Caspase-3 의 활성은 기존 보고에 기술 (Park et al., 2009)되었듯이 caspase-3 의 비색기질 (colorimetric substrate)인 Ac-DEVD-p-NA (Biomol, Plymouth meeting, PA)가 효소촉매 작용으로 분해되어 나오는 조각을 이용하여 측정하였다.
BSO+Glutamate 에 노출된 ssdRGC-5 세포를 차가운 phosphate buffered saline (PBS)에 한차례 세척한 뒤 1 시간동안 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, 0.32 M Sucrose, 10 mM DTT, 5 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 1 mM PMSF, 1 mg/ml aprotinin, 10 mM leupeptin)에서 처리하여 lysate 를 추출하였다. 추출한 lysate 를 4°C, 10,000×g 로 원심분리하여 얻은 200 mg cytosolic extract (protein)를 reaction buffer (100 mM HEPES, pH 7.5, 10% sucrose, 0.1% CHAPS, 10 mM DTT, 10 mM leupeptin)에 녹인 후 200 mM Ac-DEVD-p-NA 가 포함된 용액 100ml 로 만들었다. 이 표본을 2 시간 동안 37 °C 에서 배양한 후 405nm microtiter plate reader (Molecular Devices, Palo Aldo, CA)를 이용하여 효소 촉매작용으로 방출되는 p-nitroamilide 를 시간대별로 분석하였다.
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-G. 세포내 활성산소 측정세포내 활성산소의 양은 비형광색소인 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA, Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 이용하여 형광정량법으로 측정하였다 (Park et al., 2009). 비형광색소인 DCF-DA 는 세포내로 쉽게 침투하여 세포내 활성산소와 상호반응하여 형광색소인 2′,7′-dichlorofluorescein 으로 가수분해되고 이를 이용하여 세포내 활성산소양을 정량한다.
10 mM 의 DCF-DA 와 20% Pluronic F-127 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 BSO+Glutamate 에 노출된 ssdRGC-5 세포와 함께 30 분간 배양하고 다시 HEPES controlled salt solution (HCSS buffer)로 세척하였다. 세척 후 fluorescence microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 시간대별로 촬영하고 DCF-DA 의 정도를 AxioVision™ image analysis software program 을 이용하여 정량화하였다.
H. 통계적 분석
모든 데이터는 mean ± SEM 으로 적어도 3 회 이상 동일 실험을 반복하여 표시하였고 비교는 Student’s t tests 를 이용하여 p-value <0.05 를 유의한 것으로 보았다.
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Ⅲ 결 과
A. ssdRGC-5 세포에서 포도씨추출물에 의한 세포독성
포도씨추출물이 가진 ssdRGC-5 세포에 대한 세포자멸사나 세포괴사 유발유무를 확인하기 위해 포도씨추출물을 1 nM 에서 100 mM 까지 농도를 10 배씩 증가시켜 준비한 뒤 RGC-5 세포를 staurosporine 으로 처리하여 ssdRGC-5 세포로 분화시키고 24 시간 동안 각 농도의 포도씨추출물에 노출시킨 후 FITC-Annexin V and PI analysis 를 통해 분석한 결과 그림 1A 에서 보이는 것처럼 포도씨추출물 농도에 따라 Annexin-V (+) 염색세포의 수가 증가하는 소견을 보이고 특히 100 mg/ml 농도에서는 Annexin-V (+) 염색세포의 수가 206.3±34.7%로 대조군 (100%)에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였다. 그림 1B 에서 보면 Annexin-V (-)/PI (+) 염색세포의 수도 농도에 따라 증가하여 100 mg/ml 농도에서는 Annexin-V (-)/PI (+) 염색세포의 수가 173.1±24.7%로 대조군에 비해 통계적으로 유의한 증가를 보였다.
Annexin-V (+) 염색세포는 세포자멸사의 결과이며 Annexin-V (-)/PI (+) 염색은 세포괴사의 결과임을 고려할 때 1 mg/ml 이하 농도의 포도씨추출물은 세포자멸사나 세포괴사를 유발하지 않지만 10 mg/ml 이상의 농도에서는 세포자멸사와 세포괴사를 모두 유발하는 것을 확인할 수 있었고 10 mg/ml 이상의 농도에서는 포도씨추출물의 독성이 나타난다는 사실을 알 수 있었다.
