0 200 400 600 800 1000
BW 250 µµµµg/ml Con A 1µµµµg/ml
BW/i.n. 2µµµµg
BW/i.n. 20 µµµµg
BW/i.n. sham
Fig.17.
Fig.17. Fig.17.
Fig.17. TGF-TGF-TGF-TGF-ββββ production production production from production from from from splenocytes splenocytes splenocytes at splenocytes at at 4th at 4th 4th week 4th week week in week in in in experiment experiment experiment B.experiment B.B. B.
Spleen cells from buckwheat allergic mice(n=2) and cholera toxin control mice(n=2)were stimulated with 250 ㎍/mL ofcrude buckwheatextracts,or with Con A.The cells cultured withoutany stimulation were served as a negative control.Levels of TGF-β were determined by in 3 day-culture supernatantbyELISA.Datawasgivenasmean±SE.
I
I IV V V. . .고 고 고 찰 찰 찰
메밀에 대한 감작은 대개는 섭취를 통해서 이뤄지며(Wieslander,1996;
Smith,1909;Kwon과 Lee,1985;Park등,2000;Kondo등,1993),메밀알레르기 와 관련된 임상 보고서와 논문이 지난 30년 동안 주로 아시아와 유럽에서 보고 되어왔다.그러나 역학적 연구의 부족으로 인해 유병률이나 발생률을 알기가 어 려운 실정이다.우리나라에서 메밀가루는 학동기와 어른에서 중요한 식품 항원 중의 하나이고,피부단자시험에서 메밀에 대한 양성률은 약 5%이나(Lee와 Kim, 1988),영양학적인 장점 때문에 건강식품으로 메밀의 섭취요구가 증가하고 있다.
몇몇 메밀에 대한 과민반응에 대한 증례보고는 우리나라에서(Kwon과 Lee,1985;
Lee등,2001;Park과 Nahm,1996),일본에서(Matsumura등,1964),더 최근에는 유럽에서(Schiffner등,2001)보고 되어 왔다.땅콩알레르기에서와 같이 메밀에 대한 알레르기 반응은 종종 심하고 때때로는 거의 치명적인데,Lee등의 연구에 의하면 밀이나 쌀과 어느 정도 교차항원이 있음을 알 수 있었다(Lee등,1993).
그러나 메밀알레르기에 대한 면역학적인,임상적인 연구들이 부족하다.따라서 메밀알레르기와 같은 식품 알레르기의 면역병인을 규명하고,면역 관용의 유도를 위한 면역치료제 개발 및 방법 등의 연구를 위해 사람의 면역학적 특징과 유사 한 동물모델을 사용한다면,인체를 이용한 연구를 직접 시행한다는 윤리적인 문 제가 없이 다양한 대조군과 다양한 방법을 이용한 연구를 할 수 있다.외국에서 는 오래전부터 동물모델을 이용한 알레르기 질환의 연구가 활발하였으나 주로 천식에 대한 연구들이었으며,경구 감작에 의한 식품 알레르기의 동물모델은 1997년 이후부터 보고 되기 시작하였으며,이들 연구는 난알부민(ovalbumin,이 하 OVA)과 우유 단백(beta-lactoglobulin,이하 BLG)에 의한 식품 알레르기 동 물모델이었다.국내에서는 Lee가 공동 개발하여 보고한 땅콩알레르기의 동물모델 이 있다(Li등,2000).본 연구는 메밀알레르기 동물모델로는 첫 보고이다.
