In this study, It is showed that short oligopeptides, based on the first 11 or 12 amino acids of PTH, tend to form an α-helical structure, and that the activity differences observed for the short amino terminal analogues might be explained by residue specificity in terms of optimum receptor pocket binding. This study shows that: 1). An α-helical structure of some one and half turns, incorporating residues 3-10, is important for activating the PTH/PTHrP receptor with short-length N-terminal PTH(1-12) analogues. 2).
The 10th and 11th residues of short-length PTH(1-12) analogues have a role in the stabilization of the helix, even though they may not be involved in receptor activation directly. Therefore, It is hoped that the results of this study will assist in the understanding of the structure-activity relationships of short amino terminal oligopeptides and also believe that the stabilization or enhancement of the α-helical structure of PTH analogues offers us a route towards the development of novel orally administrable drug systems.
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Abstract (in Korean)
부갑상선 호르몬 유도체 - 수용체 활성부위의 구조와 기능
지도교수 임 승 길 연세대학교 대학원 의과학과
이 은 진
골다공증은 낮은 골량과 뼈의 구조적인 노후화에 따른 골절의 위험도를 증가 시키는 대사성 골질환으로, 평균 수명의 증가 및 노령화로 인한 경제적인 부담 은 물론 사회적으로도 많은 문제를 초래케 하는 중요 질환이다. 그러나 현재 사 용되는 약제들 대부분은 에스트로젠, 비스포스포네이트, 칼시토닌 등과 같이 골 흡수만을 주로 억제하는 약제들이다. 이들은 약제의 특성상 골량의 괄목할 만 한 증가 없이 골 전환률을 감소시켜 지속적인 치료에도 불구하고 불과 50% 정 도의 골절 감소 효과만을 보일 뿐이다. 따라서 골량을 크게 증가시켜 효율적으 로 골절을 억제할 수 있는 즉 동화작용의 효과를 나타내는 새로운 물질의 개발 이 절실히 요구되는 실정이다. 최근 미국 식품의약품 안전청은 뼈에 대한 동화 작용을 나타내는 대표적인 후보 물질인 부갑상선 호르몬을 골형성 촉진제로 승 인한 바 있다.
부갑상선 호르몬은 칼슘과 포스페이트 항상성의 주요 조절인자로서, 투여방법 에 따라 골에 대한 동화작용 또는 이화작용 효과를 나타낸다. 즉 저 용량을 간
헐적으로 투여 할 경우 뼈에 대하여 동화작용을 나타내고, 고 용량을 지속적으 로 투여 할 경우는 이화작용을 나타낸다. 그러나 현재 미국 식품의약품 안전청 이 승인한 인간 재조합 부갑상선 호르몬 [rhPTH(1-34)]은 펩타이드 제제이어서 주사제로만 투여해야 하는 단점을 가지고 있고, 백서에 대한 독성시험에서 뼈에 악성 및 양성종양을 유발하는 등 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 반드시 해결해야 하는 몇 가지 문제점들이 있다. 이에 본 연구에서는 부갑상선 호르몬 의 활성도를 나타내는 최소 크기의 유도체인 PTH(1-11) 또는 PTH(1-12)를 기 본으로 한 peptide array를 합성 제작하여 이들의 생물학적인 활성도를 측정하 고, circular dichroidism 및 핵자기 공명 구조를 비교 검토함으로써, 향후 보다 약물 투여가 용이하고 환자의 적응도를 높일 수 있는 부갑상선 호르몬 유도체 의 도출을 위한 기초 자료를 얻고자 하였다.
PTH/PTHrP 수용체를 LLC-PK1 세포주에 칼슘 포스페이트법으로
transfection 시킨 후 neomycin 투여에 의한 선택적 분리과정을 거쳐 stable cell lines을 만들었다. PTH 유도체의 경우, 기존의 연구들에서 아미노 터미널 잔기 들이 수용체 결합에 결정적이어서 다른 아미노산기로 치환 시 활성을 잃는 것 으로 알려져 본 연구에서는 PTH(1-11) 또는 PTH (1-12)의 아미노 터미널은 그대로 보존하면서 카복시 터미널 잔기, 특히 7, 8, 10, 그리고 11번째 잔기를 집중적으로 치환하였다. PTH(1-12)의 제 10번째 염기의 치환 결과 cAMP를 증 가시키는 활성도 순서는 Ala ≈ Asp ≈ Gln > Glu순으로 나타났으며, 제 11번째 잔기는 Arg > Met ≈ Lys > Ile순으로 나타났다. PTH(1-11) 유도체는 첫번째, 7 번째, 그리고 8번째 잔기를 다양하게 치환한 결과 잔기의 유형에 따라 다양한 cAMP 활성화 정도를 보였다. 특히, 제 10번째 Ala 잔기를 Glu로, 제 11번째 Arg 잔기를 Ile로 치환하였을 때 급격히 활성도가 떨어졌으며, 제 10번째와 11 번째를 Glu10/Ile11로 치환하였을 때는 완전히 활성도를 잃어버렸다. 한편 PTH(1-12) 유도체의 경우, 제 7 번째 염기 Leu을 Phe으로 치환하면 전반적으
로 활성도가 줄어들었지만 PTH(1-11) 유도체의 경우에는 상기 치환이 활성도 의 차이를 보이지 않았다. 흥미롭게도 PTH(1-11) 유도체에서 첫 번째 잔기 Ala 을 Ser으로 치환하였을 때 그 생물학적인 활성도를 잃어버렸다. 그러나 유도체 들의 핵자기 공명 구조는 다양한 활성도와는 달리 흥미롭게도 거의 유사한 α
-helical backbone 구조를 가지고 있었다. 특기할 만한 것은
[Ala3,10,12(Leu7/Phe7)Arg11]rPTH(1-12)NH2의 경우 안정된 α-helical 구조를 가 지고 있는 반면, 10번째 염기가 Glu10으로 11번째 염기가 Ile11로 치환된 유도체 의 경우 불안정한 α-helical 구조를 보였다.
요약컨데, 부갑상선 호르몬의 앞부분에 해당되는 PTH(1-11) 또는 PTH (1-12) 유도체들은 α-helical 구조를 보이며, α-helical 구조의 불안정성이 생 물학적인 활성도를 저하한다는 것도 알 수 있었다. 그러나 같은 α-helical 구조 를 갖더라도 각 염기 잔기에 따라 활성도가 크게 차이가 나는 점으로 미루어 backbone 구조 이외에도 각 잔기의 side chain orientation이 중요한 것을 알 수 있다. 따라서 향후 α-helical 구조를 유지하면서 PTH/ PTHrP 수용체에 결합 할 수 있는 최적의 side chain orientation을 갖는 자연계에 존재하든 또는 존재 하지 않는 잔기로의 치환을 통하여 강력한 부갑상선 호르몬 유도체의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
핵심되는 말: 부갑상선 호르몬 수용체; cAMP 형성 활성도; 핵자기 공명;
α-helix