운동실조증(autosomaldominantcerebellarataxia,ADCA)은 10만명 당 약 3-7명 꼴로 발생(인구집단마다 상이)하는 상염색체 우성 유전질환으로서,임상증 상은 소뇌 및 그 주변부 특정 뇌 조직 부위의 퇴행에 의한 진행성 운동신경장애 로 유사하나,특징적으로 분명히 구분되는 29종의 서로 다른 질환들을 포함하는 질환이다(Schӧls등,2004;Michalik등,2004;Duenas등,2006).임상적 증상 형 태로 ADCA I,II,III로 분류되기도 한다(Harding,1983).대표적 증상으로는 운 동실조(ataxia), 조음곤란(dysarthria), 삼킴곤란(dysphagia), 안구근육장애 (ophthalmoplegia), 피라밋 또는 피라밋외 증상(pyramidal or extrapyramidal
signs)등이 있으며,분자유전학적 원인으로는 관여 유전자 내의 CAG,CTG, ATTCT 반복서열의 증폭 등이 있다(Schols등,2004;Duenas등 2006).
이 중 SCA1,2,3,6,7,17,DRPLA(dentatorubralpallidoluysian atrophy) (전체 SCA 중 2/3차지)는 관여 유전자 내의 CAG 반복서열(또는 단백질 수준 에서 폴리글루타민(polyglutamine))의 돌연변이성 확장으로 유발되며,같은 원인 을 갖는 다른 질환인 헌팅톤병(Huntington disease),SBMA(spinaland bulbar muscularatrophy)와 함께 폴리글루타민 질환(총 9종)으로 함께 불려지고 있다 (Michalik등,2004;Benjamin등,2007).이러한 폴리글루타민 질환의 주요 특징 으로는 불안정한 CAG 반복서열의 확장으로 세대를 거듭할수록 반복서열의 증폭 과 임상증상이 심각해지는 anticipation과,독성 단백질 산물로 유발되는 세포질 내 또는 핵 내 단백질들의 응집(aggregation)또는 포함체(inclusion body)가 있 다(Schӧls등,2004;Duenas등 2006).
척수소뇌성운동실조증 제7형(spinocerebellar ataxia type 7,SCA7)은 전체 SCA 중 약 1-12%를 차지하는 질환으로서,그 발생률은 인구집단 마다 상이하나 한국인에서 비교적 높은 것으로 알려져 있다(Schӧls등,2004;Michalik등,2004;
주요 특징으로는 소뇌의 진행성 퇴행으로 인한 운동실조(ataxia)와 망막의 퇴행 (색소성 황반변성(pigmentary maculardegeneration))으로 인한 실명이 있으며, 결국 환자는 발병 10-20년 후 사망에 이르게 된다(Michalik 등,2004).망막퇴행 에 의한 실명은 SCA 중 SCA7에만 해당되는 특징으로서 다른 것과 구별되어 SCA7은 ADCA II로 분류된다(Harding,1983).기타 증상으로 조음곤란,삼킴곤 란,느린 단속성 안구운동 등의 안구운동장애,피라밋증상 등이 있다(Michalik 등,2004).병변은 중추신경계의 특정부위에 한정되며,소뇌(cerebellum),뇌교 (pons),치아핵(dentatenucleus),시상하부핵(subthalamicnucleus)등과 망막의 황반(macula)이 주요 병변이 되며,세포 수준에서는 주로 소뇌의 조롱박세포 (Purkinjecell)와 망막의 원뿔(cone)및 막대(rod)광수용체 세포가 잘 알려져 있 다(Martin등,1994;Michalik등,2004).
SCA7 관여 유전자는 ATXN7이며,염색체의 3p21.1-12에 위치하고 있다 (Benomar 등,1995;David 등,1997;Duenas 등,2006).이 유전자는 크기가 140kb에 달하며,13개의 엑손(exon)으로 구성되어 4416bp의 cDNA를 갖는다 (Michalik등,1999).Fig.1.에 유전자 모형을 도식하여 수록하였다.유전자 내에 는 일종의 다형성(polymorphic)부위인 CAG 반복서열이 존재하며,이 반복서열 이 비정상적으로 확장될 경우 질환(SCA7)을 일으키게 된다.정상인의 경우에는 7-35개의 CAG가 존재하며(일반적으로 인구의 70-80%는 10개의 반복서열을 가 짐),반면 본인이 가질 경우 정상의 표현형(phenotype)을 나타내지만(34-36개의 경우,경한 증상이 나타나기도 함),자식에게 CAG 확장을 불러올 수 있는 범위 는 28-35개(전체 인구 중 0.5% 이하)로서,이를 중간형 대립유전자 (intermediate allele)로 별도로 분류해 임상적인 의미를 두고 있다(Stevanin 등, 1998; Nardacchione등,1999;Michalik등,2004).환자범위는 36-460개로 다른 폴리글 루타민 질환에 비해 그 반복서열의 수가 큰 것이 특징이며,CAG가 70개 이상인 경우에는 소아와 유아에서도 발병되는데,이러한 커다란 CAG 확장은 일반적으 로 부계를 통해 (정자에서의 증폭으로) 유전된다고 알려져 있다(Benton 등, 1998;van de Warrenburg 등,2001;Michalik 등,2004).세대를 거듭할수록
CAG 반복서열의 확장은 증가되며,이러한 CAG 반복서열의 수와 임상증상에서 의 심각성 및 발병연령 감소는 비례하여 나타나게 되는데,이러한 anticipation은 폴리글루타민 질환의 특징으로서 특히 SCA7에서 확연히 나타나게 되며,Fig.2. 에 관련 도표를 수록하였다(Giunti등,1999;Schӧls 등,2004;Michalik 등, 2004).또한 반복서열의 수에 따라 증상양상이 달라지기도 하는데,반복서열의 확 장이 비교적 적을 경우(<59CAGs)에는 소뇌퇴행성 증상이 먼저 나타나게 되고, 많을 경우(≥59 CAGs)에는 시력장애가 선행되게 된다(David 등, 1998; Johansson등,1998;Michalik등,2004). ATXN7 유전자의 단백질 산물은 Ataxin-7으로서, 892개의 아미노산 (95-kDa)으로 구성된다(David등,1997).폴리글루타민 부위는 N 말단의 아미노 산 30번째부터 존재하며,그 하류영역에는 다른 단백질과의 상호결합에 관여하리 라 추정되는 SH3결합도메인(SH3-bindingdomain)을 포함하는 프롤린 풍부영역 (proline-rich region)이 존재한다(Lebre등,2001;Michalik 등,2004).arrestin의 인산염 인식자리(phosphate-recognitionsite)와 유사한 모티프(motif)가 아미노산 서열 341-384 위치에 존재하기도 한다(Mushegian 등,2000).또한 핵위치신호 (NLS;nuclearlocalization signal)와 핵유출신호(NES;nuclearexportsignal)가 함께 존재해 Ataxin-7은 핵 내부와 외부를 자유롭게 이동하며 기능하는 단백질 로 추정된다(Kaytor등,1999;Taylor등,2006;Young 등,2007).또한 많은 폴 리글루타민 질환 유발 단백질이 그러하듯이,Ataxin-7도 내부에서 잘리어 SCA7 의 질환유발에 관여하는데,최근 들어 그 잘림부위(cleavagesite)와 자르는 단백 질(Caspase-7)이 밝혀지기도 하였다(LaSpada등,2001;Yvert등,2001;Garden 등,2002;Young 등,2007).Ataxin-7은 현재까지도 그 기능이 명확히 알려지지 않았지만 진화적으로 잘 보존된 단백질(쥐와 인간 간에 88.7% 일치)로서 매우 중요한 위치를 담당하는 것으로 보인다(Strom 등,2002).또한 최근 들어서는 Ataxin-7의 짜깁기변이(splicing variant)형태로서 Ataxin-7의 이형(isoform)단 백질인 Ataxin-7b(엑손 12와 13사이에 67bp가 추가되어 총 945개의 아미노산으
의 세포질에 주로 존재하는 것으로 밝혀졌다(David 등,2003).이것은 Ataxin-7 의 기능과 SCA7질환의 기전을 밝히는데 도움이 되리라 판단된다.Ataxin-7단 백질의 모형을 Fig.1.에 수록하였다.최근 들어 Ataxin-7의 기능과 SCA7의 분 자적 기전이 하나씩 밝혀지고 있다.많은 연구결과에 의하면 Ataxin-7은 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferase)의 활성에 관여하는 TFTC(TBP-free TAF-containing complex)/STAGA(SPT3-TAF9-GCN5 complex)복합체의 구 성요소로서,전사(transcription)에 관여하는 공동활성자(coactivator)로 기능한다 고 하며,망막세포의 퇴행에 CRX의 관여 여부가 현재 논쟁이 되고 있으나,돌연 변이 Ataxin-7이 정상적인 전사적 기전에 영향을 끼쳐 질병을 유발하는 데에는 큰 이의가 없는 것으로 보인다(Helmlinger등,2004;Chen 등,2004;Palhan 등, 2005;Helmlinger와 Hardy 등,2006;Helmlinger와 Tora등,2006).하지만 최근 들어 돌연변이 Ataxin-7이 Bax를 증가시키고 Bcl-xL을 감소시켜,미토콘드리아 성 세포자멸사(mitochondrialapoptosis)를 유도해 세포사를 일으킨다는 연구보고 가 있어 SCA7과 신경세포사가 그리 간단히 해석될 문제는 아니라 여겨지고 있 다(Wang등,2006).