소화관 과민증(guthypersensitivity)에 대한 연구는 이미 1980년대 초부터 활발하였는데,능동 감작(activesensitization)과 수동 감작(passivesensitization)
에 대한 연구가 진행되었고,주로 이용한 항원은 BLG와 OVA였다.OVA를 이용 한 쥐(rat)모델에서 수동적 피부 아나필락시(passivecutaneousanaphylaxis)반 응과 생리반응이 항원 특이 IgE의 생성 정도와 비례한다는 연구가 있은 후,IgE 생성을 유도하는 동물모델을 확립하려는 시도가 활발해 졌다(Crowe와 Perdue, 1992).1990년대 초반 이전의 연구는 주로 쥐(rat)와 돼지쥐(guineapig)에서 식품 항원 특이 IgE,IgG 및 IgA 항체의 생성 유도에 관련된 연구와 항원 유발 시험 에 의한 생체반응,항원 운반,장 점막의 분비능 및 투과성,장운동,조직학적 변 화 등에 초점을 둔 연구들이었고,이후에는 주로 쥐와 생쥐모델을 이용한 면역병 리학적 연구가 시작되었다.식품 알레르기 연구에 있어 생쥐모델에 역점을 두어 개발하는 이유는 생쥐의 조직이나 세포 및 이와 관련한 면역물질의 개발이 급속 히 발전하고 있어 시약이나 kit의 구입이 용이하고,사육과 희생 시에 조작이 쉬 워 실험하기가 적절하기 때문이다.더욱이 다양한 transgenic mice(cytokine knockoutmice,IgE deficientmice,enzymedeficientmice등)의 생산에 힘입어 면역 및 분자생물학적 연구에 박차를 가하고 있다.그러나 아직도 사람과 유사한 생쥐모델의 개발하는데 여러 어려움이 있는데 가장 큰 방해 요소는 경구 투여된 항원에 대한 타고난 면역관용 경향이 있다는 것이다(Ngan과 Kind, 1978;
Mowat,1987;Stroke등,1987;Melamad와 Friedman,1994).경구 면역관용(oral tolerance)이란 이전에 먹었던 식품항원의 경구투여로 알레르기를 유발시켰을 때 특정한 면역반응이 일어나지 않은 것으로 정의된다(Garside 등,1999;Weiner, 1997).동물모델에서 경구 면역관용의 가장 흔한 T세포 관련 기전으로는 clonal anergy,clonaldeletion,조절 T세포(regulatory T cell)의 유도가 있으며,특히 조절 T 세포는 다양한 사이토카인의 영향을 받는다(Smith 등,2000).물론 이러 한 기전이 경구 면역관용에서 모두 다 나타나는 것은 아니며,쥐의 품종(Ito등, 1997;Kiyono등,1982),식이 단백에 처음 노출된 시기(Hanson,1981;Strobel과 Ferguson, 1984; Strobel, 1996), 투여되는 항원의 종류와 양(Mowat, 1987;
Lamont 등,1989),그리고 항원과 함께 사용한 면역보강제(Saloga 등,1993;
Sampson 등,1991)에 의하여 강력히 영향을 받으므로,이러한 요인들을 적절히
선택하여 감작방법,유발시험 방법,항체 면역반응,세포 면역반응,조직 반응 등 이 사람의 식품 알레르기와 유사한 동물모델을 만들려는 노력이 이뤄지고 있다.
현재까지 가장 확고히 확립된 식품 알레르기 동물모델은 Brown Norway rat을 이용한 모델(Knippels등,1998)이며,생쥐모델의 경우는 아직도 연구의 시 작 단계에 있다.그리고 지금까지 보고 된 식품 알레르기의 생쥐모델의 경우도 대개는 경구 감작과 경구 유발시험을 시행하지 못하고 복강 내 감작 혹은 복강 내 유발시험을 이용한 연구들이 많은데,사람의 경우 식품 알레르기는 경구 감작 및 경구 유발에 의하여 증상이 나타나므로 엄밀히 말하면 이러한 복강 내 감작 및 유발을 통한 동물모델의 경우는 자연적인 식품 알레르기의 모델이라고 생각 할 수 없다.그러나 본 연구에서는 메밀의 위장관내 감작과 유발로 메밀알레르기 의 생쥐모델을 만들어냈다.비록 본 연구가 위장관내로 감작 시에 메밀 섭취후의 전신적인 아나필락시의 정확한 기전과의 관련성은 모르지만,메밀 특이 혈청 IgE 와 IgG1 항체는 현저하게 증가함을 관찰하였고,메밀 자극 비장세포의 증식과 IL-4와 IL-5생성이 명확하게 이 모델에서 유도되었다.