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Fig. 1. Toxicity of high concentration GSE in ssdRGC-5 cells. (GSE: grape seed extract, CTL: control) ssdRGC-5 cells were incubated with GSE (0.1 ~ 100 mg/ml) for 24 h and the cell death was observed in FACS. The percentage of the different population is indicated.
Quantitative percentages of Annexin-V (+) cells (A) or Annexin-V (-)/ PI (+) cells (B). The data represent the mean ± SEM values from at least three independent experiments. *p<0.05 vs. control (CTL)
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B. ssdRGC-5 세포에서 BSO+Glutamate 에 의한 세포사멸에대한 포도씨추출물 의 효과
그림 2A 에서 보이는 바와 같이 RGC-5 세포를 staurosporine 으로 처리하여 신경돌기를 가진 신경세포와 유사한 세포로 분화되는 것을 확인하였다. 이렇게 얻은 ssdRGC-5 세포에 BSO+glutamate 로 산화스트레스를 유발하면 그림 2A 와 2B 에서 보이는 바와 같이 EthD-1 양성 세포 (적색, 죽은 세포)의 수 (22.4 ± 1.1%) 가 대조군 (9.6 ± 1.2%)에 비해 유의하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
BSO+Glutamate 처리 전 포도씨추출물 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1000 ng/ml 을 각각 첨가하여 배양한 후 BSO+Glutamate 에 의한 산화스트레스를 유발하면 포도씨추출물을 주지 않은 군에 비해 죽은 세포의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 포도씨추출물 100 ng/ml 의 농도에서 최고의 효과 (15.1 ± 1.7%)를 보였고 이런 포도씨추출물의 보호효과는 trolox 100 mM 과 DEVD-fmk 1 mM 의 효과 (15.4 ± 2.5%, 14.4 ± 1.2%)와 유사한 정도 임을 확인 할 수 있었다 (그림 2B).
BSO+Glutamate 에 의한 세포사멸을 FITC-Annexin V and PI analysis 를 이용하여 분석한 결과 그림 2C 와 2D 에서 보이듯이 Annexin-V (+) 염색세포의 비율이 대조군에 비해 최고 1.7 배까지 유의하게 증가하였고 반면 Annexin-V (-)/PI (+) 염색세포는 유의한 증가를 보이지 않아 BSO+Glutamate 에 의한 세포사멸은 세포괴사 (necrosis)보다는 세포자멸사 (apoptosis)에 주로 관련된다는 것을 확인하였다.
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Fig. 2. Effect of GSE on BSO+Glutamate induced cell death in ssdRGC-5 cells. (BSO:
buthionine sulfoximine, CTL: control, GSE: grape seed extract) ssdRGC-5 cells were incubated with or without GSE (10 ~ 1,000 ng/ml) for 2 h prior to addition of 0.5 mM BSO plus 5 mM glutamate, and incubated for 24 h. Trolox (100 mM) or DEVD-fmk (1 mM) was used for comparison of the protective potency. (A) Live and dead cells were stained with calcein-AM (green; arrow) and EthD-1 (red; arrow head), respectively. Scale bar, 25 μm.
(B) The number of dead cells was counted and the percentage of total cells was analyzed.
Percentages of apoptotic cells (Annexin-V (+)) (C) and necrotic cells (Annexin-V (-) / PI (+)) (D) were analyzed. *p<0.05 vs. untreated control (CTL), #p<0.05 vs. BSO+Glutamate only without GSE pre-treatment
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C. ssdRGC-5 세포에서 BSO+Glutamate 에 의한 caspase-3 활성화에대한 포도씨추출물의 효과
포도씨추출물의 세포보호효과의 기전을 알아보기 위해 산화 스트레스에 의한 세포자멸사의 기전 중 하나로 알려져 있는 caspase-3 활성화와 포도씨추출물의 활성억제를 분석하였다. Caspase-3 활성화는 효소 촉매작용으로 방출되는 p-nitroamilide 로부터 분석되었고 BSO+Glutamate 처리 후 시간대별로 caspase-3 활성화를 측정해본 결과 20 시간에 최고 (180.6 ± 4.6%)에 도달하였다 (그림 3A). 그래서, 포도씨추출물의 효과를 평가하기 위한 다음 실험 동안 BSO+Glutamate 노출 시간을 20 시간으로 고정하였다.