Ataxin-7은 다양한 조직들(심장,폐,간,신장,췌장,근육 등)에서 발견되며, 뇌의 다양한 부위에서 상대적으로 많이 관찰되나,그 양은 조직과 뇌 부위에 따 라 상이하며,심지어 나이에 따라 변화(특히 소뇌의 조롱박세포의 경우)를 보이 기도 한다(Lindenberg 등,2000;Cancel등,2000;Einum 등,2001;Jonasson등, 2002).Ataxin-7을 실험적으로 과발현(over-expression)시켰을 때는 주로 핵 내 부에서 관찰되나,실제로 Ataxin-7은 세포질,핵 양쪽 모두에 존재하는 단백질이 다.신경세포에서 관찰시 Ataxin-7은 오히려 주로 세포질에서 발견되거나,핵과 세포질 양쪽 모두에서 관찰된다(Lindenberg 등,2000;Cancel등,2000;Einum 등,2001;Jonasson등,2002).
다른 폴리글루타민 질환과 마찬가지로,SCA7에서도 응집(aggregation)또는 포함체(inclusion body)가 발견되며,신경세포의 핵 내에 신경세포성 핵 포함체 (neuronalnuclear inclusion body;NI)로 많이 발견된다(Holmberg 등,1998;
Mauger등,1999;Cancel등,2000;Einum 등,2001;Jonasson 등,2002).NI는 뇌의 여러 부위 중 병변(하부올리브,망막의 광수용체,소뇌피질 등)에서 많이 발 견되나,병변과는 무관한 다른 부위(대뇌피질 등)에서도 관찰되며,심지어 주요 병소인 소뇌의 조롱박세포에서는 거의 발견되지 않아 NI가 직접적으로 질병을 유발하고 질병부위를 대표하는 것으로 단정을 짓는 것은 곤란한 것으로 보인다 (Michalik등,2004).하지만 검시(postmortem examination)가 질병의 최종단계를 보여주며,광학현미경으로 보이지 않는 작은 형태의 NI가 존재하고,또한 각 세 포의 질병으로의 진행은 독립적(혹은 자발적)이지 않다는 점을 고려한다면 NI가 무관하다고 단정을 짓는 것도 어렵다(Michalik등,2004;Custer등,2006).NI는 여러 단백질들이 복합적으로 포함되고 응집된 단백질 집합체인데,이것은 기본적 전사요소(TFIIEα,TFIIFβ),전사공동활성자(CBP),TFIID 개시복합체의 구성요소 인 TAFII30 등 전사에 관여하는 단백질들을 포함하며, 기타 ubiquitin, proteasome의 구성성분,caspase-3,molecularchaperone(HDJ-2/Hsp40,Hsp70) 등을 포함한다(Holmberg 등,1998;Zander등,2001;Takahashi등,2002).언뜻 보면 이러한 NI가 그 구성 단백질들을 격리시켜 그들의 작용을 억제시키고,돌연 변이 Ataxin-7의 분해 및 회전(turnover)을 늦추어 돌연변이 Ataxin-7의 축적과 독성을 증가시키는 것으로 볼 수 있다.하지만 실제로는 그렇지 않은 듯 보인다. 많은 연구결과가 그들 구성 단백질의 발현량과 기능에 큰 문제가 없음을 제시하 고,심지어 돌연변이 단백질의 회전율 증가에도 이의를 제기하며,NI가 없을 경 우 오히려 돌연변이 단백질의 독성이 증가한다는 연구결과들도 발표되면서 NI가 질병을 일으키는 필연적 원인이라는 견해가 차츰 수그러들고 있다(Schӧls 등, 2004; Michalik 등, 2004). 앞서 간단히 언급하였듯이, 최근 들어 돌연변이 Ataxin-7의 N 말단 파편(fragment)이 질병의 원인과 관련이 있는 것으로 대두되 고 있다. SCA7의 NI에서 오직 N 말단 파편만이 발견되었으며, 실제로 Caspase-7에 의해 잘린 돌연변이 Ataxin-7의 짧은 N 말단 파편이 응집과 핵 내 위치를 증가시켰으며 결국 세포독성을 증가시켰다(Mauger등,1999;Cancel등,
Garden등,2002;Young등,2007).
SCA7의 확진은 ATXN7유전자 내 CAG 반복서열의 수를 확인하는 분자유 전학적 검사방법으로 비교적 간단히 수행되며,여기에는 PCR 및 Genescan방법 이 동반된다.SCA7을 포함하여 SCA의 효과적인 치료법은 현재까지 전무하며 몇몇 대증치료만이 이루어지고 있을 뿐이나 그마저 효과가 탁월하지 못한 실정 이다(Schӧls등,2004).SCA 치료연구는 질병기전의 각 단계에서 다양한 방면에 걸쳐 이루어지고 있으며,Fig.4.에 적용단계 및 연구 중인 치료제를 간략히 제시 하였다(Duenas 등, 2006; Shao와 Diamond, 2007). 이 중 RNA 간섭(RNA interference,RNAi)은 효과적인 전사후(post-transcriptional)유전자 발현억제 기 전으로,돌연변이 단백질에 의한 기능획득성(gainoffunction)(유전)질환에 근본 적이고 효과적인 치료법으로 대두되고 있으며 현재 치료법으로 임상연구에도 많 이 적용되고 있다.SCA에도 이러한 RNA 간섭을 이용한 방법은 가장 근본적이 고 효과적인 치료법이 될 수 있으며,SCA1과 SCA3에 대해서 이미 연구가 진행 되어 있는 상태이다.SCA1에는 마우스를 이용한 전임상 연구가 진행되었으며 (Xia등,2004),SCA3에는 돌연변이 대립유전자 특이적 발현억제 연구가 진행되 었다(Miller등,2003;Li등,2004). Ataxin-7은 최근 들어 전사에 관여하는 중요한 단백질로 밝혀지면서,기존 의 SCA3연구에서와 같이 정상 Ataxin-7을 제외하고 돌연변이(폴리글루타민 확 장성)Ataxin-7만을 선별적으로 발현억제시키는 RNAi방법이 보다 안전한 치료 방법으로 받아들여지게 되었다.ATXN7유전자에는 ATXN3에서와 같이 돌연변 이 대립유전자와 연관되어있는 SNP(single nucleotide polymorphism)가 존재하 지는 않지만,대신 많은 인구집단에서 (약 6:4로)비교적 균등히 존재하는 두 개 의 SNP 타입(각각 엑손 12,13에 위치)이 존재해 이들이 RNAi에 적용 가능한 SNP라 판단된다(Li 등, 2004; CHIP Bioinformatics Tools -http://snpper.chip.org/).본 연구에서는 우선 SCA7과 치료에 적용 가능한 두 SNP에 대한 분자유전학적 검사 및 분석을 수행하였으며,이후 RNAi를 이용하여 비선별적 Ataxin-7발현억제와 SNP를 이용한 돌연변이 단백질 선별적 Ataxin-7
발현억제 모두를 통해 향후 RNAi를 이용한 SCA7의 치료에 대한 가능성을 확인 하였다.Fig.5.에 두 가지 RNAi적용 방법에 대해 간단히 도식화하여 설명하였 다.
FFFiiiggg...111...SSSccchhheeemmmaaatttiiicc dcddiiiaaagggrrraaammmsss ooofffSSSCCCAAA777---rrreeelllaaattteeeddd ggegeennneee aaannnddd ppprroroottteeeiiinnn,,,ATAATTXXXNNN777aaannnddd AAAtttaaaxxxiiinnn---777...(A)Two beneficialSNP types formutantallele-specific RNAiexistin exon12and13ofATXN7.(B)InAtaxin-73NLSs(nuclearlocalizationsignal)and 1NES (nuclearexportsignal)exist.
FFFiiiggg...222..A.AAnnntttiiiccciiippapaatttiiiooonnn iiinnn SSSCCCAAA777...A plotofageatonsetasafunction ofCAG repeat lengthfor45patientsrevealsastronginversecorrelationbetweenallelesizeandage atonset(r=0.74,p<0.0001).(Excerpted and reprinted from Giuntietal.,1999,Am J Hum Genet64,1594).
