총페놀 함량과 항산화 활성은 서로 상관관계가 있는 것으로 알려져 있으며 (Ra 등, 1997), Lee 등(2005)은 폴리페놀 함량에 비례하여 DPPH 소거활성(R2
=0.82)이 증가하였다고 보고하였는데, 본 연구에서도 총페놀 함량과 항산화 활성 사이에 높은 상관관계(R2 = 0.8776, Fig. 1)가 있는 것으로 판명되었다. 그런데 특이한 것은 TPC 함량이 약 180 mg GAE/g 이상에서는 거의 동일한 DPPH 소 거활성을 나타내었다.
Lee 등(2002)은 포도종자 75% 에탄올 추출물과 이를 순차용매 추출하여 얻은 분획물의 페놀 화합물 함량과 전자공여작용을 측정한 결과, 페놀성 화합물 의 함량이 증가할수록 전자공여작용도 함께 증가하였으며, 극성도가 높은 용매로 추출한 분획물이 페놀성 화합물 함량 및 전자공여작용이 높게 나타나는 경향을 보고하였다. 식물 추출물의 항산화 활성은 개개의 활성 phenolic 화합물과 관련 이 있다고 보고하고 있으며(Djeridane 등, 2006), 약용식물로부터 얻은 flavonoids의 DPPH 소거활성은 구조 중 hydroxy group의 수와 위치가 중요한 것으로 보고되고 있다(Okawa 등, 2001).
제주도에 자생하는 여러 가지 식물을 대상으로 새로운 항산화 기능성 소재 개발을 위한 탐색 연구를 행하였는바, 항산화능이 우수한 것으로 확인된 식물은 인체 및 식품에서도 항산화제로서 지질산화의 개시와 연쇄반응을 효과적으로 차 단할 것으로 생각되며, 식물 추출물 그대로 혹은 식물에 존재하는 항산화 효과가 뛰어난 폴리페놀 등의 phytochemicals를 이용한 기능성 식품, 화장품, 천연 보 존료 및 의약품 등의 개발이 가능할 것으로 판단된다.
y = 0.4145x
Fig. 1. Correlation between total phenolic content and free radical scavenging activity against DPPH of 70% methanol extracts from natural plants.
었고, 된장풀, 짚신나물, 팥배나무, 비수리, 산뽕나무, 새우나무, 붉나무는 40%
이상의 소거활성을 나타내었다. 산뽕나무는 DPPH 소거활성이 22.9%로 낮은데 반하여 NO 소거활성은 43.1%로 다소 높은 활성을 보이고 있는데, 이는 같은 항 산화 활성일지라도 측정방법에 따라 효과가 달라짐을 보여주고 있다. Moon 등 (2003)도 항산화 효과는 측정방법에 따라 차이가 있으므로 여러가지 방법을 통 하여 결과를 비교 해석하는 것이 필요하다고 보고하고 있다. 측정방법에 따른 항 산화 효과에 차이를 나타내는 것은 산화과정에서 생성된 활성산소를 시료가 모 두 소거할 수 있는 것이 아니라 시료에 따라 선택적으로 작용하는 산화기작이 있는 것으로 판단되고, 항산화제 개발을 위해서는 산화기작에 따른 맞춤형 항산 화제의 개발이 필요하다(Kim 등, 2006).
Jagetia 등(2004)은 여러 가지 허브 추출물의 NO 소거활성을 측정한 결과 31~500 ppm 까지는 농도에 따라 22~80%로 증가하여 농도 의존적이었지만, 그 이상의 농도에서는 더 이상 활성이 증가하지 않았다고 보고하였다.
Plant species NO
Geranium nepalense ssp. thunbergii Hara 36.7±0.5 56.3±3.4
Lespedeza cuneata G. Don 46.2±2.0 68.6±2.2
Morus bombycis 43.1±3.1 41.2±1.5 Table 3. Nitric oxide(NO) scavenging activity and xanthine oxidase(XOD) inhibition activity of 70% methanol extracts from natural plant
* values are means ± standard deviations of three replicates.
