Time (hr)
20 40 60 80 100
B e ta -1 ,3 -g lu c a n ( g /L )
0 10 20 30 40 50 60 70
UDP-glucose concentration (g/L)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Beta-1,3-glucan 4.0
UDP-glucose pH 7.0->5.5
Figure. 14. Change of beta-1,3-glucan and UDP-glucose in a batch fermenter(pH 5.5)
라 라
라...pppHHH 변변변화화화에에에 따따따른른른 UUUDDDPPP---gggllluuucccooossseee농농농도도도 변변변화화화
β-1,3-glucan을 생산하는 과정에서 pH에 의한 UDP-glucose농도 변화를 살펴보기 위해 Figure.15.에 비교하였다.질소원이 고갈되어 UDP-glucose 농도가 감소하는 지점부터 공정을 마치는 시간까지 데이터를 분석하였다.pH 를 7.0으로 고정하여 운전한 공정에서는 UDP-glucose농도가 낮게 나타났으 며,pH를 β-1,3-glucan생산 최적 조건인 5.5로 조절하여 β-1,3-glucan생산 을 유도한 공정에서는 UDP-glucose농도가 높게 나타났다.또한,pH를 5.5로 조절한 시점부터 UDP-glucose농도가 증가함으로써 β-1,3-glucan생산에 높 은 활성을 갖게 되었고 pH에 의한 23g/L의 생산성 차이를 보여주고 있다.
Time (hr)
20 40 60 80 100
U D P -g lu c o s e c o n c e n tr a ti o n ( g /L )
0 1 2 3 4
Batch pH 7.0 Batch pH 7.0-> 5.5 pH 7.0->5.5
Figure.15.ChangeofUDP-glucoseinbeta-1,3-glucan productionlevel
3 3
3...222단단단 연연연속속속배배배양양양 공공공정정정에에에서서서의의의 UUUDDDPPP---gggllluuucccooossseee농농농도도도 변변변화화화
회분식 배양 공정에서는 단일 반응기에서 세포 성장과 β-1,3-glucan 생산 공정을 모두 운전하였다.그러나 세포 배양 공정과 β-1,3-glucan생산 공정의 환경이 서로 다른 점을 감안하여 2단 연속 배양 공정을 도입하였다.첫 번째 반응기에서는 세포성장에 최적인 조건으로 배양하고 두 번째 반응기에서는 질소원이 고갈된 조건에서 β-1,3-glucan생산에 최적인 조건으로 제어하여 β -1,3-glucan 생산성을 최적화 하고자 하였다.또한,2단 연속 배양 공정으로 운전 하였을 때의 UDP-glucose농도를 측정함으로써 회분식 배양 공정과 연 속 배양 공정에서의 농도 차이를 살펴보았다.
β-1,3-glucan을 생산하기 위하여 세포는 sp.ATCC31750을 사용하였고,배지는 회분식 배양 공정에서와 같은 조성으로 사용하였다.2단 연속 배양 공정을 위하여 20L의 유리 기질 주입 탱크를 사용하였으며 정량 펌프를 이용하여 기질 주입 속도를 조절 하였다.1streactor는 세포 배양 공 정으로 최적 pH 7.0으로 유지하며 2L workingvolume으로 운전하였다.2nd reactor는 β-1,3-glucan 생산 공정으로써 최적 pH를 5.5로 유지하며 4 L workingvolume으로 유지하며 운전하였다.
UDP-glucose 농도 측정은 YMC-Pack pro C18 column을 이용한 RP-HPLC를 이용하여 UV 파장 254nm,이동상의 유속 1.0ml/min로 흘려 주며 등용매 용리 법을 이용하여 분석하였다.시료의 전 처리는 세포 농도 2 g/L로 취하여 증류수 0.5ml를 첨가한 후 4℃ 12,000rpm에서 10hr원심분 리 한 후 상등액을 버리고 50mM phosphatebuffersolution을 이용하여 2회 세척하였다.이를 얼음물에 넣고 sonication 한 후 4℃ 얼음물에 30min 보 관하였다.4℃ 12,000rpm에서 10min 원심분리를 함으로써 파괴된 세포벽 과 이물질을 모두 제거한 후 상등액을 0.2 μm filter를 이용해 다시 한번 이물 질을 제거하고 주입 시료로 사용하였다.
가 가
가...세세세포포포 배배배양양양조조조에에에서서서 UUUDDDPPP---gggllluuucccooossseee농농농도도도 변변변화화화
1streactor는 세포 배양 공정으로써 cellmass와 β-1,3-glucan생산량 그 리고 UDP-glucose농도를 Figure.16.에 나타내었다.세포 접종 후 질소원 이 고갈되어 가는 시점인 31hr부터 연속 배양 공정으로 운전 하였다.초기 세포 농도가 증가함에 따라 UDP-glucose농도가 크게 증가하다 질소원이 고 갈되는 지점에서 농도가 감소함을 보이고 있으며,연속배양으로 운전을 전환 하고 질소원을 주입함으로써 세포 성장을 유도하여 UDP-glucose농도가 크 게 감소하지 않고 일정한 농도를 유지 하고 있음을 알 수 있다.