FFFiiiggg...333...PPPaaattthhhooolllooogggiiicccaaalllhhhaaallllllmmmaaarrrkkksssooofffSSSCCCAAA777...(aaa---ccc)Magneticresonanceimaging (MRI) ofacontrolindivisual(aaa)andtwoSCA7patients(bbb,,,ccc).Thepatientin(bbb)displays severeatrophy ofthecerebellum (Cb),butalmostcompletesparing ofthepons(P). This patients carried 38 CAG repeats in theATXN7gene.and,atthe time of examination(60years),exhibitedmildunsteadinessofgait.Incontrast,thepatientin (ccc)showsveryseverecerebellaratrophy,aswellasmarkedatrophyofthepons(P). This individualharbored 52 CAG repeats and was examined at40 years ofage. (ddd---fff)Fundoscopy images ofa controlindividual(ddd)and two SCA7 patients(eee,,,fff). Notethenormalappearanceofthemacular(black arrow)and theopticdisk (arrow head),andthewell-developedvasculature(whitearrow)inthecontrolindividual(ddd). On thecontrary,theretinaofpatient(eee)displaysanatrophicmacular(blackarrow), very paleopticdisk (arrow head),and poorvasculature(whitearrow).Thispatient carried 52 CAG repeats and was examined at40 years.Moreover,the retina of patient(fff)shows an extremely pale optic disc (arrow head),and atrophy ofthe pigmentary epithelium and choroid layer(arrow).This patientwas diagnosed with gaitataxia,dysarthria,anddecreasedeyesightattheageof20years,anddiedat28 years.The numberofCAG repeats in this individualis unknown.(Excerpted and reprintedfrom MichalikA etal.,2004,EurJHum Genet12,4).
FFFiiiggg... 444... PPPrrrooogggrrreeessssseseeddd ssstttuuudddiieieesss ooofff SSSCCCAAA77 o7 oorrr pppooolllyyygglglluuutttaaammmiiinnneee dddiiissseeeaaassseesess iiinnn eeeaaaccchhh dddeeevvveelellooopppmmmeenenntttsssttteeepppooofffpppoolollyyygggllluuutttaaammmiiinnneeedddiiissseeeaaassseee...InSCA1RNAistudyonmousemodel wasprogressedandinSCA3allele-specificRNAistudiesoncellswereprogressed.
FFFiiiggg...555..S.SSccchhheeemmmaaattitiicccdddiiiaaagggrrraaammmsssoooffftttwwowoo ssstttrrraaattteeegggiiieeesssfffooorrrRRNRNNAAAiiiooonnnATAATTXXXNNN777...(A)Model ofallele-nonspecificRNAi.(B)Modelofallele-specificRNAiusingSNP.
I
I
II
I
I.
.
.재
재
재료
료
료 및
및
및 방
방
방법
법
법
A AA...주주주요요요 실실실험험험재재재료료료 주요 실험재료는 SCA7 환자의 검체가 되겠다.아주대학교병원에 내원하여 검사와 치료를 받았고 본 의과대학에 시신을 기증한 한 가계 두 부(2006년,58세 사망)와 녀(2003년,28세 사망)의 뇌 및 근피부 조직을 이용하여 조직별 CAG 반 복서열(repeat)분석과 Ataxin-7(10Q,55Q)발현 벡터(vector)를 제작하였다.이 환자들의 SCA7에 대한 가계도를 Fig.6.에 수록하였다.또한 아주대학병원 의학 유전학 검사실에 SCA 검사를 의뢰한 환자들의 정보는 주요 SCA의 발병비율을 통계화하는데에 사용되었으며,그러한 환자 중 SCA7으로 진단받았고 연구에 동 의한 SCA7환자들의 혈액검체는 ATXN7의 두 SNP 타입을 분석하는데 사용되 었다. 세포수준의 연구를 위하여 HeLa와 SK-N-SH(신경모세포종 유래)세포주를 이용하였으며,SK-N-SH 세포주는 한국세포주은행(서울대학교 의과대학 암연구 소)에서 분양받았다.Ataxin-7 발현 벡터(vector)로는 YFP(yellow fluorescentprotein)를 부착시 킬 수 있는 포유동물 발현용 플라스미드(plasmid) 벡터인 pEYFP-C1(BD BiosciencesClontech Co.,San Jose,CA,U.S.A)을 이용하였으며,shRNA(short hairpin RNA)발현용 플라스미드 벡터로는 episomal포유동물 발현용 벡터인 pREP4(InvitrogenCo.,Carlsbad,CA,U.S.A)를 이용하였다.
B
BB...SSSCCCAAA777에에에 대대대한한 분한 분분자자자유유유전전학전학학적적적 분분분석석석 1.조직별 CAG 반복서열(repeat)수 분석
우선 QIAampDNA minikit(QiagenCo.,Valencia,CA,U.S.A)을 이용하여 각 조직을 통해 유전체 DNA(genomicDNA,gDNA)를 추출하였다.ATL 완충액
프라이머(primer)는 SCA7/FAM-Fw(5'-TGTTACATTGTAGGAGCGGAA-3') 와 SCA7-Rv(5'-CACGACTGTCCCAGCATCACTT-3')를 사용하였으며, SCA7/FAM-Fw 프라이머의 5‘에는 FAM을 부착(modification)시켰다.중합효소 (polymerase)는 LA Taq(TAKARA Bio Co.,Shiga,Japan)을 사용하였으며, gDNA 200ng,2×GC bufferII12.5㎕,2.5mM dNTP 4.0㎕,10uM primer각각 1 ㎕,LA Taqpolymerase0.3㎕를 혼합 후 증류수로 총 부피 25㎕를 맞추어 95℃ 1'30'',(95℃ 50'',57℃ 1’,72℃ 1')× 35회,72℃ 5'조건으로 PCR하였다.이 PCR 산물을 바로 (주)아이디진(ID gene Co.,Seoul,Korea)에 의뢰하여 Gene scan하였다.
2.ATXN7의 두 SNP 타입 분석
마찬가지로 QIAampDNA minikit(QiagenCo.,Valencia,CA,U.S.A)을 이 용하여 환자의 혈액검체를 통해 gDNA를 추출하였다.이후 추출한 gDNA를 주 형으로 하여 PCR을 통해 원하는 부위를 증폭시켰다.엑손 12의 SNP(rs3774729) 를 위해 SNP-rs3774729-Fw(5'-AGTCCAATGAACTGCCTGTCAACT-3)와 SNP-rs3774729-Rv(5'-CTCACAGTCCATTTCCTACCTGATGAA-3')프라이머 를 이용하였으며, 엑손 13의 SNP(rs13272)를 위해 SNP-rs13272-Fw(5'-TCATAGTAAACAGTATGGCAGATTGGGTTG-3')와 SNP-rs13272-Rv(5'-TAAACATCTGAAGTGGCATGAAGGGGA-3') 프라이머 를 이용하였다.PCR은 gDNA 200ng,10× buffer 2.5㎕,25mM MgCl 2.5㎕, 2.5mM dNTP 4.0㎕,10uM primer각각 1.5㎕,LA Taq polymerase(TAKARA BioCo.,Shiga,Japan)0.3㎕를 혼합 후 증류수로 총 부피 25㎕를 맞추어 94℃ 1'30'',(94℃ 40'',60℃ 35'',72℃ 45'')× 35회,72℃ 5'조건으로 하였다.이후 1.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에 전기영동하고 gel DNA extraction kit(GeneAllCo.,Seoul,Korea)을 이용해 20㎕로 용리(elution)시켜 PCR 산물을 얻었다.이 PCR 산물을 (주)솔젠트(SolgentCo.,Daejeon,Korea)에 보내 염기서 열분석(sequencing)을 의뢰하였다.
FFFiiiggg...666...PPPeeedddiiigggrrreeeeeeoooffafaakkkiiinnndddrrreeedddooofffSSSCCCAAA777pppaaattitiieeennntttsssdddooonnanaatttiiinnnggg ttthhheeeiiirrrbbbooodddiiieeesss((*(**)))fffooorrrooouuurrr ssstttuuudddyyy...Thenumberbelow each figureindicating individualrevealsthecorresponding patient'spresentagein 2006 orageofhisorherdeath.Thenumbersin brackets implytheagesatfirstdiseasesymptoms.
C
CC...AAAtttaaaxxxiiinnn---777발발발현현현 벡벡벡터터터 제제제작작작 1.PCR 프라이머 디자인
SCA7 관여 유전자인 ATXN7에 대한 염기서열 정보는 미국 국립보건원 (NIH)에서 제공하는 NCBI데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 Entrez Gene을 이용하였다. 유전자 클로닝(cloning)의 타깃서열은 ATXN7 cDNA의 ORF(open reading frame)로 한정하였으며, RNAi의 타깃연장을 위해 3'-UTR(untranslated region)의 일부까지 포함(c.554- c.3461,10CAG의 경우) 시켰다.클로닝을 용이하게 하기위해 위의 타깃서열을 세 부분으로 나누어 1차 클로닝을 한 후,이후 셋을 조합하여 최종적으로 Ataxin-7발현 벡터를 제작하 고자하였다.DNA 조각의 클로닝적 조합을 위해 5'끝에는 BglII제한효소자리 를,3’끝에는 EcoR I제한효소자리를 설정하였으며,5'-YFP로 인해 ATXN7의 코돈(codon)의 틀(frame)을 벡터에 맞추었다.또한 세 조각의 조합을 위해 내부 에는 사용할 벡터와 클로닝 타깃부위에 모두 존재하지 않는 SacI과 SpeI제한 효소자리를 설정하였으며,이는 아미노산 산물의 변화는 초래하지 않고 DNA 염 기서열만의 변화를 꾀해 이루어졌다.이렇게 디자인되고 클로닝에 사용된 프라이 머를 Table 1.에 수록하였다.프라이머의 합성은 (주)바이오니아(Bioneer Co., Deajeon,Korea)에 의뢰하였다.
