PCR 후에 나온 DNA를 T-easy vector에 클로닝하였으며, 이를 transformation하여 50개의 colony를 골라내었다. 제한효소를 이용하여 확인해 본 결과 이중 5개 clone을 얻어낼 수 있었는데, 이들을 sequencing한 결과 4개의 clone에서 NCF1 유전자를 나타내고 있었고 나머지 하나는 특정한 유전자를 나타내지 못하고 있었다.
- 7, 19, 22, 30 : GGGTGTTGACGTTGCATGCA
=> NCF1C - 16 : Non-specific
Fig. 9 Sequencing result (Barcode)
5 clones in T-easy vector got the bands. The sequencing result indicated that NCF1 gene is suppressed in the cells resistant to MTD-induced necrosis.
7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(GGGTGTTGACGTTGCATGCA)TTCGTG
16 TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATACTTCCTGCGGGACTTGGGGGACAT
19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(GGGTGTTGACGTTGCATGCA)TTCGTG
22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(GGGTGTTGACGTTGCATGCA)TTCGTG
30 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(GGGTGTTGACGTTGCATGCA)TTCGTG 0.5kb
7 16 19 22 30 (Sample No.)
고찰
세포의 죽음에 대한 이해가 질병의 이해, 극복과 매우 밀접한 관련이 있음은 더이상 의심할 수 없는 사실이다. 세포의 죽음이 활발히 연구되던 최근 20년간은 세포사멸 연구의 기간이라고 말할 수 있을 정도로 세포사멸에 대해 집중적으로 활발한 연구가 이루어져 왔다. 하지만 세포괴사가 더이상 수동적인 세포의 죽음이 아닌 세포사멸과 같은 능동적인 신호에 의해 이루어지는 세포의 죽음이라는 증거가 하나둘씩 나타나고 있고 그 신호전달 체계에 대한 연구도 서서히 이루어지고 있는 단계이다. 우리는 세포사멸 연구를 진행하던 중 우연히 MTD라는 펩타이드가 targeting의 기능 외에 세포괴사를 강력히 유도하는 기능을 가진다는 사실을 알게 되었다. 이 역시 세포괴사가 능동적 신호전달 체계를 가진다는 커다란 증거 중에 하나이나, 그 전달체계 역시 전혀 연구된 바가 없었으므로 이를 수행하기 위한 첫 단계로 본 연구를 시행하게 되었다.
본 연구의 가장 큰 목적은 과연 어떤 유전자들이 MTD에 의해 유도되는 세포괴사에 영향을 미치는지 알아보는 것이었으며 이를 위해 임의의 특정유전자를 억제시킬 수 있는 shRNA library를 이용하였다. 이는 Lentivirus를 만들어 감염시키는 방법으로 HeLa 세포주에 적용되었고 그 결과로 MTD에 의한 세포괴사가 잘 일어나지 않는 HeLa 세포주에서는 NCF1이라는 유전자가 억제되어 있다는 사실을 알게 되었다.
NCF1유전자는 neutrophil NADPH oxidase의 subunit(47kDa) 단백질을 발현시킨다고 알려져 있으며 이 유전자의 돌연변이는 만성육아종증에서 나타난다고 한다.
만성육아종증은 식세포 작용으로 침입한 세균을 파괴시키는 백혈구 능력의 결함으로 생기는 병이며 특히 포도상구균과 대장균형 세균에 특히 민감해지게 된다. 이 외의 다른 특별한 기능이 보고된 바가 없는 것으로 보아 지금까지 세포의 죽음에 대해 연관되어 연구된 적은 없는 것으로 보인다. 여기서 추론해 볼 수 있는 점은 NCF1유전자가
세포괴사에 영향을 미치는 방법이 ROS를 형성하는 것과 어떤 관련이 있을까 하는 것인데 이를 확실히 하기 위해서는 더 많은 실험과 연구가 필요할 것으로 보인다. 만약 ROS의 형성과 세포괴사를 유도하는 신호체계가 서로 연관이 없는 다른 체계라고 할지라도 그 신호체계의 중요성이 감소하지는 않을 것이며 그럴경우 오히려 더 새로운 국면의 연구를 진행할 수 있을 것으로 보인다.
실험방법 상의 아쉬운 점은 MTD에 의한 세포괴사에 내성을 가지는 세포주에 임의의 유전자가 억제된 clone들이 섞여있다는 점이다. 이 논문의 실험 상에서는 어떠한 clone이 우세하게 살아남아 세포개수에서 우위를 점하고 있을 때 그렇지 못한 세포에 억제되어 있는 유전자가 어떤 것인지를 알아낼 수 없는 단점이 있다. 클로닝하여 나온 결과에서 4개의 clone이 모두 같은 유전자를 나타내고 있었다는 것으로도 이를 뒷받침 할 수 있다.
이를 극복하기 위하여 확보한 세포주를 세포 하나씩 분리하여 single colony로 만들어 클로닝을 진행한다면 위의 단점을 극복할 수 있을 것으로 보이며 영향을 미치는 유전자를 더 많이 찾아낼 수 있을 것으로 보인다.
앞으로 더 진행될 수 있는 연구로는 찾아낸 NCF1 유전자가 과연 MTD에 의해 유도되는 세포괴사에 어떻게 영향을 미치는 지에 대한 연구와, 위에 이야기한 대로 이 논문의 실험방법을 개량한 더 다양한 유전자를 찾기 위한 연구가 시행될 수 있을 것이다. 두 연구 모두 거의 연구된 바 없는 세포괴사의 신호체계에 대해 밝히고 그 예를 제시할 수 있다는 점에서 큰 의미가 있을 것으로 생각된다.
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