in vitro 실험은 “within the glass”를 뜻하며 시험관 내에서 행해지는 실험이다, . 즉 살아있는 생명체 내부가 아닌 시험관이나 배양접시 등과 같이 내부에서의 제, 어가 가능한 환경에서 시행되는 실험과정을 의미한다 또한 시험관 안에서는 주. 로 세포단위의 작은 조직만이 생존할 수 있으므로 이를 세포실험이라 하는데 세, 포실험은 생체의 조직 일부 혹은 세포를 분리하여 특정 물질 또는 환경에 대해 어떻게 반응하는가를 살피는 것이다 이 실험은 다른 여러가지 외부요인을 최대. 한 억제한 상태에서 수행되어야 하는데 세포단계 혹은 조직단계의 실험이므로, 외부 온도라든지 병원균이라든지 조그마한 변수에도 큰 영향을 받을 수 있기 때 문이다 이렇게. in vitro 실험은 이러한 많은 변인들을 쉽게 통제하는 것이 가능 하며 관찰이 용이하기 때문에 실험을 보다 쉽게 수행할 수 있다 세포실험으로서. 나 합성 단백질 합성 세포 성장속도 세포 형상 변종 등의 영향에 관
DNA RNA , , , ,
한 연구를 수행한다 세포 수준의 실험결과가 전체 개체의 건강상태와 어떻게 연. 관되는지 정확히 알 수가 없지만 어떠한 메커니즘으로 작용되는지에 대해서는, 많은 도움이 되는 실험단계이다 이러한 실험을 통해 인체에 미치는 영향을 평가. 하기 위해서는 궁극적으로 역학연구 동물실험 및 세포실험의 총체적인 이해가, 요구된다.[61]
in vivo 실험은 “within the living”를 뜻하며 생체 내에서 행해지는 실험을 의미, 한다 이러한 동물실험은 주로 실험실 환경에서 행해지는 개체실험으로 동물뿐만. 아니라 사람에 대한 연구도 포함되며 역학 연구에서도 밝힐 수 없는 여러 가지, 메커니즘을 얻을 수 있는 장점이 있는데 이는 특정 물질 또는 환경의 노출량을, 인위로 적절히 조정하여 그 효과를 관찰하는 것이 가능하다 하지만 짧은 기간에. 대한 노출 가역 반응 노출의 단순성 등에 의한 문제점이 발생할 수 있으며 암, , , 과 같이 장기간 노출의 결과를 관찰하기 위한 목적으로 동물실험이 주로 수행된 다 실험동물과 대조군 동물은 노출량만 다르고 환경 조건 식생활 유전자 특성. , , 등은 동일하게 유지되며 서로 다른 종류의 동물실험은 특정한 분야에서의 의문, 을 규명하기 위해 수행된다 동물실험 결과를 사람과 직접 연관시킬 수 없더라도.
동물과 인간의 공통적인 생체학적 반응은 매우 많으므로 짜임새 있고 재현성 있 는 동물실험 결과는 매우 중요하다 특히 세포 수준의 실험결과와 역학연구 결. , 과들을 총체적으로 분석하면 인간에 대한 노출 영향을 평가하는데 매우 유용할 수 있다.
제
3
장 상온분사공정에 의한 하이드록시아파타이.
트와 울라스토나이트 생체세라믹스의 코팅제
1
절 서 론.
생체재료는 인체의 손상된 장기 및 신체의 일부분을 대체 할 수 있는 재료를 말한다 현재 개발된 대표적인 생체용 세라믹 재료로는 하이드록시아파타이트 및. 울라스토나이트 등 생체활성 재료가 있는데 이러한 생체활성 재료는 정형외과용, 임플란트 또는 생체불활성 소재의 표면 코팅물질로 사용된다 그중에 하이드록시. 아파타이트는 인체의 뼈나 치아의 주성분과 구조가 동일하여 의료분야에서 금속 이나 세라믹스에 코팅하여 사용되고 있다 또한 높은 생체 적합성 및 인체 내 삽. 입시 높은 골 부착력을 갖고 있어 치과용 임플란트 뿐만 아니라 골 이식용 임플 란트로 응용되고 있다.[62] 울라스토나이트는 하이드록시아파타이트보다 높은 생 체활성 우수한 골 재생능력 및 생분해 특성을 갖는데 생체유사용액인, , SBF용액 에 침적하면 표면에 아파타이트가 빠르게 석출되어 뼈 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다.[63]
본 연구에서는 고상법을 통해 두 가지의 생체활성 재료인 하이드록시아파타이 트와 울라스토나이트 분말을 제조 한 후 지르코니아 표면의 생체활성을 높이고, 자 상온분사코팅공정에 의해 코팅을 실시하였다 코팅 후 출발 조성에 따른 코팅. 층의 미세구조를 분석하고, in vitro test를 통해서 출발조성이 생체활성에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
제
2
절 실험 방법.