2.RNA 추출 및 cDNA 합성
SCA7 환자 녀(장○○)의 소뇌 조직에서의 RNA 추출은 Trizol(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,U.S.A)을 이용하였으며,회사가 제시한 방법에 준하여 실행 하였다.RNA 추출 후 260nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 얻어내었다(Factor 40 적용).cDNA의 합성은 Superscript II 역전사효소(Superscript II reverse transcriptase,Invitrogen Co.,Carlsbad,CA,U.S.A)를 사용한 RT-PCR을 통해 이루어졌으며,회사에서 제공하는 재료와 방법에 준하여 실행하였다.프라이머는 oligo(dT)14-18mer와 random 9mer를 함께 사용하였으며,각각으로 합성한 후 합쳐 최종 cDNA 산물을 얻었다.RNA 추출과 RT-PCR 시에는 RNase-free 증류수(BioneerCo.,Daejeon,Korea)를 사용하였다.
TTTaaabbbllleee111...PPPrririimmmeeerrrsssfffooorrrccclllooonnniiinnnggg ooofffAAATTTXXXNNN777geggeennneee...
Forcloning ofATXN7genePCR-targeted region inATXN7cDNA isdivided to3. The corresponding intact sequences for inner emzyme sites in targeted ATXN7
cDNA ismodifiedelaborately nottochangetheaminosequences,buttorestrictand join together.Underlines indicate restriction enzyme sites.Italic latters (ACC) in ATXN7-BglII-Fw represent Kozac sequence. T (as a italic latter in ATXN7-EcoRI-Rv)isinsertedtoadjustcodonframeinpEYFP-C1.
D D Diiivvviiisssiiiooonnn PPPrririimmmeeerrrNNNaaammmeee DNDDNNAAA SSSeeqeqquuueeennnccceee(((555''→'→→ 333'''))) R R Reeegggiiiooonnn111 ( ( (ccc...55555544-4--888888999))) A A ATTTXXXNNN777---BBBggglllIIIIII---FFFwww TTTAAAAAAGGAGAATTTCCCTTTAAACCCCCCAAATTTGGGTTCTCCGGGGGGAAAGGGCCGCGGGGGGGGCCCCCCGGGCCCGGGGGGAAATTT A A ATTTXXXNNN777--S-SSaaacccIII---RRRvvv GGGTTTGGGAAAGGGCCCTTTCCCTTGTGGTTTCCCCCCCCGCGGTTTCCCCCCTTTTTTCCCCCCCCCAAAGGGGGGAAAAAAGGGTTT R R Reeegggiiiooonnn222 ( ( (ccc...888888444---222222666666))) A A ATTTXXXNNN777---SSSaaacccIII---FFFwww CCCGGGGGGAAAGGCGCCTTTCCCGGGAAACCGCGGAAAAAAAAAGGGTTTTTTTTTCCCAAAAAAGGGGGGAAAGGGTTTTTTTTTGGGGGGGGGAAAAAA A A ATTTXXXNNN777---SSSpppeeeIII---RRRvvv GGGCCACAACCCTTTAAAGGTGTTGGGGGGTTTAAACCCTTTGGGGGGGGGCCCAAACCCTTTGGGGGGTTTGGGGGG R R Reeegggiiiooonnn333 ( ( (ccc...22222266611-1-- 333444666111))) A A ATTTXXXNNN777--S-SSpppeeeIII---FFwFww CCCGGGAAACCTCTTAAAGGGTTTCCCCCCCCCAAATTTCCCTTCTCCCCCAAACCCAAACCGCGGTTTAAATTTTTTCCCCCCTTTCCCAAACCC A A ATTTXXXNNN777--E-EEcccoooRRRIII---RRRvvv GGGCCCGGGAAAAAATTTTTTCCCTTTGGGGGGGGAGAACCCGGGTTTGGGCCCCCCTTTTTTTTTGGGGGGCCCTTTGGGAAA
3.ATXN7유전자 클로닝
위와 같은 방법으로 얻어진 cDNA를 주형(template)으로 해서 1차적으로 PCR로 원하는 부위(3조각)의 cDNA를 증폭시키고,이들 각각을 T 벡터에 삽입 시킨 후 염기서열분석하여 클로닝이 올바로 되었는지 확인하였다.
ATXN7의 영역1(region 1)은 LA Taq 중합효소(TAKARA BioCo.,Shiga, Japan)를 이용하였다.증류수 11㎕,2×GC buffer 25㎕,2.5mM dNTP 8.0㎕, ATXN7-BglII-Fw(10μM)2.0㎕,ATXN7-SacI-Rv(10μM)2.0㎕,환자의 소뇌조 직으로부터 얻은 cDNA 용액 1.5㎕,LA Taq0.5㎕를 함께 혼합하여 94℃ 1',(9 4℃ 30''→ 58℃ 30''→ 72℃ 1'20'')× 35회,72℃ 5'조건으로 PCR하였다.이 후 1.5% 아가로오스 겔로 전기영동시킨 후,정상 대립유전자 부위(약 350bp,10 CAGs)와 확장성 돌연변이 대립유전자 부위(약 500bp,55CAGs)의 겔을 각각 잘 라 gelDNA extractionkit(GeneAllCo.,Seoul,Korea)를 이용해 PCR 산물을 추 출(16㎕로 용리)하였다.이 DNA를 T 벡터에 부착시키기 위해,10× ligasebuffer 2.0㎕,위의 삽입 (insert) DNA 16㎕,pGEM-T easy vector(Promega Co., Madison,WI,U.S.A)1.0㎕,T4ligase(PromegaCo.,Madison,WI,U.S.A)1.0㎕ 를 함께 혼합하여,16℃에서 밤새(overnight) 반응시켰다.이후 DH5α E.coli competentcell에 형질전환(transformation)시켰다.형질전환 과정은 다음과 같다. competentcell100㎕와 ligation 산물 10㎕를 혼합해 얼음에서 20분간 반응시킨 후 42℃ 항온수조 (waterbath)에서 55초간 열충격(heatshock)을 주고 다시 얼음 에서 20분간 반응시키고 SOC 배지(medium)300㎕를 주입 후 37℃,1시간 조건 으로 진동배양 (shaking incubation)하였다.이 용액을 500g,3분 조건으로 원심 분리하여 100-200㎕의 상층액을 제거 후, 침전물(pellet)을 잘 풀어 항생제 (Carbenicillin,50㎍/ml)가 포함된 LB 평판배지(agarplate)에 도말(plating)하였 다. 이때에는 사전(1-2시간 전)에 X-gal과 IPTG가 도말(각각 40mg/ml, 400mg/ml으로 분리보관 (aliquot)된 용액을 각각 40㎕와 4.0㎕ 사용)된 평판배지 가 사용되었다.이렇게 깔린 competentcell을 37℃ 배양기(incubator)에서 약 16 시간 동안 배양시켜 colony를 얻었다.원하는 (흰색)colony를 2차적으로 선별하
기 위해 colony PCR법(cDNA 주형대신 일부의 colony cell을 tip으로 따서 주입 하였고 프라이머는 M13-Fw와 Rv를 사용한 것을 제외하고는 위의 PCR 조건과 동일함)으로 DNA 띠(band)의 크기를 확인하였고,확인된 colony를 4ml의 LB 배 양액(broth)에 접종(inoculation)시켜 37℃에서 약 16시간 동안 진동배양시켜 다량 의 E.coli 세포를 얻었다.이후 plasmid DNA mini-prep kit(WelGene Co., Daejeon,Korea)을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다.추출한 DNA는 (주)솔젠트(SolgentCo.,Daejeon,Korea)에 염기서열분석을 의뢰해 최종적으로 확인하였다.
ATXN7의 영역2와 3(region2,3)은 영역1보다 길어 보다 정확한 합성을 위 해 Pfu polymerase(SolgentCo.,Daejeon,Korea)를 사용하였다.증류수 25㎕, 10× reactionbuffer5.0㎕,2.5mM dNTP 4.0㎕,10μM Fw와 Rv 프라이머(Table 1.참조) 각각 2.0㎕,환자의 소뇌조직으로부터 얻은 cDNA 용액 1.5㎕,Pfu polymerase0.5㎕를 함께 혼합하여,95℃ 2',(95℃ 25'',60℃ 40'',72℃ 3'30'') × 35회,72℃ 5'조건으로 PCR하였다.이후 1.5% 겔에 전기영동시켜 DNA 띠의 크기(약 1.2-1.3kb)를 확인하였다.마찬가지 방법으로 DNA를 추출하되 11.0㎕로 용리시켰다.이렇게 추출된 DNA 11.0㎕,5× reactionbuffer3.2㎕,25mM MgCl 1.6㎕,10mM dATP 0.4㎕,Go-Taq polymerase(Promega Co.,Madison,WI, U.S.A)0.2㎕를 함께 혼합 한 후,70℃에서 30분간 반응시켜 DNA의 3‘말단에 아데닌 꼬리를 부착('A' tailing)시켰다. 이후에는 영역1에서와 마찬가지로 ligation,형질전환,colony PCR(Go-Taq을 사용),배양,mini-prep,염기서열분석 을 실시하여 최종 산물을 얻어내었다.