IgE는 즉시형 식품 알레르기를 조절하는데 중요한 역할을 함이 사람에서 뿐 아니라(Wieslander,1996;Sampson,1997;Rance 등,2002;Knippels 등, 2000),동물 모델에서도(Li등,2000;Knippels등,2000;Helm 등,2002)밝혀져 왔다.본 연구에서는 C3H/HeJ 생쥐를 실험동물로 선택하였는데,그 이유는 C3H/HeJ생쥐가 BALB/c,AKR/J,CBA/J생쥐보다 식품 항원에 대하여 감작이 용이하고 충분한 양의 항원 특이 IgE 생성 및 적절한 유발 증상을 나타내기 때 문이다(Morafo 등,2003).본 연구에서 메밀 특이 IgE는 특별히 쥐에게 저용량 메밀감작 군(1㎎/dose)과 중간용량 메밀감작 군(5㎎/dose)에서 초기 감작 후 1 주에서 4주 사이에 의미 있게 증가함을 알 수 있었다.더 나아가 3주째 메밀 특 이 IgE 값은 위장내로 메밀 유발 후에 측정한 아나필락시 증상점수와 일치하였 다.그러나 본 연구에서는 양성의 혈청에서 수동적 피부 아나필락시 반응을 실험 하지 않았기 때문에 전신 아나필락시 증상이 IgE 값의 증가로부터 유래되었는지 는 확인할 수 없었다.이와는 반대로,본 연구는 매일 먹이로 주는 생쥐의 사육
식이 단백질 추출물에 대한 IgE 반응을 알아내기 위해 사육 식이의 조단백 추출 물에 대해 ELISA법을 이용하여 IgE 항체를 측정하였다.본 연구에서는 실험기 간 모든 생쥐군 에서 무시할 정도의 사육 식이 IgE 항체 값을 발견하였고,이것 은 다른 식품 알레르기의 동물모델에서는 토의되지 않은 독특한 결과이다(Li등, 2000;Knippels등,2000).본 연구는 위장관을 통하여 감작시키는 동안 항원용량 에 따른 효과를 평가하기 위해 메밀추출물을 3가지 다른 용량으로 쥐에게 감작 시켰다.흥미로운 것은 고용량 메밀감작 군(25㎎/dose)에서는 메밀 특이 IgE 반 응의 초기 증가가 2주후에는 둔해졌고,실험 3주째에 의미 있게 낮았다.메밀로 감작시킨 후에 측정한 아나필락시 증상 점수는 메밀 특이 IgE 값에서와 같이 고 용량 메밀감작 군에서 가장 낮았다.메밀 특이 IgG1반응도 IgE 반응과 비슷한 양상으로 실험 제 2주부터 저용량과 중간 용량 메밀감작 군에서 고용량 메밀감 작 군에서와는 유의하게 다른 양상을 보였다.향후 이 모델에서 두 종류의 항체 의 정확한 역할에 대한 연구가 필요하다.
이 모델의 타당성을 평가하기위해 비장세포 배양을 통해 메밀의 T 세포 반응을 알아보았다.메밀로 감작된 생쥐의 비장세포의 증식은 메밀로 자극할 때 에 의미 있는 증식반응을 보였다.비록 비장세포의 증식정도가 Con A로 자극하 여 배양한 실험에서 가장 높았지만(SI로 표시),메밀로 자극하여 배양한 군의 실 험에서도 상대적으로 높은(SI:7-10)증식을 보였다.또한 메밀 특이 IgE나 IgG 반응과는 달리 메밀 자극 증식 반응은 고용량 군에서도 저용량 군에서와 같이 강했다.또한 메밀 특이 IL-4반응은 저용량 군,중간용량 군,고용량 군에서 모 두 유의한 증가를 확인하였고,저용량 군에서 가장 많이 증가함을 알 수 있었다.
그러나 항원 특이 IL-5반응은 저용량 군에서만 현저하게 증가하였다.이 연구에 서는 ConA는 Th2형 사이토카인에 상대적으로 저 자극효과를 가진 것을 알 수 있었다.Th2형 사이토카인 반응과 메밀 특이 IFN-γ 반응은 메밀로 자극된 생 쥐에서 우세하였고,저용량 군에서 가장 높았다.IFN-γ 생성은 ConA로 자극했 을 때가 메밀로 자극했을 때보다 더 높았다.
한편 본 연구에서 사용된 생 메밀의 추출물에는 내독소(endotoxin)가 함유
되었을 가능성이 있으므로 본 모델에서의 내독소의 영향에 대하여도 고려하여 보았다.쌀,밀 및 메밀 등 저장 곡류에서 곰팡이와 세균의 오염 때문에 생긴 내
되었을 가능성이 있으므로 본 모델에서의 내독소의 영향에 대하여도 고려하여 보았다.쌀,밀 및 메밀 등 저장 곡류에서 곰팡이와 세균의 오염 때문에 생긴 내