상온분사코팅을 수행하기 위하여 하이드록시아파타이트 분말과 울라스토나이 트 원료분말을 각각 고상법으로 제조하였다 하이드록시아파타이트 분말 제조의. 경우 출발원료 물질로는 동물 뼈를 수거하여 사용하였는데 뼈 내부에 부착된 유, 기물 제거를 위하여 1100 oC에서 시간 하소한 후 분쇄하여 하이드록시아파타이1 트 분말을 제조하였다 울라스토나이트 분말은. CaCO3와 SiO2를 출발물질로 사용 하였다. 1300 oC에서 시간 열처리하여3 α상 울라스토나이트 고온형 분말을 합성( ) 하였으며 상온분사용 최적 분말조건인, 1~3 µm 크기를 갖도록 24시간 볼밀로 분 쇄하였다 분말표면에 수분 흡착을 억제하기 위하여. 150 oC의 항온기에 넣어 보 관한 후 사용하였다 이 후 분말의 형상은 주사전자현미경. (field emission scanning
을 통해 관찰하였으며 선 회절분석
electron microscope, FE-SEM) , X- (X-ray 을 통해 상분석을 행하였다
diffraction, XRD) .
상온분사공정은 코팅 시 서브마이크로미터의 분말 크기가 충돌에 의해 나노미 터의 결정립으로 파쇄되어 접착되는 현상을 이용하였다. 코팅용 기판으로는
분말을 사용하여 제작하였는데 가압성형 후
3Y-TZP(Tosoh, Japan) , 1350 oC에서 1 시간 열처리를 하여 직경 11 mm, 두께 1.7 mm인 기판을 제작하였다 상온분사. 공정에서 운반가스로 사용된 질소 가스의 유량은 5 1/m이었으며 노즐은, 0.3 x
크기를 사용하였다 코팅공정 전 챔버 내 진공은
10 mm . 1.0 x 10-3의 상태로 유
지하였으며 공정 중에 진공은, 3~4 torr 이하로 제어하였다 그리고 노즐과 기판. 의 사이 간격은 5~10 mm로 유지하였으며 코팅 시 기판을, X축 방향으로 이동하 면서 코팅을 행하였다 이때. X축 왕복횟수를 조절하여 코팅층의 두께를 조절하 였다. Fig. 8, Table 4은 상온분사코팅장치의 구조와 코팅조건을 나타내었다.
하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 코팅층의 미세구조 및 상분석은 주 사전자현미경, X-선 회절분석으로 분석하였다.
생체활성 코팅층의 용해거동을 관찰하기 위해 pH 7.4의 생체유사용액(simulated
다.In vitro test는 시편이 담긴 용기를 항온기 안에 넣고 36.5 oC로 유지한 후, 1, 일 동안 실시하였다 일정시간의 침적이 완료 된 코팅시편을 꺼내어 잔류의
3, 14 .
용액을 증류수로 세척하고 수분을 제거한 후 건조하였다
SBF .
하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 코팅층의 in vitro test 후의 상변화를 알아보고자 침적시간에 따른 조성 변화를 X-선 회절 분석(X-ray diffraction,
적외선 흡수 분광 및
XRD), (fourier transform infrared spectrometry, FT-IR) 로 분석하였으며 미세구조 변화는 주사전자현 EDS(energy dispersive spectroscopy) ,
미경(field emission scanning electron microscope, FE-SEM)으로 고찰하였다 전체적. 인 실험공정은 Fig. 7에 나타내었다.
Fig. 7. Schematic of experimental procedure for bioceramic coating.
Fig. 8. Apparatus for room temperature spray coating.
Table 4. Experimental parameter of room temperature spray processing.
SPECIFICATION
Powder biomaterials
Substrate zirconia
Carrier gas N2
Nozzle size 0.3 X 10 mm
Scanning rate 1.0 mm/s
Distance between substrate and nozzle 5~10 mm
Vibration speed 400 rpm
Working pressure 3~4 torr
Table 5. Procedure for the preparation of simulated body fluid (SBF).
Reagent Amount Container Purity(%)
1 NaCl 8.035 g Weighing paper 99.5
2 NaHCO3 0.355 g Weighing paper 99.5
3 KCl 0.255 g Weighing bottle 99.5
4 K2HPO4 3H2O 0.231 g Weighing bottle 99.0
5 MgCl2 6H2O 0.311 g Weighing bottle 98.0
6 1.0M HCl 39 ml Graduated cylinder
-7 CaCl2 0.292 g Weighing bottle 95.0
8 Na2SO4 0.072 g Weighing bottle 99.0
9 Tris 6.118 g Weighing paper 99.0
10 1.0M HCl 0~5 ml Syringe
-제
3
절 결과 및 고찰.
열처리 또는 고상법을 통해 생체활성 재료인 하이드록시아파타이트분말과 울 라스토나이트분말을 각각 제조한 후 형상을 고찰한 결과 분말의 크기는, 1~3 µm 였으며 분말 형상 및 상 분석 결과를, Fig. 9에 나타내었다 모든 입자는 분쇄에. 의하여 대부분 각지고 불귤질한 형태를 나타내었으며, XRD 분석결과 각각 순수, 한 하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 상으로 고찰되었다. Fig. 10에는 상 온분사코팅공정으로 제조한 하이드록시아파이트와 울라스토나이트 코팅층의 미 세구조를 나타내었다 하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 코팅층은 균일한. 두께와 균질한 미세구조를 나타내었으며 하이드록시아파타이트 코팅층은, 2.1
울라스토나이트는 의 코팅층 두께를 각각 나타내었다
µm, 8.1 µm .