4.Ataxin-7발현 벡터 제작
T 벡터로 클로닝하여 염기서열분석으로 확인된 세 부위의 DNA와 사용할 벡터(pEYFP-C1)를 계획한 제한효소로 각기 잘라 모두를 ligation하여 원하는 벡 터를 제작하였다.벡터 DNA(1차로 클로닝된 T 벡터,pEYFP-C1)2.0㎍,적절한
Co.,Basel,Switzerland)각각 0.4㎕씩을 함께 혼합하고 나머지를 증류수로 채워 10㎕로 만들었다.이를 PCR기기 상에서 37℃로 2시간 반응시키고 1.5% 겔에 전 기영동시켜 DNA 띠의 크기를 확인한 후 그 부위를 잘라 겔로부터 DNA를 추출 하였다.앞의 조건으로 삽입(insert)DNA와 벡터 DNA를 ligation시켰고,마찬가 지로 이후 클로닝과정을 거쳐 최종적으로 Ataxin-7(10Q,55Q)-YFP 발현 벡터산 물을 얻어내었다.염기서열분석은 생략하였으며 대신 제한효소 절단으로 확인하 였다. 이후 진핵형질전환(transfection)을 목적으로 plasmid DNA midi-prep kit(AxygenCo.,UnionCity,CA,U.S.A)를 이용해 다량의 벡터산물을 얻어내었 다.
D
DD...ssshhhRRRNNNAA 발A 발발현현현 벡벡벡터터터 제제제작작작
shRNA 발현을 위한 프로모터(promoter)로는 인간의 U6를 선정하였으며,이 를 위해 우선 U6프로모터를 클로닝하였다.이후 U6프로모터를 주형으로 하고 shRNA 발현부위 DNA를 프라이머로 하여 PCR을 통해 shRNA 발현부위 DNA 와 U6 프로모터를 병합시켰다. 이를 pREP4 벡터에 삽입시켜 최종적으로 shRNA 발현 벡터를 제작하였다.
1.PCR 프라이머 디자인
우선 U6 프로모터를 클로닝하기위해 U6 프로모터의 염기서열을 RNAi OligoRetriever 인터넷 사이트(http://katahdin.cshl.org:9331/rnai/html/rnai.html) 를 통해 확인하였고,최대의 발현을 위해 -332부터 +1영역이 포함되도록 계획하 여 프라이머를 제작하였다(Kunkel과 Pederson,1988).RNAi타깃부위(28mer)로 는 SNP(c.3137,10CAG일 경우)를 포함하는 부위 1곳(rs3774729,Fig.1.참조) 과 클로닝한 cDNA 내부의 임의의 4곳을 선정하였다(Fig.7.참조).shRNA 발현 부위 DNA를 pREP4에 삽입시키기 위한 제한효소자리로는 pREP4 상에 존재하 는 SalI과 XbaI을 선정하였다.U6프로모터 부위를 포함하는 shRNA 발현부위 를 클로닝하기 위해서,5'-U6의 일부를 포함하고 SalI과 BglII제한효소자리가 5‘끝에 부착된 forwardprimer와,3'-U6의 일부를 포함하고 shRNA 발현부위가
포함되며 3’끝에 XbaI자리가 부착된 reverse primer를 디자인하였다.이렇게 고안되고 사용된 프라이머를 Table 2.에 수록하였으며,shRNA의 모델과 예 (RNAi#5)를 Fig.8.에 간략히 도식화하였다.프라이머의 합성은 (주)바이오니아 (BioneerCo.,Deajeon,Korea)에 의뢰하였다.
2.인간의 U6프로모터(promoter)클로닝
우선 인간의 U6프로모터를 클로닝하기위해 말초혈액(peripheralblood)에서 gDNA를 추출하였다.gDNA 추출은 DNA bloodminikit(Qiagen Co.,Valencia, CA,U.S.A)을 이용하였으며,회사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 실행하였다.이후 증류수 30㎕,10× buffer 5.0㎕,10mM dNTP 1.0㎕,gDNA 5.0㎍,hU6-Fw (-332)primer(10uM)2.0㎕,hU6-Rv(+1)primer(10uM)2.0㎕,Pfu-X polymerase (SolgentCo.,Daejeon,Korea)0.5㎕를 혼합하여,95℃ 1'50'',(95℃ 30'',60℃ 40'',72℃ 20'')× 30회,72℃ 5'조건으로 PCR하였다.이후 PCR 산물을 1.5% 겔에 전기영동시켜 약 350bp의 DNA 띠를 확인 후 잘라,앞서 기술한 방법과 마 찬가지로 DNA 추출,아데닌 꼬리부착,ligation,형질전환,colonyPCR,형질전환 세포 배양,mini-prep,염기서열분석을 실시하여 최종적으로 pGEM-T easy vector(PromegaCo.,Madison,WI,U.S.A)에 삽입된 인간 U6프로모터 클로닝 산물을 얻어내었다.
3.shRNA 발현 벡터 제작
클로닝된 U6프로모터를 주형으로 하고 shRNA 발현 부위를 프라이머로 하 여 PCR을 통해 shRNA 발현 부위와 U6프로모터가 병합된 DNA를 얻어 이것 을 pREP4에 삽입시켜 최종적으로 shRNA 발현 벡터를 제작하였다.증류수 38.5 ㎕,10× buffer5.0㎕,10mM dNTP 1.0㎕,U6프로모터 삽입 벡터 0.5㎍,10uM hU6-SalI-BglII-Fw primer2.0㎕,10uM RNAi-Rv primer(Table2.참조) 1.0 ㎕,Pfu-X polymerase(Solgent Co.,Daejeon,Korea) 0.5㎕를 혼합하여 95℃ 1'45'',(95℃ 30'',60℃ 40'',72℃ 20'')×30회,72℃ 5'조건으로 PCR하였다.
험에서와 같이 DNA 추출,아데닌 꼬리부착,ligation,형질전환,colony PCR,형 질전환세포 배양,mini-prep,염기서열분석을 실시하여 1차적으로 pGEM-T easy vector에 삽입된 shRNA 발현부위 DNA의 클로닝 산물을 얻어내었다.이렇게 얻 어진 벡터 DNA 산물 2.0㎍과 pREP4 벡터 2.0㎍을 SalI과 Xba I(Roche Co., Basel,Switzerland)으로 각각 이중제한(doubledigestion)하여 마찬가지로 전기영 동,DNA 추출,ligation,형질전환,colonyPCR,형질전환세포 배양,mini-prep을 거쳐 클로닝 산물을 최종적으로 얻어 제한효소 절단으로 확인하였다.진핵형질전 환을 위해 이렇게 최종적으로 얻어진 벡터 산물을 midi-prep하여 대량으로 얻어 내었다.
E
EE...세세세포포포배배배양양양(((ccceeellllllcccuuullltttuuurrreee))),,,진진진핵핵핵형형형질질질전전전환환환(((tttrraraannnsssfffeeeccctttiiiooonnn)),),,약약약물물물처처처리리리
HeLa세포주 배양에는 10% FBS(WelGeneCo.,Daejeon,Korea)와 1% 항생 제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco Co., Carlsbad, CA, U.S.A)가 포함된 DMEM(Hyclone Co.,Logan,Utah,U.S.A)을 사용하였다.SK-N-SH 세포주의 배양에는 10% FBS,1% 항생제,1.5g/L sodium bicarbonate,1% non-essential amino acid(Gibco Co.,Carlsbad,CA,U.S.A),1mM sodium pyruvate(WelGene Co.,Daejeon,Korea)가 포함된 MEM/EBSS(HycloneCo.,Logan,Utah,U.S.A) 를 사용하였다.
진핵형질전환에는 WelFect-EX plus(WelGeneCo.,Daejeon,Korea)를 사용 하였으며 회사가 제시하는 방법과 기준량에 준하여 시행하였다.60mm culture dish의 경우,DNA 10㎍,EnhancerQ 10㎕,EX reagent8.0㎕를 사용하였으며 진핵형질전환 시에는 OPTI-MEM I(Gibco Co.,Carlsbad,CA,U.S.A) 배지 (medium)를 사용하였다. Ataxin-7 발현 벡터와 shRNA 발현 벡터는 co-transfection하였으며,적용한 벡터 양(㎍)의 비는 1:1.5를 적용하였다.
세포자멸사(apoptosis)정도를 확인하기위해 SK-N-SH 세포주를 이용하였으 며 세포자멸사 유도를 위해 Staurosporine(Cellsignaling Co.,Danvers,MA, U.S.A)을 처리하였다.STS는 진핵형질전환 24시간 후 1uM 농도로 처리하였다.
( ( (AAA))) ( ( (BBB)))
FFFiiiggg...777...RRRNNNAAAiii---tttaaarrrgggeeettteeedddrrreeegggiiioononnsssaaannndddssseeeqqquuueeennncceceesssiiinnnAAATTTXXXNNN777...(A)SNP G/A indicates rs3774729.GiandAimeanRNAitargeting G andA respectively.(B)Theupperbox
TTTaaabbbllleee 222..P.PPrrriiimmmeeerrrsss fffooorrr ccclllooonnniininnggg ooofffhhhuuummmaanann UUU666 ppprrrooommomoottteeerrr aaannnddd sshshhRRRNNNAAA---eeexxxppprrreeessssssiiinnnggg vvveeecccttotoorrrsss...
hU6-SalI-BglII-Fw and one ofabove six primers are used togetherforcloning of shRNA-expressing vectors.Theunderlinesindicaterestriction enzymesitesand bold sequencesrepresenttargetsequencesforRNAi.Especially #5(targeting SNP G)and #6(targetingSNP A)aredesignedforallele-specificRNAi.
