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Figure 26. Gating strategy. Gating strategy and aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity in IECs from mice in the presence of the ALDH inhibitor DEAB (diethylaminobenzaldehyde).
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Figure 27. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity decreased in the jejunum and ileum of LKB1ΔIEC mice. Aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity in IECs was detected using the Aldefluor assay and measured by flow cytometry (n = 4 / group. Data are represented as mean
± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test. *p < 0.05; compared with the control mice of the same treatment group.
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Figure 28. Quantification of Retinoid and change of FXR target gene expressions in LKB1ΔIEC after Vitamin A administration. (a and b) LKB1f/f and LKB1ΔIEC mice were orally treated with vehicle or 100 mg/kg retinyl palmitate (Vit A) for 16 h. (a) Quantities of retinol and RAs, including atRA, 9-cis RA (9cRA), and 13-cis RA (13cRA), were measured in ileum tissues using LC-MS/MS (n = 5 / group). (b) Gene expression of FGF15 in the ileum and CYP7a1 in the liver was measured (n = 5–6 / group). Data are representative of two independent experiments. Data are represented as mean ± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test. *p < 0.05; **p < 0.01 compared with the control mice of the same treatment group. #p < 0.05; ##p < 0.01 compared with the vehicle of the same genotype.
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Figure 29. LKB1ΔIEC mice expressed a lower level of genes related to RA biosynthesis. (a) mRNA expression levels of enzymes associated with retinol metabolism and Rarb, a gene positively regulated by RA, in the SI organoids were measured by qPCR (n = 5–6 / group). (b) SI organoids from LKB1f/f and LKB1ΔIEC mice were treated with DMSO, retinol, 9cRA, or atRA for 3 days. Fgf15 expression was measured by qPCR (n = 7 / group). Data are representative of two independent experiments. Data are represented as mean ± SEM.
Statistical analyses were conducted using Student’s t-test and one-way ANOVA with Tukey’s post-hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01 compared with the control mice of the same treatment group
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7. 고지방식이를 투여한 LKB1ΔIEC 마우스에서 당내성이 개선되고, 에너지 소비가 증가하였다.
담즙산은 콜레스테롤로부터 합성되고 지질 흡수를 촉진시키기 때문에 (Staels and Fonseca, 2009), FXR, FGF15/19, CYP7a1 의 변이는 혈중 지질을 바꾼다 (Li et al., 2011; Xu et al., 2016; Zhang et al., 2017). LKB1ΔIEC 마우스에서 순환하는 담즙산의 양이 증가했음에도 (그림 12), LKB1f/f 마우스와 LKB1ΔIEC 마우스의 혈청 내 free fatty acids (FFA), triglyceride (TG), total cholesterol (TC)의 양과 대변의 FFA 양에는 차이가 없었다 (그림 30a,b).
올리브 오일을 투여한 후에도 혈청과 소장의 TG 양에 차이가 없었으며 (그림 30c), 이는 식후 지방 흡수에는 LKB1 이 관여하지 않음을 나타낸다. 이전 연구들은 장내 FXR 신호가 전신 대사에 관여할 수 있다고 보고하였는데 (Fang et al., 2015; Li et al., 2013), 이와 같은 사실을 확인하기 위해 장의 LKB1 을 결손시켰을 때 숙주의 대사에 어떤 영향을 미치는지 알아보았다. LKB1f/f 마우스와 LKB1ΔIEC 마우스에 고지방식이를 투여하였을 때, 몸무게 변화와 식이 섭취량은 유사하였으나 (그림 31a,b), 고지방식이를 섭취한 LKB1ΔIEC 마우스에서 소장의 담즙산 pool 과 총 담즙산 pool 이 증가하였다 (그림 32a). 또한 고지방식이를 섭취한 LKB1ΔIEC 마우스는 LKB1f/f 마우스와 대비하여 소장에서 FGF15 의 발현이 감소하였고, 간에서 CYP7a1 의 발현이 증가하였다 (그림 32b).
고지방식이를 섭취한 LKB1ΔIEC 마우스에서 BSH 생성 박테리아가 감소하는 경향을 보였다 (그림 33). 고지방식이 LKB1ΔIEC 마우스는 당내성 검사 (GTT)에서 LKB1f/f 마우스보다 더 빠르게 체내 혈당을 조절하였으나, 인슐린 민감성 (ITT)은 유사하였다 (그림 34). 대사 분석을 통하여 명 주기 (light cycle)에는 고지방식이를 한 LKB1ΔIEC 마우스에서 에너지, 산소 및 이산화탄소 소비량이 증가하였으며, 이는 LKB1ΔIEC 마우스에서 휴식 대사량이 증가하였음을 보여준다.