UDP-glucose 농도가 일정하게 유지 되는 때부터 β-1,3-glucan의 생산량이 일정하게 유지 되는데 이는 생산성에 대한 활성의 유지로 볼 수 있겠다.
Figure.17.은 질소원이 고갈되기 전 연속공정으로 전환한 시점에서의 크로마 토그램을 나타내었다.
Time ( hr )
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
C e ll a n d B e ta -1 ,3 -g lu c a n ( g /L )
0 5 10 15 20 25 30
UDP-glucose (g/L)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 Cell
Beta-1,3-glucan UDP-glucose
CSTR
in
나 나
나...ββββ---111,,,333---gggllluuucccaaannn생생생산산산조조조에에에서서서 UUUDDDPPP---gggllluuucccooossseee농농농도도도 변변변화화화
2nd reactor는 β-1,3-glucan 생산을 유도하기 위해 pH 5.5,4 L working volume으로 운전을 하였으며,Figure.18.에 나타내었다.세포가 성장하는 과 정에서 UDP-glucose농도가 증가하였고 1streactor에서 넘어오는 세포에 의 해서 UDP-glucose농도가 감소하지 않고 증가하는 현상을 보이고 있다.β -1,3-glucan이 생성되는 초기 지점에서 높은 농도를 보이고 있으며,β -1,3-glucan생산이 일정하게 유지 되는 부분에서는 UDP-glucose농도가 조 금 감소함으로써 β-1,3-glucan 생산 활성이 감소하고 있음을 보여주고 있다.
Figure.19.은 40hr때의 크로마토그램을 나타내고 있다.β-1,3-glucan을 생 산하면서 잔여 피크가 더 생성됨을 볼 수 있는데,이는 β-1,3-glucan을 생산 하는 과정에서 대사 물질들의 생성을 의미 하며 더 높은 수득율을 얻기 위해 서 제거해야 할 부가반응으로 사료된다.
Time ( hr )
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
C e ll a n d B e ta -1 ,3 -g lu c a n ( g /L )
0 5 10 15 20 25 30
UDP-glucose (g/L)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Cell 1.6
Beta-1,3-glucan UDP-glucose
CSTR
Figure. 18. Change of cell mass, beta-1,3-glucan and UDP-glucose concentrationin2ndreactor.
4 4
4...회회회분분분식식식 배배배양양양 공공공정정정에에에서서서 탄탄탄소소소원원원 및및및 uuurrraaaccciiilll첨첨첨가가가에에에 의의의한한한 영영영향향향
회분식 배양 공정에서 sp.ATCC31750균주를 이용하여 β -1,3-glucan 합성 대사 경로를 추정한 Figure.1.을 보면,sucrose를 glucose 로 분해하고 UDP-glucose를 거쳐 β-1,3-glucan을 합성하게 된다.이에 탄소 원으로 sugar와 glucose로 구분하여 세포 성장성과 β-1,3-glucan 생산성,그 리고 uracil을 첨가 하였을 때의 UDP-glucose를 측정함으로써 β-1,3-glucan 생산 효율에 미치는 영향을 살펴보았다.
가 가
가...ββββ---111,,,333---gggllluuucccaaannn생생생산산산 공공공정정정에에에서서서 탄탄탄소소소원원원에에에 따따따른른른 UUUDDDPPP---gggllluuucccooossseee농농농도도도 변변변화화화 회분식 배양 공정에서 β-1,3-glucan을 생산하기 위하여 탄소원으로 sugar 와 glucose를 이용하였다.각각 100g/L의 농도로 주입하여 공정을 운전하였 으며,초기 pH는 세포 성장 최적 조건인 7.0으로 운전하고 질소원이 고갈되 어 β-1,3-glucan이 합성되는 시점에 pH를 β-1,3-glucan 생산 최적 조건인 pH 5.5로 조절함으로써 β-1,3-glucan생산을 유도하였다.두 회분식 배양 공 정의 조작은 동일한 방법으로 운전하였다.
Figure.20.은 탄소원으로 sugar를 이용하였고 회분식 배양 공정을 통해 β -1,3-glucan을 생산한 공정의 데이터이다.Figure.21.은 glucose를 탄소원으 로 이용한 공정이다.탄소원의 변화에 따라 세포 성장성이 달랐으며,β -1,3-glucan생산에도 영향을 미침을 알 수 있다.Sugar를 이용한 배양 공정 에서는 26hr에 6g/L의 세포 농도를 보이고 있으나 glucose를 이용한 배양 공정에서는 세포의 성장 기간이 6hr이 더 길고,생산성도 낮음을 알 수 있 다.이는 세포의 대사 경로에서 sugar가 세포의 배양 활성에 glucose보다 더
-1,3-glucan생산 활성이 좋은 시점에서는 UDP-glucose농도가 높게 측정이 되었고 활성이 감소하는 지점에서는 농도가 낮게 검출됨을 통해 UDP-glucose농도가 β-1,3-glucan 생산 활성에 높은 영향을 미치고 있음을 알 수 있었다.