C C Clllaaassssssiififfiiicccaaatttiiiooonnn PPPrrriiimmmeeerrrNNNaaammmeee DDDNNNAAA SSSeeeqqquuueenennccceee(((55'5''→→→ 333'''))) hhhUUU666ppprrrooommmooottteeerrr h h hUUU666---FFFwww ((-(--333333222))) CCAGTGGAAAGACGCGCAGG h h hUUU666---RRRvv(v((+++111))) CACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG s s shhhRRRNNNAAA h h hUUU666---SSSaaalllIII--B-BBggglllIIIIII---FFFwww CATGTCGAC/AGATCTCCAGTGGAAAGACGCGCAGG A A ATTTXXXNNN777---RRNRNNAAAiii---###111 CGGTCTAGAAAAAAGACCGTCCCAGCATCACTCCAAGACTG AGCAAGCTTCCCCCCCCCCAAAGGGTTTCCCCCCTTTGGGAAAAAAGGGTTGTGGAAATTTGGGCCCTTTGGGGGGGGGAAACCCAAAGGGTTTCG GTGTTTCGTCCTTTCCACAA A A ATTTXXXNNN777---RRNRNNAAAiii---###222 CGGTCTAGAAAAAAGGAACTTGACGAAGACGCACTAAGAAC ACCAAGCTTCGGGTTTGGGTTTTTTCCCTTTTTTAAAGGGCCCGGGCCCAATATTCCCCCCTTTCCCAAATTCTCCAAAAAAGGGTTTTTTCCCCG GTGTTTCGTCCTTTCCACAA A A ATTTXXXNNN777---RRNRNNAAAiii---###333 CGGTCTAGAAAAAAGCAGTTCATCGGACTAGTGAACGAATG ACCAAGCTTCGGGCCCCCCAAATTTTTTCCCAAATTTTTTCCCAAACCCCCACAAGGGTTTCCCCCCAAAAATATTGGGAAAAAACCCTTTGGGCG GTGTTTCGTCCTTTCCACAA A A ATTTXXXNNN777---RRNRNNAAAiii---###444 CGGTCTAGAAAAAAGAGCGCTGAATGGAGATGTAACTTATC CTCAAGCTTCAAAGGGGGGAAACCCAAAAAAGGGTTTTTTAAACCCAAACCCCCCTTTCCCCCCAAACCCTTCTCCAAAGGGCCCAAACCCTTTCG GTGTTTCGTCCTTTCCACAA A A ATTTXXXNNN777---RRNRNNAAAiii---###555 CGGTCTAGAAAAAAGTGAACATTATTCACGGCCGGCACTTT AGCAAGCTTCCCCCCCAAAAAAAAAGGGTTTGGGCCCCCCAAAGGGCCCCCGCGGTTTGGGAAAAAACCCAAAAAATTTGGGTTTCCCCCCAAACG GTGTTTCGTCCTTTCCACAA A A ATTTXXXNNN777---RRNRNNAAAiii---###666 CGGTCTAGAAAAAAGTGAACATTATTCATGGCCGGCACTTT AGCAAGCTTCCCCCCCAAAAAAAAAGGGTTTGGGCCCCCCAAAGGGCCCCCACAATTTGGGAAAAAACCCAAAAAATTTGGGTTTCCCCCCAAACG GTGTTTCGTCCTTTCCACAA
FFFiiiggg...888...SScScchhheeemmmaaatttiiiccdcddiiiaaagggrrraaammmsssooofffssshhhRRRNNNAAA mmmooodddeeelllaaannnddd ooonnneeeooofffdddeeesssiiigggnnneeeddd ppprrriiimmmeeerrrsssfffooorrr ssshhhRRRNNNAAA...(A)Expressed RNA from shRNA-expressing vectoris formed to shRNA. Lateritiscleaved by Dicerand formed to siRNA.Alteration ofsequenceon sense strand can bepossiblebutthatofanti-sensestrand isnotpermitted asanti-sense strand is read by RISC.(B) shows ATXN7-RNAi-#5.Note thattargetsequence should be started with C because of transcription initiation with G (+1) in U6 promoter.
F FF...WWWeeesststteeerrrnnnbbblllooottttttiiinnnggg 배양세포는 진핵형질전환 24시간 후 또는 STS 처리 7시간 후 스크레이퍼 (scraper)로 긁어 획득하였다.세포를 모아 300g에서 5분간 원심분리하여 상층액 을 버리고 세포 침전물(pellet)을 PBS로 1회 씻어낸 후 다시 원심분리하여 세포 침전물만을 얻었다. 이렇게 획득한 세포에 60mm dish의 세포 당 50-100㎕ RIPA buffer(50mM Tris-HCl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% DOC(sodium deoxycholate), 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1/200 protease inhibitor cocktail(Sigma-AldrichCo.,St.Louis,Missouri,U.S.A))를 넣어 침전세포를 잘 풀어주었다.이후 얼음에 20분간 박아 용해(lysis)시킨 후 4℃,16,000g,20분의 조건으로 원심분리하여 비용해성 침전물과 상층액을 분리하여 따로 담아 얼음에 박아두었다.우선 상층액은 protein assay solution(Bio-Rad Co.,Hercules,CA, U.S.A)을 이용하여 단백질 정량에 사용하였다.Caspase-7등의 확인을 통해 세 포자멸사 정도를 분석할 시에만 이 상층액을 loading하는데 사용하였으며,5× SDS-PAGE loading buffer(Biosesang Co.,Seongnam,Korea)를 용액부피의 1/5 로 넣고 95℃에서 10분간 끓여 단백질을 변성시킨 후 사용하였다.Ataxin-7을 확인하는 데에는 비용해성 침전물을 사용하였다.비용해성 침전물에 20-30㎕ 1× SDS-PAGE loading buffer를 넣고 마찬가지로 끓여 단백질을 변성시킨 후 4℃, 16,000g,20분의 조건으로 다시 원심분리하여 침전물을 버리고 상층액만을 획득 하였다.단백질 정량은 생략하였으며 상층액에서 측정한 농도를 간접적으로 적용 해 농도를 동일하게 맞추어 loading하였다.
Ataxin-7의 확인에는 8% 아크릴아마이드 겔(acrylamidegel)을,Caspase-7, Bax,Bcl-xL의 확인에는 15% 겔을 사용하였다.Ataxin-7의 경우에는 비용해성 침전물로부터 획득한 단백질 용액 20-30㎕를 loading하되 측정한 상층액의 농도 에 따라 각 용액의 양을 조절해 각 샘플마다 동일한 단백질 량이 loading되도록 하였다.세포자멸사 지표 단백질 확인 실험에서는,Caspase-7과 Bcl-xL의 확인 을 위해 40㎍,Bax와 Actin의 확인을 위해 15㎍의 단백질을 loading하였다.
transfer에는 PVDF를 사용하였다.5% skim milk(PBS-T에 용해)를 이용해 1시 간 동안 blocking하였으며 1차 항체(antibody)는 4℃,overnight조건으로,2차 항 체는 실온,1시간 조건으로 부착시켰다.항체는 5% skim milk(PBS-T에 용해)에 희석하여 사용하였다. Ataxin-7에는 polyglutamine 항체(Chemicon Co., Temecular,CA,U.S.A,1:2500)를 사용하였으며 기타 cleaved Caspase-7,Bax, Bcl-xL 항체(Cellsignaling Co.,Danvers,MA,U.S.A,1:1000)와 Actin 항체 (SantaCruzCo.,SantaCruz,CA,U.S.A,1:1000)를 1차 항체로 사용하였다.2차 항체로는 단일클론(monoclonal)과 다클론(polyclonal) 항체(Santa Cruz Co., SantaCruz,CA,U.S.A,1:5000)를 1차 항체의 유래에 따라 사용하였다.Western blotdetectionkit으로는 Supexkit(NeuronexCo.,Pohang,Korea)을 사용하였다. 대조군으로 사용한 Actin은 Ataxin-7과 Bax를 우선 확인한 후 membrane을 strip하여 다시 Actin항체를 부착하여 확인하였다.
G
GG...공공공초초초점점점현현현미미미경경(경((cccooonnnfffooocccaaalllmmmiiicccrrrooosscsccooopppeee)))관관관찰찰찰
HeLa세포를 Lab-Tek chamberslide에서 배양하였고 Ataxin-7발현 벡터 와 shRNA 발현 벡터를 무게비 1:3의 비율로 co-transfection하였다.transfection 36시간 후,PBS로 1-2회 세척 후 4% paraformaldehyde(PBS에 용해)로 15분간 세포고정(fixation)을 하였고 이후 PBS로 각 5분간 3회 세척 후 0.2% Triton X-100(PBS에 용해)으로 10분간 permeabilization시켰다.이후 PBS로 각 5분간 3 회 세척 후 2.0㎍/ml의 DAPI(InvitrogenCo.,Carlsbad,CA,U.S.A)용액으로 빛 을 차단한 채 10분간 염색시켰다.PBS로 2-3회 세척 후 chamber를 떼어내고 Vectashield(VectorLaboratories Co.,Burlingame,CA,U.S.A)로 mounting하고 커버글라스를 덮어 관찰할 샘플을 완성하였다.이후 LSM510공초점현미경(Carl ZeissCo.,StandortGöttingen - Vertrieb,Germany)을 이용하여 680× oillens 조건으로 관찰하였다.