하지만 암 주기 (dark cycle)에는 LKB1f/f 마우스와 차이가 없는 것을 확인하였다 (그림 35a-c). 종합적으로, 장의 LKB1 결손은 고지방식이로 인해 유발된 당 내성을 개선시키고 에너지 소비를 증가시킨다.
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Figure 30. Lipid profiles were not affected by intestinal LKB1 deletion. (a) Serum levels of free fatty acids, triglyceride, and total cholesterol were assessed in 8 weeks of mice using colorimetric assay kits (n = 4–6 / group). (b) Levels of free fatty acids in feces were measured (n = 5 / group). (c) Triglyceride concentrations in the SI and serum were measured at 4 h after oral gavage of olive oil (10 μl / g of body weight) (n = 3 / group). Data are represented as mean
± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test.
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Figure 31. Comparison of body weight and food intake between LKB1f/f and LKB1ΔIEC which fed a high-fat diet. (a) Body weights of LKB1f/f (n = 9) and LKB1ΔIEC (n = 11) mice fed a high-fat diet (HFD) for 6 weeks. (b) Daily food intake for HFD-fed LKB1f/f (n = 5) and LKB1ΔIEC (n = 7) mice during Weeks 1 to 6. Data are representative of two independent experiments and represented as mean ± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test and two-way ANOVA with Bonferroni’s post-hoc test.
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Figure 32. Bile acid pool size and FXR target gene expression were retained in LKB1ΔIEC mice under high-fat diet conditions. (a) BA concentration in the liver, GB, SI, and total pool (liver + GB + SI) (n = 4 / group). (b) mRNA expression levels in the SI ileum (left) and liver (right) (n = 3–4 / group). Data are representative of two independent experiments and represented as mean ± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test. *p <
0.05; **p < 0.01.
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Figure 33. LKB1ΔIEC mice on a high-fat diet reduced BSH-producing bacteria in the cecum. Quantification of BSH-producing bacteria 16s rDNA gene copies in the cecal contents by qPCR (n = 8–11 / group). Data are representative of two independent experiments and represented as mean ± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test. *p <
0.05; **p < 0.01.
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Figure 34. LKB1ΔIEC mice on a high-fat diet exhibited improved glucose intolerance.
Glucose tolerance test (GTT) and insulin tolerance test (ITT) were performed on mice fed an HFD for 6 and 8 weeks, respectively (n = 8 / group). Data are representative of two independent experiments and represented as mean ± SEM. Statistical analyses were conducted using two-way ANOVA with Bonferroni’s post-hoc test. *p < 0.05; **p < 0.01.
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Figure 35. LKB1ΔIEC mice on a high-fat diet exhibited improved increased energy expenditure. (a and b) Energy expenditure, and (c) O2 consumption and CO2 production rate were measured by the comprehensive laboratory animal monitoring system (CLAMS) after 7 weeks of HFD feeding. Bar graphs indicate the average value during the light and dark cycle (n = 7–8 / group). Data are representative of two independent experiments and represented as mean ± SEM. Statistical analyses were conducted using Student’s t-test and two-way ANOVA with Bonferroni’s post-hoc test. *p < 0.05.
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고찰
본 연구에서 장 상피세포에서 LKB1 이 결손 되었을 때, FGF15/19 의 생성이 감소되었고 그 결과 간에서 CYP7a1 의 발현과 담즙산 pool 이 증가되었다. LKB1 의 결손은 FXR 과 관계없이 직접적으로 FGF15/19 의 분비를 감소시켰다. LKB1ΔIEC 마우스에서 FGF15/19 가 감소한 것은 BSH 생성 박테리아의 감소, T-MCA 의 증가, 레티놀 대사 장애에 의해 나타난 것으로 생각된다. 이를 통하여, 장 상피 세포의 LKB1 signaling 은 담즙산 대사를 통하여 숙주의 항상성을 유지하는데 필수적일 것으로 사료된다.
장 상피세포의 LKB1 은 분비 계열 세포의 분화와 성숙에 영향을 미친다. 최근 발표된 연구에서 LKB1 이 결손되면, pyruvate dehydrogenase kinase 4 가 증가되고 이는 분비 계열 세포 형성에 필수적인 Atoh1 의 발현을 증가시킨다고 보고되었다 (Gao et al., 2020). 본 연구에서 Atoh1 의 하위 유전자인 Gfi1 와 Spdef 의 발현이 증가하는 것을 확인하였는데, 이 유전자는 직접적으로 파네스 세포와 술잔세포 같은 분비계열의 세포로 분화하는 데 영향을 주는 것으로 알려져 있다 (Gregorieff et al., 2009; Shroyer et al., 2005). 장관 전층 (whole intestinal tract)에서 술잔세포의 과형성이 관찰되었고, 장 크립트의 파네스 세포에서는 세포의 크기 증가와 더불어 mucin 을 함유하는 형태학적 이상이 관찰되었다.