코팅층 두께는 분말에 의해 달라졌는데 이전의 연구에 의하면 입자의 중량에, 따라 상온분사코팅 공정 중 형성되는 운동에너지가 다르기 때문에 유동속도와 부착특성이 달라지게 되고 이에 따라 분말의 조성에 따라 코팅층 두께가 달라 지게 된다. 따라서 같은 공정 조건에서도 입자형태와 상 조성에 따라 코팅층은 실질적으로 다른 두께를 나타낼 수 있다 또한 상온분사코팅공정에서 코팅층 두. 께는 분사시간 즉 왕복횟수에 의해 제어 될 수 있다, .
하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 코팅층의 단면은 큰 기공이나 균열 이 없는 치밀한 미세구조를 나타내었으며 지르코니아 기판과의 좋은 접착성을, 나타내었다 코팅층은 출발분말의 크기인. 1~3 µm에 비교하여 작은 입자인 100 ~ 크기로 관찰되었다 이는 분사공정 시 챔버와 분말용기의 압력차로 인하
300 nm .
여 분체 내 입자가 고속으로 분사되고 지르코니아 기판과의 충돌 시 입자가 파 쇄되어 증착되기 때문인 것으로 알려져 있다.
에는 코팅층의 및 패턴을 나타내었다 코팅하는 동안 큰 입자
Fig. 11 XRD EDS .
가 미립자로 파쇄 되었음에도 불구하고 그림에서 보듯이 원료분말의 상조성이 그대로 유지되고 있음을 확인할 수 있었다 플라즈마 용사 코팅법의 경우 코팅.
Fig. 9. Particle morphology and phase composition of (a) hydroxyapatite and (b) wollastonite powder.
Fig. 10. Microstructure of (a) hydroxyapatite and (b) wollastonite coating layers.
Fig. 11. Phase composition of (a) hydroxyapatite and (b) wollastonite coating layers.
는 하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 코팅 시편을
Fig. 12, 13, 14 36.5
oC에서 각각 1, 3, 14일간 침적 실험한 시편에서의 in vitro test 결과를 보여주고 있다. SBF 용액에 침적 후 관찰한 하이드록시아파타이트와 울라스토나이트의 코 팅 표면에서는 석출된 하이드록시아파타이트 입자가 모두 덮여 있었는데 침적시, 간이 증가함에 따라 석출 하이드록시아파타이트 층의 미세구조와 두께가 변화하 였다. SBF 용액에 침적 일 후부터 두 시편에서 나노크기를 갖는 하이드록시아1 파타이트 입자가 코팅층 표면에 석출이 관찰되었는데 이는 두 코팅 시편 모두, 높은 생체활성을 갖고 있음을 의미한다.
침적 3일 후에는 모든 코팅층 표면을 하이드록시아파타이트 석출입자가 덮었 는데 코팅층 종류에 따라 석출된 하이드록시아파타이트 형태가 다르게 관찰되었, 다 하이드록시아파타이트 코팅층의 경우에는 약. 4 µm 직경의 석출 하이드록시 아파타이트 구형입자가 형성되었고 울라스토나이트의 경우에는 약, 7 µm 직경의 입자가 형성되었다. SBF 용액에 14일 침적한 후에는 석출 하이드록시아파타이트 층의 두께가 두 시편 모두 증가하였다 울라스토나이트 코팅층에는 약. 3 µm의 석출 하이드록시아파타이트가 덮여 있었으며 이는 약, 2 µm 두께를 형성한 하이 드록시아파타이트 코팅층보다 더 높은 것으로 관찰되었다 이러한 결과는. SBF용 액 침적 시 울라스토나이트 코팅층이 하이드록시아파타이트 코팅층 보다 높은 생체활성을 갖는 것으로 판단할 수 있다 하이드록시아파타이트 및 울라스토나이. 트 코팅층에 석출된 둥근 하이드록시아파타이트 입자 최상위 표면에는 길이
두께 의 판상 입자가 덮여 있었다
300~500 nm, 50 nm .
침적시간이 지남에 따라 하이드록시아파타이트 및 울라스토나이트 코팅층의 상 조성을 분석한 결과(Fig. 15), 침적시간 증가할수록 두 코팅층 모두 하이드록 시아파타이트 입자 석출의 증가로 인하여 XRD 패턴에서 하이드록시아파타이트 의 피크가 증가하였다 하이드록시아파타이트 코팅층의 경우 침적. , 1, 3, 7일차에 는 피크가 크게 증가하지 않았지만 침적 14일 후에는 석출된 하이드록시아파타 이트의 피크가 크게 증가하였다 반면에 울라스토나이트 코팅층의 경우 침적. , 1