I
I
II
I
II
I
I.
.
.결
결
결 과
과
과
A AA...주주주요요요 SSSCCCAA 유A 유유형형형별별별 유유유병병병률률률(((ppprrreeevvvaaallleeennnccceee)))분분분석석석 SCA는 일반적으로 인구 10만명 당 3-7명꼴로 존재하는 것으로 알려져 있으 나 희귀질환으로서 유병률(prevalence)연구가 거시적이고 체계적으로 이루어진 곳은 많지 않다.더욱이 SCA는 인구집단(인종과 민족)에 따라 유병률이 상이해 다른 인구집단의 유병률을 각 인구집단에 그대로 적용하기는 힘들다.전 세계적 으로 29종의 SCA 중 SCA7은 약 3-5%를 차지하는 것으로 알려져 있다(Schӧls 등,2004).하지만 이것은 국내에 대한 통계가 반영이 안 된 것이다.이에 우선 현재까지 발표된 논문과 아주대학병원의 SCA 검사자료(2000-2007년도)를 분석 해 국내의 주요 SCA에 대한 유병률 조사를 하였으며 Table3.에 정리하였다.하 지만 이것은 엄밀히 말해 전체인구에 대한 유별률 조사라 할 수 없을 것이다.제 한된 자료로 단지 진단된 주요 SCA 환자의 수 및 SCA에서 각 유형이 차지하는 비율만을 조사할 수밖에 없었다.아주대학병원의 자료에서는 환자의 가계 수를 통계에 이용했다.분석결과,한국에서 SCA7이 다른 나라에 비해 상대적으로 높 게 나타남을 확인할 수 있었다. B BB...SSSCCCAAA777환환환자자자 조조조직직직별별별 CCCAAAGGG 반반반복복복서서서열열열 수수수 분분분석석석 시신을 기증한 부녀 환자의 검체를 통해 SCA7에 대한 분자유전학적 검사와 SCA7환자의 조직에 따른 CAG 반복서열의 수에 대한 차이를 조사하고자 환자 의 각 조직에서 유전체 DNA를 뽑아 검사하였다.Genescan 분석결과,환자 부 는 41개 CAG를 보유하였으며 환자 녀는 51-57개 CAG를 보유하여 세대를 거듭 할수록 CAG 수가 늘어나는 anticipation및 dynamicmutation현상을 확인할 수 있었다(Fig.9.,Fig.10.).환자 부에서는 각 조직에서 거의 동일한 peak가 관찰되 어 특별한 체세포섞임증(somatic mosaicism)양상을 확인할 수 없었으나 환자 녀에서는 조직에 따라 서로 다른 peak양상이 일부 관찰되어 체세포섞임증 양상 을 유추해 볼 수 있었다.TTTaaabbbllleee333...PPPrrreeevvvaaallleeennnccceeeooofffSSSCCCAAA sssuuubbbtttyyyppepeesssiiinnnKKKooorrreeeaaa,,,JJJaaapppaanannaaannndddwwwooorrlrlldddwwwiiidddeee...
Subtype Jin et al.18) Kim et al.22) Lee et al.26) Bang et al.2) This study Korean
total Japanese 30) Worldwide38) SCA1 0% (0) 4.0% (3) 2.4% (6) 3.0% (2) 1.2% (2) 2.0% 5.5% 10% SCA2 12.6% (11) 14.5% (11) 6.7% (17) 4.5% (3) 6.0% (10) 8.0% 2.4% 10% SCA3 4.6% (4) 15.8% (12) 5.9% (15) 14.9% (10) 10.2% (17) 8.9% 27.6% 29% SCA6 6.9% (6) 2.6% (2) 4.0% (10) 14.9% (10) 6.6% (11) 6.0% 25.5% 13% SCA7 0% (0) 2.6% (2) 1.6% (4) 16.4% (11) 6.6% (11) 4.3% 0% 3% Unknown or Rare 75.9% (66) 60.5% (46) 79.4% (201) 6.3% (31) 69.5% (116) 71.1% 39.1% 35% Total No. of Study 87 76 253 67 167 650 330 1429
FFFiiiggg...999...AAnAnnaaalllyyysssiiisss oofoffCCCAAAGGG rrreeepppeeeaaatttsss aaaccccccooorrrdddiiinnnggg tttooo ttitiissssssuuueee tttyyyppepeesss iiinnn SSSCCCAAA777 pppaaatttiiieeennnttt '''FFFaaatththheeerrr'''dddooonnnaaattitiinnnggg hhhiiisssbbboooddydyyfffooorrrooouuurrrssstttuuudddyyy...
FFFiiiggg...111000...AAAnnnaaalllyyysssiiiss osoofffCCCAAAGGG rrreeepppeeeaaatttsss aaaccccccoororrdddiiinnnggg tttooo tttiiissssssuuueee tttyyypppeeesss iiinnn SSSCCCAAA777 pppaaatttiiieeennnttt '''DDDaaauuuggghhhttteeerrr'''dddooonnnaaatttiiinnnggg hhheeerrrbbbooodddyyy fffooorrrooouuurrrssstttuuudddyyy...Somaticmosaicism ofCAG repeats
C
CC...AAATTTXXXNNN777유유유전전전자자자의의의 두두두 SSSNNNPPP 타타타입입입 분분분석석석
ATXN7유전자에는 엑손에만 총 12개의 SNP 타입이 존재하며 이 중 치료 를 위한 SNP 선별적 RNAi의 적용에 비교적 적합한 SNP 타입은 2개(rs3774729, rs13272)로 보여 진다.엑손 12에 존재하는 rs3774729는 중국인에서 A(adenine) 와 G(guanine)가 약 5.6:4.4의 비율로 존재하고 일본인에서는 A와 G가 약 4:6의 비율로 존재하며,엑손 13에 존재하는 rs13272는 중국인에서 G와 A가 약 6.4:3.6, 일본인에서는 G와 A가 약 4.4:5.6의 비율로 존재해 둘 모두는 각 인구집단에서 A와 G의 빈도에 있어서 서로 유사하며 SNP(또는 대립유전자)의 이형접합 (heterozygote)일 확률이 높아 선별적 RNAi의 타깃으로 적합하다고 보여 진다 (CHIP Bioinformatics Tools- http://snpper.chip.org/의 통계 참조).하지만 이 두 SNP 타입에 있어서 한국인에 대한 자료는 부족하여 돌연변이 대립유전자 특 이적 RNAi를 적용하기에 앞서 16명의 SCA7환자들의 혈액검체를 통해 한국인 을 대상으로 두 SNP 타입을 분석하기로 하였다. 염기서열분석 결과,각 SNP 타입별로 두 가지 유형이 관찰되었다(Fig.11.). 분석결과 중국인과 일본인의 SNP 비율과는 모두 확연히 다른 결과가 나타났다. rs3774729의 경우 한국인 SCA7환자에서는 G와 A가 약 1.6:8.4의 비율로 나타났 으며,rs13272의 경우에는 반대로 G와 A가 8.4:1.6의 비율로 나타났다(Table4.). 일본인과 중국인에서 보다는 한국인 SCA7환자에서 두 SNP가 한 쪽으로 편중 (84%)되어 있었다.조사한 두 SNP 양상으로만 판단했을 때 한민족은 일본 민족 보다는 중국의 한족과 더 가까운 것으로 보여 진다(Fig.12.).놀라운 것은 조사 된 SCA7환자 모두에서 rs3774729의 A와 rs13272의 G가 관찰되었다는 점이다. 또한 rs3774729의 A/A와 rs13272의 G/G,rs3774729의 G/A와 rs13272의 G/A가 공존하고 있는 것도 눈여겨 볼만 하다.분석결과,두 SNP 타입에서 이형접합률 (heterozygosity)은 모두 31.3%로 나타났는데,이는 31.3%의 SCA7환자를 대상 으로 돌연변이 대립유전자 특이적 RNAi치료가 가능하다는 것을 의미한다.돌연 변이 특이적 대립유전자 억제 RNAi의 적용이 가능한 환자(두 SNP에 대한 이형 접합자)를 Table4.에서 굵은 글씨로 표시하였다.
FFFiiiggg...111111..T.TTwwwooo tttyyypppeeesssooofffssseeeqqquuueenennccciiinnnggg dddaaatttaaa oooffftttwwwooo SSSNNNPPP tttyyypppeeessisiinnnAAATTTXXXNNN777fffrrrooommm 111666 KKKooorrreeeaaannnSSSCCCAAA777pppaaatttiiieeennntttsss...
TTTaaabbbllleee444..A.AAnnnaaalllyyysssiiisssoooffftttwwwoooSSSNNPNPP tttyyypppeeesssiiinnnAAATTTXXXNNN777oofoff111666KKKooorrreeeaaannnSSSCCCAAA777pppaatattiiieeennntttsss...