4) Xanthine oxidase(XOD) 저해활성
XOD는 purine 대사에 관여하는 효소로서 xanthine 또는 hypoxanthine으 로부터 urate를 형성하며 urate가 혈장 내에 증가하면 골절에 축적되므로 통증 을 동반하는 통풍을 일으키는 효소이다(Moon 등 2001, An 등, 1998). 따라서 XOD 저해 효과는 free radicals의 생성 억제와 더불어 생물학적으로 중요한 의 의를 가진다.
70% 메탄올 추출물의 XOD 저해활성을 측정한 결과는 Table 3과 같았다.
붉나무와 산딸나무는 100%의 높은 저해활성을 나타내었고, 이삭여뀌와 소귀나 무는 90% 이상을, 수까치깨, 자금우, 새우나무, 붉가시나무는 80% 이상의 저해 활성을 나타내었다. 팥배나무, 멀꿀, 귀룽나무, 비수리, 짚신나물, 된장풀, 딱지꽃, 이질풀은 50% 이상의 저해활성을 나타내었다.
산사자 열수 추출물과 에탄올 추출물은 5,000 ppm에서 각각 15.2와 16.2%의 XOD 저해효과를 나타내었다(An과 Lee, 2002). 일반적으로 flavonoid 류는 XOD 저해활성이 있는데, 감잎에서 추출한 탄닌(Moon 등, 2001)과 녹차에 서 추출한 catechin(Yeo 등, 1995)은 XOD 저해활성이 있는 것으로 보고되었다.
식물계에 널리 존재하는 flavonoid류는 hydroxyl기의 위치에 따라 XOD 저해효 과가 다르게 나타나는데, 방향족 hydroxyl기가 많을수록 저해작용이 강하게 나 타난다고 보고되고 있다(Hayashi 등, 1988, An 등, 1998).
본 실험에서 이삭여뀌, 소귀나무, 짚신나물, 이질풀, 등은 XOD 저해활성이 높으면서 식용 가능하므로 통풍예방을 위한 생리활성 물질의 신소재로서 가치가 있을 것으로 추정된다.
5) Tyrosinase 저해활성
70% 메탄올 추출물(10,000 ppm)에 대하여 melanin 형성에 key enzyme 으로 알려진 tyrosinase의 저해활성을 측정하였다(Table 4).
Tyrosinase 저해활성은 이삭여뀌가 93.1%로 가장 높았고, 붉나무, 사방오 리나무, 소귀나무, 자금우, 짚신나물, 딱지꽃이 80% 이상의 높은 저해활성을 나 타내었고, 멀꿀, 귀룽나무, 팥배나무, 붉가시나무, 수까치깨, 산뽕나무, 된장풀, 새 우나무, 산딸나무, 중대가리나무, 비수리는 70% 이상의 저해활성을 나타내었으 며, 이질풀, 석위, 솔비나무, 자주땅비수리, 누리장나무, 백량금은 50% 이상의 저 해활성을 나타내었다.
An과 Lee(2002)는 산사자 열수 추출물과 에탄올 추출물은 30,000 ppm에서 각각 49.8과 62.4%의 tyrosinase 저해효과를 나타내었다고 보고하였다. Lee 등 (2006)은 tyrosinase 저해효과가 총페놀 함량 및 항산화 효과와 상관관계가 있 다고 보고하고 있으나, 본 실험에서는 tyrosinase 저해효과가 총페놀 함량(R2 = 0.3575, Fig. 2) 및 항산화 효과(R2 = 0.4591, Fig. 3)와 상관관계를 보이지 않 았다. Kim 등(1997)과 Cho 등(2001)은 폴리페놀 중에서도 catechin류는 저해활 성을 나타내지 않았고 gallocatechin이나 epicatechin류에서 높은 저해활성을 나타내었으며, dimer보다 monomer에서 저해활성이 더 우수하였다고 보고하였 다.