이전 연구에 따르면, 이러한 세포를 ‘intermediate’ 술잔, 파네스 세포라고 하였고 (Jackson et al., 2020; Shorning et al., 2009), Spdef 의 과발현은 직접적으로 술잔/파네스 세포의 전구 세포를 술잔 세포로 분화하게끔 유도하고 파네스 세포의 감소를 유발한다고 보고되었다 (Noah et al., 2010). 이를 통해 LKB1ΔIEC 마우스에서의 분비계열 세포의 비 정상적인 형태를 설명할 수 있다.
본 연구에서 우선적으로 LKB1ΔIEC 마우스에서의 담즙산 대사에 초점을 맞추었는데, 이는 SIRT1 과 AMPK 가 각각 LKB1 의 상위, 하위 단계에 존재하며, 장에 존재하는 SIRT1 과 AMPK 가 담즙산의 항상성을 조절한다는 것이 기존에 보고 되어있기 때문이다 (Kazgan et al., 2014; Lien et al., 2014). 장의 SIRT1 을 결손 시킨 마우스는 담즙산 합성과 CYP7a1 의 발현이 증가되어 있고, 담즙산
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pool 크기는 변하지 않았으나 대변으로 배출되는 담즙산의 양은 증가되어 있다 (Kazgan et al., 2014). 저자들은 장에서 SIRT1 결손이 hepatocyte nuclear factor-1 (HNF-1) 신호 전달 경로를 손상시키고 FXR, Asbt 와 같은 하위 유전자의 발현을 감소시킨다고 보고하였다 (Kazgan et al., 2014). 본 연구를 통해 LKB1 결손이 이러한 유전자의 발현에는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였으며, 이는 LKB1 이 HNF-1 신호 전달 경로에 영향을 미치지 않는 것을 의미한다. LKB1ΔIEC 마우스에서 담즙산 pool 이 증가하였지만, 대변으로 배출되는 담즙산의 양은 변하지 않았다. 이러한 결과는 GF 마우스에서 담즙산 pool 이 증가하였으나, 대변으로 배출되는 담즙산의 양이 감소하였다는 이전 연구 결과와 일치한다 (Sayin et al., 2013). 또한 마우스에 BSH 활성을 갖는 프로바이오틱스 (probiotics)를 투여하였을 때, 담즙산 배출량이 증가되었다고 보고되었다 (Degirolamo et al., 2014). 따라서, LKB1ΔIEC 마우스에서 대변으로 배출되는 담즙산 양의 변화 없이 소장에서 담즙산 pool 이 증가한 것은 회장 말단의 Asbt 에 의해 재흡수되는 결합 담즙산이 증가되었기 때문이라고 추정된다 (Chiang, 2013).
In vitro 실험에서 LKB1 의 발현을 억제하였을 때, FXR 에 비의존적으로 FGF15/19 의 단백질 발현이 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 이전 연구에서 공초점 현미경을 이용한 면역 형광법과 면역 침강법 (co-immunoprecipitation)을 통해 Diet1 이 FGF15/19 단백질과 직접적으로
상호작용하는 것을 확인하였고, 이는 Diet1 이 FXR 과 관계없이
posttranslational modification 을 통해 단백질 수준에서 FGF15/19 의 양을 조절한다는 것을 증명하였다 (Vergnes et al., 2013). 그러므로, LKB1 또한 posttranslational modification 을 통해 FGF15/19 의 양을 조절할 수 있을 것으로 추정한다.
In vivo 에서 FXR 타겟 유전자가 크게 감소하였는데, 이는 간접적으로 FGF15/19 의 발현을 저해하는 다른 요소들이 있음을 시사한다. 이러한 결과는 LKB1ΔIEC 마우스 소장의 T-MCA 가 증가하여 FXR 의 활성화를 억제한 것으로 추측된다. LKB1ΔIEC 마우스에서 BSH 생성 박테리아의 감소, 미생물의 다양성 (microbial diversity)과 군집 (community) 변화를 유발하였고, 이는 코하우징
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하였음에도 개선되지 않았다. 이러한 특정 박테리아의 과증식과 변화된 조성은 LKB1ΔIEC 마우스의 특징적인 장내 환경 (defensin, mucin, bile acid)에 기인한 것으로 생각한다 (Menendez et al., 2010; Ridlon et al., 2014; Wu et al., 2018). 예를 들어, 높은 농도의 CA 와 DCA 는 막의 완전성 (membrane integrity)을 교란시킴으로 Bifidobacterium과 Lactobacillus의 성장을 저해한다고 알려져 있다 (Kurdi et al., 2006). 따라서, LKB1ΔIEC 마우스 소장에서 증가된 CA 와 DCA 가 이러한 박테리아의 abundance 를 감소시켰을 것으로 생각된다.