나 나
나...UUUrrraaaccciiilll첨첨첨가가가에에에 따따따른른른 ββββ---111,,,333---gggllluuucccaaannn생생생산산산 효효효율율율
탄소원을 다르게 하여 배양한 두 공정에 UDP-glucose전구물질로 알려진 uracil을 첨가함으로 인해 UDP-glucose농도 변화와 β-1,3-glucan 생산성에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다.
β-1,3-glucan생산 활성이 감소하는 지점인 84hr때에 uracil농도 0.5g/L 로 제조하여 멸균 후 발효 중인 공정에 첨가 하였다.uracil의 첨가로 인해 UDP-glucose농도가 큰 폭으로 증가하였음을 Figure.20,21.을 통해 알 수 있었다.또한,β-1,3-glucan의 생산 활성이 감소하는 시점에 uracil에 의해 β -1,3-glucan의 생산성이 sugar를 이용한 발효조는 12.5 g/L 증가 하였고, glucose를 이용한 발효조는 16g/L 의 증가된 생산성을 나타내고 있다.전구 물질로 사용한 uracil의 영향으로 인해 UDP-glucose농도가 증가하였고,이 를 통해 β-1,3-glucan의 생산성도 각각 21.6,34.3%에 가까운 높은 영향을 받게 됨을 알 수 있었다.
Time (hr)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
C e ll a n d B e ta -1 ,3 -g lu c a n ( g /L )
0 20 40 60 80
UDP-glucose (g/L)
0 1 2 3 4 Cell mass 5
Beta-1,3-glucan UDP-glucose
Uracil 0.5 g/L
Figure.20.Cellmass,beta-1,3-glucan and UDP-glucose concentrations profilesinabatchfermentationprocess.
Time (hr)
0 20 40 60 80 100 120 140 160
C e ll a n d B e ta -1 ,3 -g lu c a n ( g /L )
0 20 40 60 80
UDP-glucose (g/L)
0 1 2 3 4 Cell mass 5
Beta-1,3-glucan UDP-glucose
Uracil 0.5 g/L
Figure.21.Cellmass,beta-1,3-glucan and UDP-glucose concentrations profilesinabatchfermentationprocess.
Table 5.β-1,3-glucan productivity in a batch process and efficiency by uraciladdition.
CCCaaarrrbbbooonnnsssooouuurrrccceee BBBaaatttccchhhppprrroooccceeessssss
UUUrrraaaccciiilllaaaddddddiiitttiiiooonnn (((000...555ggg///LLL)))iiinnn b
b
baaatttccchhhppprrroooccceeessssss I I
Immmppprrrooovvveeemmmeeennnttt (((%%%)))
S S
Suuugggaaarrr 57.9g/L 70.4g/L 21.6%
G G
Gllluuucccooossseee 46.7g/L 62.7g/L 34.3%
I I IVVV...결결결론론론
sp.ATCC31750을 이용한 생체 고분자 물질인 β-1, 3-glucan을 생산하는 공정에서 주요 대사 물질로 추정하는 UDP-glucose농도 를 측정함으로써 β-1,3-glucan의 생산 활성에 어떠한 영향을 미치는지 살펴 보았다.본 연구를 통해 아직은 미미하지만 더 많은 대사 물질을 분석해 내고 농도를 측정함으로써 이론적 대사 경로를 규명하고 균주 개선을 통해 더 높 은 수득율을 얻을 수 있는 기반을 마련하였다.
1.HPLC를 이용하여 주요 대사물질인 UDP-glucose 농도를 측정하였다.
YMC Pack-proC18column을 이용하여 등용매 용리법을 통해 이동상의 조 성을 살펴 본 결과 50mM Phosphatebuffersolution(pH 5.3)을 이용하였을 때 분리능이 우수하였다.분리 시간과 검출되어지는 면적을 살펴보았을 때 1 ml/min의 유속으로 이동상을 흘려주며,254nm에서 UV detector를 이용하여 UDP-glucose농도를 측정하였을 때 가장 좋은 검출 감도를 나타내었다.
2. sp.ATCC31750균주를 이용하여 β-1,3-glucan을 생산하는 배양 공정에서의 UDP-glucose농도를 측정함으로써 β-1,3-glucan생산 활성 에 미치는 영향을 살펴보았다.세포가 증식하는 단계에서 UDP-glucose농도 도 증가함을 알 수 있었으며,질소원이 고갈되는 시점에서는 UDP-glucose 농도가 감소하였다.그러나 pH에 따라 다른 경향을 볼 수 있었는데 세포 배 양 최적 pH인 7.0으로 유지한 배양 공정에서는 β-1,3-glucan을 생산하기 시 작하는 지점 즉,UDP-glucose농도가 증가하는 시점까지 많은 시간이 소요 되었으며 생산성도 0.41 g/L․hr로 낮았다. 그러나 세포 배양 후 β -1,3-glucan생산 조건인 pH 5.5로 조절해 준 공정에서는 질소원이 고갈되는 시점에서 UDP-glucose농도가 감소하였지만 pH 조절 후 바로 UDP-glucose 농도가 증가하면서 β-1,3-glucan이 생성되기 시작하였다.이때의 생산성도