본 연구에서 tyrosinase 저해활성은 총페놀 함량과 상관관계가 없는 것으 로 나타났으나, 폴리페놀의 종류 및 그 구조와 상관관계가 있는 것으로 보고되고 있으므로(Kim 등, 1997, Cho 등, 2001), tyrosinase의 저해활성이 높은 시료 를 대상으로 폴리페놀의 종류 및 구조의 규명이 필요하다. 또한 tyrosinase 저해 활성이 미백물질을 스크리닝하는 단계에서 중요하지만 in vivo에서 melanin 생 성억제 효과와 반드시 일치하지 않는다는 보고(제주 건강뷰티산업 육성 심포지 엄, 2005)도 있으므로, tyrosinase 저해활성 측정과 더불어 in vivo 실험이 병행 되어야 할 것으로 예측된다.
Table 4. Tyrosinase inhibition activities of 70% methanol extracts from
Artemisia scoparia Waldst. et Kitamura 33.4±4.1
Astragalus adsurgens Pall. 56.6±1.5
Corydalis pallida var. tenuis YATABE 10.7±1.9
Cudrania tricuspidata(Call.) 33.2±3.7
Euonymus quelpaertensis Nakai 16.7±2.0
Euscaphis japonica(Thunb.) Kanitz 37.3±3.8
Firmiana simplex W. F. Wight 24.9±3.1
Geranium nepalense ssp. thunbergii Hara 64.3±1.8
Gynostemma pentaphyllum Makino 24.4±1.6
Ilex crenata Thunb. 36.8±4.9
Lespedeza cuneata G. Don 71.0±3.3
Maackia fauriei(Lev.) Takeda 58.3±4.3
Plant species Tyrosinase Trachelospermum asiaticum var. intermedium 39.7±3.7
Vicia unijuga 12.2±3.9
Vitex rotundifolia L. fil. 13.9±5.6
Zanthoxylum ailanthodes Sieb. et Zucc. 23.9±4.5
Zanthoxylum schinifolium Sieb. 20.6±2.9
Table 4. Continued
* values are means ± standard deviations of three replicates.
y = 0.3193x
Fig. 2. Correlation between total phenolic content and tyrosinase inhibition of 70% methanol extracts from natural plants.
Fig. 3. Correlation between DPPH radical scavenging activity and tyrosinase inhibition of 70% methanol extracts from natural plants.
2. 고압용매 추출물의 생리활성
1) 추출수율
유기용매 추출법은 추출수율 면에서는 좋으나, 과도한 유기용매 사용으로 인간의 건강과 안전, 그리고 환경에 유해요소로 작용한다. 유기용매 사용을 최소 화하는 추출방법들이 많이 개발되어 있으나, 이들 방법은 추출 효능이 좋지 않고 비용이 많이 드는 단점을 가지고 있다. Pressurized liquid extraction(PLE) 또 는 accelerated solvent extraction(ASE)은 최근에 항산화 phytochemicals를 추출하는데 이용되고 있는데(Palma 등, 2001; Pineiro 등, 2004), PLE에서는 추출용제로 유기용매를 사용하여 고압과 고온에서 행함으로써 빠르고 효율적으 로 추출을 할 수 있는 장점이 있다(Tsao, 2004).
제주 자생식물 54종 중 항산화 활성과 미백 효과가 높은 5개의 시료를 대 상으로 고압용매 추출을 행하여 추출수율을 측정한 결과는 Table 5와 같았다.
상압 유기용매 추출법(70% 메탄올, 대기압, 상온)과 고압 유기용매 추출법 (100% 메탄올, 13.6 MPa, 40℃)에 의한 추출수율은 자금우가 각각 16.8과 13.4%, 산딸나무가 각각 18.4%와 14.3%, 소귀나무가 각각 18.6과 11.6%로, 상 압 유기용매 추출법이 고압 유기용매 추출법에 비해 추출수율이 다소 높은 경향 을 나타내었다.