장 상피세포의 LKB1 의 결손은 불완전한 레티놀 대사를 유발하였으며, 또한 RXR 을 통해서 FXR 의 하위 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다는 것을 확인하였다. LKB1ΔIEC 마우스에 비타민 A 를 처리하였을 때 9cRA 와 FGF15 가 감소된 것은 LKB1 이 결손됨으로써, 비타민 A 에서 생물학적 활성을 갖는 대사물질 (i.e., RA)로 합성되는 과정이 저해되었다는 것을 의미한다. 이처럼 LKB1 이 레티놀 대사를 조절하는 역할을 한다는 것은 본 연구를 통해 처음 규명되었다. 이전 연구의 DEG 기반 전사체 분석 (transcriptome analysis)을 통해 LKB1 결손 유무에 따라 RXR 매개 신호 전달 경로 관련 유전자들이 유의적으로 변화되어 있는 것을 확인하였다 (Gan et al., 2010). 본 실험에서 레티노산에 의해 활성화되는 RXR 매개 경로에 대한 LKB1 의 잠재적인 기능을 규명하였다.
최근 연구에서, 고지방식이를 투여한 AMPK ΔIEC 마우스와 대조군 마우스의 당 내성, 에너지 소비를 비교하였을 때 차이가 없는 것을 확인하였다 (Olivier et al., 2021). 따라서, LKB1ΔIEC 마우스에서 대사 개선이 나타난 것은 AMPK 와 관련이 없을 것이라고 추측된다. 최근 논문에서 FXR signaling, 담즙산 pool 크기가 대사 변화 (metabolic change)에 영향을 줄 수 있다고 보고되었다. FXR agonist 를 처리한 마우스는 고지방식이로 유도된 비만에 더 취약하며, 담즙산 pool 크기와 에너지소비가 감소된 것을 확인하였다 (Watanabe et al., 2011).
반면, 마우스에 intestinal FXR inhibitor 를 처리한 마우스와 CYP7a1 을 과 발현시킨 transgenic 마우스에서는 담즙산 pool 과 에너지 소비가 증가하였으며, 고지방식이로 유도한 비만에 저항성을 갖는 것을 확인하였다 (Jiang et al., 2015; Li et al., 2010). 따라서 LKB1ΔIEC 마우스의 대사 개선 효과는 담즙산
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pool 의 증가에서 기인한 것으로 생각한다. 그러나 담즙산 pool 크기가 증가했음에도 불구하고 8 주간 고지방식이를 먹였을 때, LKB1f/f 마우스와 비교하여 체중에서는 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 LKB1 이 에너지 대사를 조절하기 때문에 담즙산 이외에 다른 요인이 LKB1ΔIEC 마우스의 비만을 유발하는데 영향을 미쳤을 것으로 생각된다.
본 연구를 통해 장내 LKB1 이 FGF15/19 signaling 을 통해서 담즙산 합성과 항상성을 조절한다는 것을 규명하였다. 또한, LKB1 이 레티노산 대사를 조절하는 역할을 할 수 있을 것으로 사료된다. LKB1, AMPK, SIRT1 은 대사 장애와 관련 있는 유전자이며, 이후 연구를 통해 담즙산 항상성을 유지하기 위한 상호작용에 대해 더 규명해야 할 것이다.
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결론
본 연구를 통해 장내 LKB1 이 FGF15/19 signaling 을 통해서 담즙산 합성과 항상성을 조절한다는 것을 규명하였다. LKB1 결손이 FXR 에 비의존적으로 FGF15/19 의 분비를 직접 감소시켰다. BSH 생성 박테리아의 감소로 인하여
T-MCA 의 증가된 것과 레티놀 대사 장애로 인한 FGF15/19 의 생성이 저해된 것을 확인하였다. LKB1, AMPK, SIRT1 은 대사 장애와 관련 있는 잠재성 높은 후보 유전자이기 때문에 이후 연구를 통해 담즙산 항상성을 유지하기 위한 기전 규명의 필요성이 높다고 할 수 있다.
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