그림 3B 에서 보면 BSO+Glutamate 에 의한 caspase-3 의 활성화 (175.2 ± 6.1%) 가 대조군 (100%)에 비해 증가된 모습을 보였고 이때 포도씨추출물 100 ng/ml 과 1000 ng/ml 전처치의 경우는 각각 128.1 ± 6.8% 와 130.9 ± 2.5%로 caspase-3 활성화를 유의하게 억제시켰다. caspase-3 활성화 억제에서 포도씨추출물은 100 mM trolox (133.8 ± 4.6%) 와 비슷한 정도의 효과를 보였고
DEVD-fmk 1 mM 이 가장 강력한 caspase-3 활성억제 효과 (82.1 ± 6.5%)를 보였다.
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cells were incubated for 2h in the presence or absence of GSE (10 ~ 1,000 ng/ml), trolox (100 mM) and DEVD-fmk (1 mM) as described in Fig. 2, and exposed to 0.5 mM BSO plus 5 mM glutamate for 20 h. (A) The time course of caspase-3 activity during exposure to BSO+glutamate (~ 24 h). (B) Percentage of caspase-3 activity was analyzed compared to the control. Data represent the mean ± SEM values from at least 5 independent experiments.*p<0.05 vs. untreated control (CTL), #p<0.05 vs. BSO+Glutamate only without GSE pre-treatment
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D. ssdRGC-5 세포에서 BSO+Glutamate 에 의한 세포내 활성산소 축적에대한 포도씨추출물의 효과
포도씨추출물의 세포보호효과의 기전을 알아보기 위해 산화 스트레스에 서 생기는 활성산소의 양을 측정하기 위해 그림 4A 에서와 같이 DCF-DA 형광색소를 이용하면 세포내 활성산소가 관찰되었고 이를 시간대별로 측정하면 BSO+Glutamate 노출 20 시간 후에 세포내 활성산소 축적이 대조군과 비교하여 최고 2.7 배까지 증가함을 확인하였다 (그림 4B). 따라서 caspase-3 활성억제와
마찬가지로 포도씨추출물의 효과를 평가하기 위한 다음 실험 동안
BSO+Glutamate 노출시간을 20 시간으로 고정하였다.
그림 4C 에서 보듯이 BSO+Glutamate 에 의한 세포내 활성산소 축적 (272.1 ± 26.1%)은 포도씨추출물의 농도에 비례하여 저하되고 최고치는 1000 ng/ml 농도 포도씨추출물에서 나타났다 (178 ± 24.8%). 이는 100 mM trolox 에 의한 효과 (181.7
± 17.8%) 와 유사하였다.
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DCF-DA intensity (% of control) DCF-DA intensity (% of control)
A
B C
Fig. 4. Effect of GSE on BSO+Glutamate induced ROS accumulation in ssdRGC-5 cells.
(BSO: buthionine sulfoximine, CTL: control, GSE: grape seed extract, DCF-DA:
dichloloflurescein diacetate) ssdRGC-5 cells were incubated with or without GSE (10 ~ 1,000 ng/ml) and trolox (100 mM) for 2 h, as described in Fig. 2, and exposed to 0.5mM BSO plus 5mM Glutamate were added to the media and incubated for 20 h. (A) The amount of intracellular ROS was evaluated using fluorescent dye DCF-DA (green). Scale bar, 25 μm.