상압 유기용매 추출법은 고압 유기용매 추출법에 비하여 장기간의 추출 시 간과 다량의 유기용매가 소비된다는 것을 고려한다면, 고압 유기용매 추출법이 더 간편하고 경제적이라고 추정된다. 고압 유기용매 추출방식은 성분들에 대한 용해도를 증가시키고 시료 매트릭스간의 상호작용을 감소시켜 목적 성분의 용출 이 용이한 것으로 알려져 있다. 대상 식물이 추출 용매에 따라 항산화 활성과 추 출수율이 차이가 나며, 항산화 물질 추출 시 추출용매로 메탄올을 많이 사용하는 데, 이는 항산화 활성이 높은 극성 물질의 추출과 추출수율이 높기 때문이다 (Lee 등, 1993).
Plant species Extraction yield(%) Solvent extraction1) PLE2)
Ardisia japonica blume 16.8 13.4
Cornus kousa Buerg. 18.4 14.3
Myrica rubra Sieb. 18.6 11.6
Persicaria filiforme Nakai 7.8 7.9
Rhus javanica Linne 19.9 21.8
Table 5. Extraction yields of natural plants by solvent extraction and pressurized liquid extraction
1) 70% methanol, atmospheric pressure, room temperature.
2) pressurized liquid extraction(100% methanol, 13.6 MPa, 40℃).
2) 추출방법에 따른 DPPH 소거활성과 tyrosinase 저해활성
자생식물 4종을 대상으로 고압 유기용매 추출법과 초임계 유체 추출법을 이용하여 추출한 후 DPPH radical 소거능과 tyrosinase 저해활성을 측정하였다 (Table 6). 고압 유기용매 추출물의 DPPH 소거능은 70% 메탄올 추출물과 마찬 가지로 높은 활성을 나타낸 반면, 초임계 유체 추출물은 매우 낮았다.
Tyrosinase 저해활성도 고압용매 추출물은 70% 메탄올 추출물과 비슷하게 높 은 활성을 나타낸 반면, 초임계 유체 추출물은 저해활성이 음의 값으로 효소활성 을 촉진하는 것으로 나타났다. 이는 초임계 이산화탄소와 보조용매인 에탄올보다 고압 유기용매 추출인 경우 메탄올에 용해되는 성분들이 많으며, 고압에 의한 유 효성분 용출량이 많았기 때문인 것으로 판단된다.
Plant species
Solvent extraction1) PLE2) SFE3)
DPPH
% inhibition
Tyrosinase
% inhibition
DPPH
% inhibition
Tyrosinase
% inhibition
DPPH
% inhibition
Tyrosinase
% inhibition
Ardisia japonica blume 93.3±1.5 84.4±2.4 90.6±0.2 86.7±2.0 19.7±0.3 -9.2±8.6
Cornus kousa Buerg. 92.3±0.9 71.9±4.0 92.4±0.1 78.6±1.4 6.6±0.1 -1.3±3.8
Myrica rubra Sieb. 94.0±0.9 85.5±1.4 91.4±0.2 93.1±2.0 10.3±0.9 -7.8±8.2
Rhus javanica Linne 93.8±1.0 89.4±0.4 89.9±0.3 98.4±9.0 19.6±1.6 -13.3±3.5
Table 6. DPPH and tyrosinase inhibitory activities of natural plants by solvent extraction, pressurized liquid extraction and supercritical fluid extraction
1) 70% methanol, atmospheric pressure, room temperature.
2) pressurized liquid extraction(100% methanol, 13.6 MPa, 40℃).
3) supercritical fluid extraction(CO2+ethanol(10%), 44.2 MPa, 40℃).
* values are means ± standard deviations of three replicates.
3) 추출물의 농도에 따른 tyrosinase 저해활성
3) 추출물의 농도에 따른 tyrosinase 저해활성