SNP(rs3774729)inexon12 SNP(rs13272)inexon13 P P Paaatttiiieeennnttt111 GGG ///AAA GGG ///AAA P P Paaatttiiieeennnttt222 GGG ///AAA GGG ///AAA Patient3 A /A G /G Patient4 A /A G /G Patient5 A /A G /G P P Paaatttiiieeennnttt666 GGG ///AAA GGG ///AAA Patient7 A /A G /G Patient8 A /A G /G P P Paaatttiiieeennnttt999 GGG ///AAA GGG ///AAA Patient10 A /A G /G Patient11 A /A G /G PPPaaatttiiieeennnttt112122 GGG ///AAA GGG ///AAA Patient13 A /A G /G Patient14 A /A G /G Patient14 A /A G /G Patient16 A /A G /G
Total G:5(15.6%),A:27(84.4%) G:27(84.4%),A:5(15.6%)
Bold letters indicate heterozygotes who are appropriate for allele-specifc RNAi. Heterozygosityis31.3% inbothofSNP types.
FFFiiiggg...111222..D.DDiiissstttrrriiibbbuututtiiiooonnn ccchhhaaarrrtttsss ooofff222 SSSNNNPPP tttyyypppeeesss iiinnnAAATTTXXXNNN777aaaccccccooorrrdddiiinnnggg tttooo KKKooorrreeeaaannn (((SSSCCCAAA777pppaaatttiiieeennntttsss))),,,CCChhhiiinnneeessesee(((HHHaaannrnrraaaccceee)))aaannndddJJJaaappapaannnssseee...
D
DD...AAAtttaaaxxxiiinnn---777과과 s과 sshhhRRRNNNAAA 발발발현현현 벡벡벡터터터 제제제작작작
폴리글루타민 확장성 Ataxin-7발현 세포모델 확립을 위하여 pEYFP-C1벡 터를 이용하여 Ataxin-7발현 벡터를 제작하였으며 10개 CAG,55개 CAG에 따 라 각각 SNP(rs3774729)G와 A를 모두 갖는 총 4종의 벡터를 최종적으로 제작 하였다(Fig.13.).pEYFP-C1벡터는 특정 유전자를 삽입 시 원하는 단백질에 추 가적으로 YFP 형광단백질이 붙어 발현되도록 고안된 벡터로 진핵형질전환 후 진핵형질전환율 확인 및 세포 내 단백질의 위치 추적이 가능한 장점을 지니나 YFP 단백질이 붙어 본래의 단백질의 성질이 일부 변할 수 있다는 단점도 갖는 다.많은 연구결과 Ataxin-7이 N 말단과 가까운 위치에서 잘리어 N 말단 쪽의 폴리글루타민 부위가 세포독성을 유발한다고 보고하고 있다(Young등,2007).따 라서 Ataxin-7의 N 말단과 가까운 부위를 추적 관찰하는 것이 보다 유용하다고 판단되어 Ataxin-7의 N 말단에 YFP를 부착시키는 pEYFP-C1벡터를 이용하였 다.
RNAi를 위해 siRNA를 이용할 수도 있으나 보다 저렴하고 안정적인 발현을 위해 shRNA를 이용하기로 하였으며 이를 위해 #1-#6 부위를 타깃으로 하는 shRNA 발현 벡터를 제작하였다(Fig.7.,Fig.13.).shRNA 발현을 위해 발현률 이 높은 인간의 U6프로모터를 이용하였으며 높은 발현을 위해 -332부위부터 벡터에 포함시켰다.
E
EE...돌돌돌연연연변변변이이이 대대대립립립유유유전전전자자자 비비비선선선별별별적적적 RRRNNNAAAiii의의의 효효효과과과 확확확인인인
우선 돌연변이 대립유전자 비선별적 RNAi의 효과를 Western blotting으로 확인하였다.계획한 RNAi의 타깃부위는 총 4곳이었으며(Fig.7.),이 중 #2부위 를 타깃으로 하는 shRNA가 가장 효과적으로 Ataxin-7을 감소시키는 것으로 확 인되었다(Fig.14.).Ataxin-7 발현 벡터와 RNAi벡터를 1:1.5의 무게(㎍)비로 HeLa 세포주에 co-transfection하였으며 transfection 24시간 후 세포를 모아 Western blotting하였다.RNAi의 음성대조군(negativecontrol)에는 pREP4벡터 를 사용하였다.
FFFiiiggg...111333..S.SSccchhheeemmmaaatttiicicc dddiiiaaagggrrraaammmsss ooofff AAAtttaaaxxxiiinnn---777---eeexxxpprprreeessssssiiinnnggg vveveeccctttooorrr (((AAA))) aaannnddd RRRNNNAAAiii iiinnnddduucucciiinnnggg vveveeccctttooorrr(((BBB)))...
FFFiiiggg...111444...EEfEfffffeeecctcttooofffmmmuuutttaaannntttaaalllllleeellleee---nnnooonnnssspppeeeccciiifffiiicccRRRNNNAAiAii(((###111---###444)))ooonnn WWWeeesssttteeerrrnn bnbblllooottttttiiinnnggg iiinnnHHHeeeLLLaaa...These2datashow RNAi#2ismosteffectiveforknockingdownAtaxin-7. pREP4wasusedfornegativecontrolofRNAi.
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FF...돌돌돌연연연변변변이이 대이 대대립립립유유유전전전자자자 선선별선별별적적적 RRRNNNAAAiii의의의 효효효과과과 확확확인인인
치료법으로 보다 안전한 돌연변이 대립유전자 선별적 RNAi의 효과를 알아 보기 위해 마찬가지로 Western blotting을 실시하였다.Western blotting 결과, RNAi기전이 SNP(rs3774729)를 인지하고 작동하여 Ataxin-7의 감소를 유도함 을 확인할 수 있었다(Fig.15.).흥미롭게도 한 염기만 차이가 나고 나머지는 동 일한 타깃임에도 불구하고 G를 타깃으로 하였을 때보다 A를 타깃으로 하였을 때 RNAi의 효과가 보다 크게 나타났다(Fig.15).Ataxin-7 발현 벡터와 RNAi 벡터는 1:1.5의 무게(㎍)비를 적용하여 HeLa세포주에 co-transfection하였으며 transfection 24시간 후 세포를 모아 Western blotting하였다.RNAi의 음성대조 군(negativecontrol)에는 pREP4벡터를 사용하였다.
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GG...공공공초초초점점점현현현미미미경경경(((cccooonnnfffooocccaalallmmmiiicccrrrooossscccoooppepee)))을을을 통통통한한한 RRRNNNAAAiii의 효의의 효효과과과 확확확인인인
SCA7은 폴리글루타민 질환으로 핵내포함체(intranuclearinclusion body)또 는 응집(aggregation)이 주요 특징이다.RNAi의 효과를 Westernblotting을 통해 확인하였지만 직접 세포 내에서 Ataxin-7의 발현 및 응집의 감소정도를 확인하 는 것도 의미 있으리라 판단되어 공초점현미경(confocalmicroscope)을 이용하여 관찰하였다.발현시킨 Ataxin-7은 55Q와 SNP(rs3774729)A를 가진 단백질로 실 험결과 대조군(pREP4 벡터 상용)에서는 눈에 띠는 응집과 Ataxin-7 단백질이 많이 관찰되었다(Fig.16.).SNP G를 타깃(RNAi#5)으로 하였을 때는 대조군에 비해 적은 양의 감소가 있는 듯 보였으나 눈에 띠는 확연한 감소는 없었다(Fig. 16.).반면 SNP 비특이적 ATXN7RNAi#2와 SNP A를 타깃으로 하는 #6을 처 리하였을 때는 Ataxin-7(55Q,A)-YFP의 발현량이 감소된 양상이 상대적으로 많 이 관찰되었다(Fig.16.).Ataxin-7과 RNAi벡터의 무게비를 1:3으로 적용하여 HeLa 세포에 co-transfection하였으며,transfection 36시간 후 세포를 고정하고 DAPI로 핵을 염색하여 680배 oillens로 관찰하였다.
FFFiiiggg...111555...EEfEfffffeeecctcttooofffmmmuuutttaaannntttaaalllllleeellleee---ssspppeeeccciiifffiiicccRRRNNNAAAiii(((###555,,,###666)))ooonnn WWWeeesssttteeerrrnnn bbblllooottttttiiinnnggg iiinnn HHHeeeLLLaaa... These 2 data show RNAi #5 and #6 suppressed mutant Ataxin-7 by allele-specific manner.pREP4 was used fornegative controlofRNAi.Interestingly RNAitargetingA wasmoreeffectivethanRNAitargetingG.
FFFiiiggg...111666...EEEffffffeeeccctttsss ooofff222 RRRNNNAAAiiisssyyysssttteeemmmsss ooonnn cccooonnnfffooocccaaalllmmmiiicccrrrooossscccooopppyyy iiinnn HHHeeeLLLaaa...Both of allele-nonspecific and allele-specific RNAi suppressed mutant Ataxin-7 and intranuclearinclusionbodies.pREP4wasusedfornegativecontrolofRNAi.