(B) The time course of DCF-DA intensity during exposure to BSO+Glutamate (~ 24 h). (C) Intensity of DCF was quantified. Data represent the mean ± SEM values from at least 4 experiments. *p<0.05 vs. untreated control (CTL), #p<0.05 vs. BSO+Glutamate only without GSE pre-treatment
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Ⅳ 고 찰
녹내장은 만성적이고 진행성인 망막신경절세포 사멸, 특징적인 시야감소, 시신경유두의 전형적인 변화를 특징으로 하는 질환이다. 망막신경절세포에는 에너지생산에 관여하는 풍부한 마이토콘드리아를 가지고 있고 여기서 생산된 에너지를 이용하여 신경 신호의 전달과 신경계를 유지한다. 하지만 녹내장성 변화가 시작되면 마이토콘드리아의 기능이 저하되고 정상상태에서는 충분히 감당할 수 있는 빛, glutamate, nitric oxide, prostaglandins 과 같은 외부자극에 의해서 쉽게 손상될 수 있는 상태가 되어 외부자극이 지속되면 세포자멸사가 진행된다고 한다 (Osborne, 2010) .
근래 여러 연구들을 통해서 산화스트레스가 세포자멸사에 흔한 매개체로서 역할을 한다고 알려지고 있다. 세포자멸사 과정에서 일어나는 기본적인 단계로서 몇 가지 생화학적인 변화가 있는데 마이토콘드리아의 막전위 상실과 caspase 활성화가 여기에 속한다. 본 연구에서도 산화스트레스를 이용하여 세포자멸사를 유발하고자 하였고 Annexin-V (+) 세포의 비율이 대조군에 비해 유의하게 증가하면서 Annexin-V (-)/PI (+) 세포는 유의한 증가를 보이지 않아 BSO+
Glutamate 에 의한 신경세포사는 세포괴사보다는 세포자멸사임을 확인할 수 있었다 (그림 2C, 그림 2D).
Glutamate 는 중추신경계에서 기본적인 신경흥분전달물질의 하나이지만 glutamate-gated membrane channel 이 과하게 활성화될 경우 중추신경계 신경세포에 심각한 손상을 줄 수 있다. 망막신경절세포에도 이런 glutamate-gated membrane channel 이 있어서 세포실험이나 동물실험에서 glutamate 에 의한 흥분세포독성이
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것을 확인할 수 있었다 (그림 3). 이는 이전의 연구 결과와 다른 점이며 staurosporine 분화가 여러가지 신경세포의 특성을 회복시켜 주는 것과 같이 세포자멸사에서도 RGC-5 세포의 특성을 일부 변화시켰을 가능성이 있음을 의미한다.
신경보호약물을 이용한 녹내장의 진행을 막고 시력을 보호하려는 치료는 현재도 활발히 연구되고 있는 분야이며 주로 혈류 개선이나 항산화약물이 중심이 되고 있다. 이런 약물들 중 본 연구에서는 포도씨추출물이 ssdRGC-5 세포에서 BSO 와 glutamate 혼합물에 의해 유발된 산화스트레스에서 caspase-3 활성을 억제하고 활성산소를 감소시키며 산화스트레스에 의한 세포자멸사에 저항하여 ssdRGC-5 세포를 보호한다는 것을 확인하였다. 이는 포도씨추출물이 녹내장환자의 치료에서 새로운 약제가 될 수 있는 가능성을 보인 것이고 새로운 약제의 좋은 후보군이 될 수 있음 보여준다고 할 수 있다. 향후 포도씨
신경보호약물을 이용한 녹내장의 진행을 막고 시력을 보호하려는 치료는 현재도 활발히 연구되고 있는 분야이며 주로 혈류 개선이나 항산화약물이 중심이 되고 있다. 이런 약물들 중 본 연구에서는 포도씨추출물이 ssdRGC-5 세포에서 BSO 와 glutamate 혼합물에 의해 유발된 산화스트레스에서 caspase-3 활성을 억제하고 활성산소를 감소시키며 산화스트레스에 의한 세포자멸사에 저항하여 ssdRGC-5 세포를 보호한다는 것을 확인하였다. 이는 포도씨추출물이 녹내장환자의 치료에서 새로운 약제가 될 수 있는 가능성을 보인 것이고 새로운 약제의 좋은 후보군이 될 수 있음 보여준다고 할 수 있다. 향후 포도씨